一、抗体工程研究进程及在控制病毒感染中的作用（论文文献综述）
梁慧刚,黄翠,向小薇,张永丽,陈新文[1]（2020）在《新发病毒性传染病疫苗研发态势》文中研究表明该文综述了新发病毒性传染病疫苗研发态势,包括克里米亚-刚果出血热疫苗、埃博拉病毒病和马尔堡病毒病疫苗、拉沙热疫苗、中东呼吸综合征和严重急性呼吸综合征疫苗、尼帕病毒病和亨尼帕病毒病疫苗、裂谷热疫苗、寨卡病毒病疫苗、新型冠状病毒肺炎疫苗等。针对我国在控制新发病毒性传染病方面存在的高致病性病毒资源储备、检测技术、监测与预警能力建设、疫苗的研发、药物筛选等不足,提出了完善实验室平台建设,加强对病原体传播、变异规律和致病机制基础研究,加强技术创新体系建设,加强人才培养和国际合作等相关对策建议。
韩广伟[2]（2020）在《两种弱毒疫苗对新发PRRSV-2的效力评价与PRRSV-2 NSP1β突变疫苗株、阻断单抗研制》文中认为猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的全球性的猪传染性疾病。该病在1996年首次在中国报道,首个PRRSV分离株命名为CH-1a。2006年,中国出现了以NSP2蛋白不连续缺失30个氨基酸为特征的高致病毒株,命名为HP-PRRSV,该类型毒株给我国养猪业造成了巨大的损失。为了防控该病,多个弱毒疫苗被研制出来,VR2332-MLV、R98、JXA1-R、HuN4-F112、GDr180、TJM-F92和CH-1R弱毒疫苗株均为亲本株在Marc-145细胞上连续传代致弱而来。2006年以来,随着弱毒疫苗的广泛使用,HP-PRRS得到了有效的控制。然而,随着NADC30-like毒株于2013年在国内被报道,该病毒的流行情况变得复杂起来。1.新发PRRSV-2的基因组特征、细胞复制特性和致病力分析为了解2016年以来中国PRRSV的流行情况,本研究于2016年至2018年自中国中部和东部采集了 136份疑似感染PRRS V的组织样本,其中42份经RT-PCR证实为PRRSV-2阳性。ORF5和ORF6的系统进化分析结果显示:阳性样本中谱系8占比为18.38%,与QYYZ株密切相关的3个分离毒株属于新发的谱系3,其它3个分离株属于以NADC30为代表的谱系1。本研究中,4株PRRSV-2:JS18-3、ZJnb16-2、SDbz16-2、HNXX16被成功分离并进行了全基因组测序。基于全基因组进化分析结果显示:JS18-3属于与CH-1a亲缘关系更近的经典谱系8,ZJnb16-2属于与HP-PRRSV亲缘关系更近的谱系8,SDbz16-2、HNXX16属于谱系1。重组结果分析显示:ZJnb16-2是来源于谱系8（JXA1-like）和谱系3（QYYZ-like）的重组病毒,SDbz16-2是来源于谱系 1（NADC30-like）和谱系8（JXA1-like）的重组病毒,JS18-3是来自谱系8、1和3的三重重组病毒（CH-1a-like、NADC30-like、GDsg-like）,HXXX16无重组信号。细胞嗜性结果显示:ZJnb16-2、SDbz16-2、HNXX16均无法在Marc-145细胞上复制,而JS18-3在Marc-145细胞和PAMs上均可复制。其中,JS18-3基因组上4871-6635片段与HP-PRRSV代表毒株JXA1在核苷酸序列上具有99.3%的最高同一性,表明其正在向HP-PRRSV 进化。与CH-1a-like毒株JX07相比,JS18-3在Marc-145细胞和PAMs中复制速率显着增强并可导致更加严重的细胞病变效应。动物致病性实验结果表明:相比SDbz16-2,ZJnb16-2具有相对较强的致病力,JS18-3毒株的致病力明显强于经典8系病毒CH-1a,3株病毒均可引发仔猪出现持续性发热、呼吸困难、严重的肺部病变和淋巴结充血。本研究证实,新发谱系1和谱系3 PRRSV-2极易与其它谱系发生重组现象,重组导致出现新的致病性PRRSV-2,从而逃避常规疫苗引起的保护性免疫,亟待更新疫苗毒株和开发PRRSV-2通用疫苗。2.两种弱毒疫苗对ZJnb16-2株的临床保护效果及对新发PRRSV-2效力评价ZJnb16-2为新发的具有谱系3 PRRSV-2基因特征的重组病毒,本研究评价了 HuN4-F112和VR2332 MLV两种代表性弱毒疫苗对ZJnb16-2株的临床保护效果。疫苗免疫后血清病毒滴度测定结果显示:两种疫苗免疫猪只后7天、14天、21天都在血清中检测到疫苗病毒的存在。攻毒保护结果显示:与VR2332 MLV/ZJnb16-2和Mock/ZJnb16-2 组相比,HuN4-F112/ZJnb16-2免疫组猪只高热体温反应持续时间较短、平均日增重较高,临床症状较轻。在攻毒后21天,两种疫苗可减轻仔猪的病毒血症。但是,接种疫苗的猪只均出现不同程度的肺脏、淋巴结病变,微观病理变化可观察到肺部有大量炎性细胞浸润、支气管上皮细胞脱落。综上,VR2332 MLV和HuN4-F112均不能充分保护猪只抵御ZJnb16-2的感染。另外,弱毒疫苗免疫后在临床环境的持续存在也大大增加了疫苗株与流行毒株基因重组的概率,从而出现毒力返强问题。本研究从中和抗体和细胞免疫交叉反应性评价了当前弱毒疫苗对上述新发PRRSV-2的整体效力。首先,经7次免疫历时270天制备了针对PRRSV-2 HuN4-F112（谱系8）和JK-100（谱系5）的高中和效价血清,中和效价在1:16-1:64之间。PAMs上中和实验结果表明针对HuN4-F112和JK-100的中和血清均无法有效中和ZJnb16-2、SDbz16-2。JS18-3可以在Marc-145细胞上复制,利用针对HuN4-F112的4份中和血清评价对JS18-3的交叉反应,结果显示血清对JS18-3的中和效价仅为1:6-1:8。这些结果表明疫苗免疫后产生的中和抗体仅可中和亲缘关系较近的毒株,而对于新发的谱系1和3 PRRSV-2不具有交叉反应性。ELISPOT结果显示:在疫苗免疫仔猪后的21、28天血液中可检测到针对HuN4-F112、VR2332 MLV、ZJnb16-2、JS18-3、HNXX16的IFN-γ分泌细胞,数量有不同程度的差异（20-100个IFN-γ分泌细胞/106个PBMC）,这也证实了免疫疫苗后产生的细胞免疫对于当前国内的不同谱系PRRSV-2存在一定交叉反应性。由此可见,疫苗免疫后滞后且微弱的适应性免疫反应是弱毒疫苗交叉保护效力不足的重要原因。3.NSP1β点突变和NSP1随机突变的HuN4-F112疫苗株病毒拯救Ⅰ型干扰素对调节适应性免疫反应至关重要。然而,当前弱毒疫苗仍然可以抑制Ⅰ型干扰素的产生,这对疫苗病毒在宿主体内的存活具有巨大的益处,因此开发一种干扰素抑制功能减弱或者消除并且能够激发干扰素反应的疫苗将有助于改善其交叉保护效力。NSP1β是PRRSV重要的干扰素拮抗蛋白,其121-135位氨基酸与天然免疫抑制功能密切相关,因此我们选择NSP1β作为研究目标。首先以疫苗株HuN4-F112为模板,构建了该疫苗株的感染性克隆,转染Marc-145细胞后成功拯救出子代病毒。然后,基于HuN4-F112的感染性克隆,分别构建RR128129AA、KR124128AA、L126A、L135A 四种 NSP1β 蛋白编码区域的突变质粒,并成功拯救病毒。突变株在Marc-145细胞和PAMs细胞的生长特性表明:突变株在Marc-145的生长特性与亲本毒株无明显差异,然而,vRR128129AA、vKR124128AA突变株在接种PAMs后生长缓慢直至48 h被清除,而亲本株HuN4-F112、vL126A、vL135A随着时间的推移病毒复制逐渐增强。qPCR结果表明:vRR128129AA、vKR124128AA 突变株感染 PAMs 24 h 后,可引起 IFN-α、IFN-β和ISG15基因的上调表达。可见,突变的引入使得疫苗株病毒快速被PAMs清除,呈现一过性感染特征,并减弱了其天然免疫抑制功能同时激发了一定的天然免疫反应。综上,vRR128129AA、vKR124128AA突变株免疫后可能存在的毒力返强问题得到有效解决,激发的干扰素反应将有效调节适应性反应,未来可以作为PRRS防控新型候选疫苗株。为探究NSP1蛋白上多个干扰素敏感位点,本研究首先采用易错PCR方法成功扩增出NSP1编码基因,测序结果显示:每个克隆均含有6-8个不同位置的点突变。随后成功构建含NSP1随机突变基因的HuN4-F 112感染性克隆,阳性质粒中突变质粒占比为20%。将构建成功的部分重组质粒转染Marc-145细胞后成功拯救NSP1蛋白随机突变病毒,这为后续给予突变病毒干扰素压力后利用高通量测序技术来发现PRRSV NSP1上多个干扰素敏感位点打下坚实基础,也为PRRSV干扰素敏感疫苗株的研制提供了 一种新方法。4.PRRSV-2感染PAMs阻断单抗制备不同谱系PRRSV-2在感染靶细胞时所利用的受体是不变的,因此针对受体蛋白的单抗理论上可以阻断多个谱系病毒的入侵。pCD163是PRRSV感染PAMs的核心受体。本研究中,成功构建了 pFAST-HTB-pCD163-SRCR5-9重组杆粒,转染sf9细胞后,pCD163-SRCR5-9蛋白分泌表达于培养上清中。体外病毒结合试验结果显示,表达的pCD163-SRCR5-9蛋白可以与ZJnb17-1、HNXX16毒株结合,从而阻断病毒与PAMs表面受体的结合。表达的pCD163-SRCR5-9蛋白免疫小鼠后的血清经检测能够封闭PAMs表面PRRSV-2感染关键位点从而阻断病毒的感染。利用传统单克隆抗体技术结合IFA的方法筛选出12株针对该蛋白的单克隆抗体,其中单克隆抗体8H2和4H7对于来源于多谱系的PRRSV-2感染PAMs具有阻断作用,平均可使感染病毒的滴度下降100-1000倍,病毒拷贝数下降约104。表位鉴定结果显示,8H2、4H7单抗识别的部位分别位于pCD163蛋白的PSTI和SRCR6区域,识别的表位位于1-15位和1-30位氨基酸。研制的广谱阻断单抗可应用于临床中具有较高经济价值的感染母猪治疗。此外,PRRSV-2感染PAMs关键区域的鉴定,拓展了基因编辑技术在抗PRRS猪培育方面的应用。
杨帆[3]（2020）在《抗H7N9禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及初步应用》文中研究指明2013年,我国首次报道新型H7N9禽流感病毒（H7N9病毒）感染人类,并造成大量死亡病例。抗H7N9病毒药物有限,对其开展快速检测和抗病毒药物研究迫在眉睫,本文开展以下三部分研究:第一部分,抗H7N9病毒血凝素（HA）蛋白单克隆抗体（单抗）制备。以H7N9病毒疫苗（A/ZJU01/PR8/2013）免疫BALB/c小鼠,通过ELISA筛选获得6株单抗,其中4株（1H10、2D5、2A9和2C6）属于Ig G1亚型,2株（2D1和2F5）Ig G2a亚型。通过ELISA检测分析显示均与HA蛋白具有强亲和力,其中2D1的效价达2×10-4ug/m L。免疫荧光实验表明所有单抗与其他亚型流感病毒无交叉反应,具有较好特异性。第二部分,H7N9病毒胶体金试纸条和ELISA试剂盒研制。基于抗体特性和配对实验,单抗2D5和2F5分别作为捕获抗体和检测抗体,组装了胶体金试纸条和ELISA试剂盒,两种方法检测H7N9病毒（A/Zhejiang/DTID-ZJU01/2013）的灵敏度分别为21和2-2HAU/100u L。对检测H7N9病毒特异性好,具有潜在应用价值。第三部分,单抗对感染H7N9病毒小鼠的预防和治疗作用。用5倍半数致死剂量的高致病性H7N9病毒感染小鼠,再以10mg/kg剂量的抗体治疗,单抗1H10和2D1分别通过中和作用和抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用,对小鼠能起到了有效保护作用。提示这两株单抗对高致病性H7N9病毒具有保护作用。综上所述,本研究得到以下结论:（1）本研究获得6株单抗,均能特异性识别H7N9病毒,具有较好亲和力。（2）利用单抗2D5和2F5,组装了检测H7N9病毒的胶体金试纸条和ELISA试剂盒,为H7N9疫情防控提供技术支持。（3）单抗1H10和2D1具有显着的预防和治疗效果,具有潜在的应用前景。
李菲[4]（2019）在《结核分枝杆菌抗原致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究暨烯醇化酶-1单克隆抗体制备与作用初步研究》文中研究指明结核分枝杆菌感染机体后主要激活CD4+T细胞和CD8+T细胞,CD4+T细胞分化为Th1型细胞,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子,激活巨噬细胞等细胞免疫应答,CD8+T细胞分化为CTL细胞直接杀伤靶细胞,发挥清除结核分枝杆菌的作用。然而耐药结核、痰菌阳性的纤维空洞型肺结核等重症结核病患者体内结核分枝杆菌长期慢性感染会导致机体免疫功能低下。我们实验室前期应用结核分枝杆菌抗原持续刺激模拟临床结核分枝杆菌持续感染的状态,发现结核分枝杆菌抗原持续刺激会导致T细胞耗竭,表现为T细胞受特异性抗原刺激后增殖能力下降、产生细胞因子IFN-γ和IL-2减少。在该结核分枝杆菌抗原持续刺激致T细胞耗竭的动物模型上,进一步对T细胞耗竭进行治疗研究,发现给予IL-2干预可逆转其耗竭状态。在上述研究基础上,我们进而拟研究抗原持续刺激导致T细胞耗竭过程中骨髓造血功能的变化。维持骨髓造血干细胞（HSC）及前体细胞稳态是机体维持正常造血功能及建立有效抗结核免疫应答的基础。骨髓HSC的分化增殖受GM-CSF、IL-2、IFN-γ等细胞因子的调节。研究发现淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）等病毒及细菌感染过程中,细胞因子IFN-γ持续分泌,可引起造血功能障碍。重症结核病出现免疫耗竭及骨髓造血功能障碍的研究较少,相关机制尚不清楚。目的:我们推测结核分枝杆菌抗原持续刺激情况下,刺激产生的细胞因子持续作用于骨髓,造成骨髓HSC及造血前体细胞功能异常。本实验继续应用前期我们实验室建立的结核分枝杆菌抗原持续刺激引起T细胞耗竭的动物模型,研究结核分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血功能的影响。方法:为了研究结核分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血及T细胞免疫功能的影响,本课题应用结核分枝杆菌抗原持续刺激小鼠,观察结核分枝杆菌抗原持续刺激过程中骨髓造血细胞增殖能力的变化,并分析与造血细胞分化相关转录因子表达水平的改变,评价结核抗原刺激诱导的免疫应答对骨髓造血功能的影响。在此基础上进一步研究IL-2治疗对骨髓造血功能的影响。（1）抗原刺激及IL-2治疗程序。考虑到生物安全等因素,本课题应用结核分枝杆菌抗原持续刺激模拟临床结核分枝杆菌持续感染对免疫系统和骨髓造血功能的影响。本研究首先用卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin,BCG）免疫C57BL/6小鼠,然后用结核分枝杆菌抗原ESAT-6、CFP-10联合融合蛋白Mtb10.4-HspX（MH）与佐剂DDA和Poly（I:C）持续刺激,每周一次,反复皮下注射。抗原反复刺激12周后检测到骨髓造血细胞（Lin-c-Kit+,LK细胞）增殖能力降低,抗原刺激22次后检测到明显的T细胞功能障碍。采用IL-2对T细胞及骨髓造血细胞增殖分化异常的小鼠进行干预治疗,研究IL-2治疗后骨髓造血细胞增殖及分化能力的改变。研究中,我们设立蛋白抗原强化免疫2次作为抗原短暂刺激组对照。同时设立佐剂对照组排除佐剂对T细胞及造血细胞功能的影响。（2）T细胞功能分析。通过流式细胞术、细胞因子胞内染色法检测脾脏CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ的水平;应用MHC Ⅰ类分子-抗原表位肽五聚体染色技术检测TB 10.4 4-12特异性的记忆性CD8+T细胞的数量。（3）骨髓造血细胞的功能分析。无菌分离骨髓细胞,应用EdU增殖试验检测造血细胞的增殖能力;用ELISA方法检测骨髓造血微环境中IFN-γ和IL-2的水平;磁珠分选造血细胞,并应用实时荧光定量RT-PCR检测造血细胞分化相关转录因子Batf2、IRF8、GATA2和NOTCH1的表达水平,分析抗原刺激对造血细胞分化的影响。（4）IL-2对骨髓造血细胞的治疗作用及机制分析。IL-2干预后,检测上述指标的变化,分析IL-2的治疗效果及机制。结果:（1）结核分枝杆菌抗原持续刺激对T细胞功能的影响。应用结核分枝杆菌蛋白抗原持续刺激小鼠,对细胞因子的检测发现,与抗原短暂刺激组相比,抗原持续刺激12周时,脾脏CD4+T细胞受特异性抗原刺激分泌较高水平的IFN-γ（p<0.05）,但IFN-γ在持续抗原刺激22周后下降;应用MHC抗原表位肽五聚体技术检测发现持续抗原刺激12～22周,脾脏中TB10.4 4-12特异性记忆性CD8+T细胞的数量相比抗原短暂刺激组明显减少（p<0.01）。（2）结核分枝杆菌抗原持续刺激对造血细胞功能的影响。应用结核分枝杆菌蛋白抗原持续刺激小鼠,抗原持续刺激12周时,骨髓造血微环境中IFN-γ的水平明显升高（p<0.05）,但IFN-γ在抗原持续刺激后期下降。EdU增殖试验表明,与抗原短暂刺激组相比,抗原持续刺激12周及22周后LK细胞的增殖能力降低（p<0.05）。骨髓c-Kit+的细胞群中转录因子的表达水平与佐剂对照组相比也发生了明显变化:决定髓系分化的转录因子Batf2和IRF8表达上调,而促进淋巴系细胞分化的转录因子NOTCH1表达下调。（3）IL-2的治疗作用。在给予小鼠结核分枝杆菌蛋白抗原持续刺激的同时,我们应用IL-2进行干预治疗。结果发现,IL-2干预后,骨髓造血微环境中IL-2的水平升高。相比抗原持续刺激组,IL-2处理可下调Batf2和IRF8的表达,上调GATA2和NOTCH1的表达,LK细胞的增殖能力回升（p<0.05）。同时,T细胞耗竭也得到逆转:CD4+T细胞分泌IFN-γ的水平升高（p<0.05）,脾脏TB10.4 4-12特异性记忆性CD8+T细胞的数量显着增加（p<0.05）。（4）JAK3-STAT5信号通路的研究。JAK3-STAT5信号转导通路对造血细胞分化增殖起调控作用。相比佐剂组,抗原持续刺激组中JAK3和STAT5 mRNA表达水平较低。IL-2治疗后,JAK3和STAT5表达明显增强。结论:结核分枝杆菌抗原刺激诱导IFN-γ分泌为主的Th1型免疫应答。结核分枝杆菌抗原持续刺激诱导IFN-γ水平在一定时间内增高造成骨髓LK细胞增殖能力降低,并上调髓系分化相关的转录因子Batf2和IRF8的表达;补充IL-2可增强LK细胞的增殖能力,上调淋巴系分化相关转录因子GATA2、NOTCH1的表达,维持骨髓造血的稳态。此外,IL-2上调JAK3和STAT5的表达,推测IL-2也通过上调JAK3-STAT5途径分子表达调节造血细胞的增殖分化。因此,结核分枝杆菌抗原持续刺激会影响造血作用,导致造血细胞增殖能力降低,髓系分化相关的转录因子表达增高,而IL-2治疗可维持骨髓造血的稳态。本实验首次研究了结核分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血细胞发育分化的影响,揭示了结核分枝杆菌持续感染状态下结核病患者免疫功能低下的机制及骨髓造血功能的改变,为进一步研究重症肺结核的精准诊治提供了思路。粟粒性肺结核是由于大量结核分枝杆菌在短时间内进入血液循环所引起的急性全身血行播散型结核病。其病情急且凶险、病死率较高。粟粒性肺结核患者由于体内结核分枝杆菌大量感染会导致机体造血功能障碍和免疫功能低下,但相关机制尚不清楚。目的:我们推测粟粒性肺结核是由大量结核分枝杆菌入血后,诱发T细胞过强的免疫反应,产生的细胞因子进一步作用于骨髓造血细胞,影响骨髓造血细胞的发育分化,淋巴细胞生成减少,最终引起机体免疫功能降低。为验证上述假设,本实验应用卡介苗（BCG）入血感染模拟临床粟粒性肺结核感染的免疫病理变化,研究其对骨髓造血系统和免疫系统的影响。方法:首先,调取临床粟粒性肺结核患者的病例资料,分析研究粟粒性肺结核临床病例外周血血细胞数量变化,研究骨髓造血功能的变化特点;其次,应用不同剂量BCG经尾静脉注射或滴鼻的方式感染小鼠,观察T细胞功能和骨髓造血功能的变化,并分析与造血细胞分化相关转录因子表达水平的改变,评价BCG感染对骨髓造血功能的影响和免疫应答特点,建立应用BCG感染模拟粟粒性结核造血功能受损的动物模型。（1）临床病例资料分析。分析2015年至2019年兰州市肺科医院收治入院的肺结核病例28,047例,其中粟粒性肺结核病例共118例。通过回顾性分析,研究粟粒性肺结核患者外周血血细胞数量变化。（2）BCG感染及IL-2治疗程序。根据文献报道及考虑到生物安全等因素,本课题应用大剂量BCG替代结核分枝杆菌感染小鼠来模拟临床粟粒性肺结核感染,首先用大剂量BCG（5×107 CFU/ml）分别以尾静脉注射和滴鼻的方式感染小鼠,分别于感染后3周、5周和8周,检测外周血血细胞数量、T细胞功能和骨髓造血细胞（LK细胞）增殖分化能力。研究中,设立低剂量BCG（5×105 CFU/ml）滴鼻感染小鼠作为对照,同时设PBS对照组排除外界因素和年龄对T细胞和骨髓造血细胞功能的影响。（3）外周血细胞数量、血清IFN-γ的水平和脏器指数的变化。将新鲜采集的小鼠血液加入抗凝管中,通过动物血液分析仪检测不同组血细胞数量的变化。未抗凝的外周血凝固后离心收集血清,用ELISA检测血清中IFN-γ的水平;通过称量脾脏、肝脏、肺脏及小鼠重量,观察BCG感染对脾脏指数、肝脏指数和肺脏指数的影响。（4）T细胞功能分析。通过ELISA检测脾脏淋巴细胞受BCG蛋白纯化衍生物（PPD）刺激后分泌IFN-γ和IL-2的水平;应用流式细胞术检测脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞表面表达抑制性受体PD-1的水平;应用EdU增殖试验检测脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞受PPD刺激后的增殖能力。（5）骨髓造血细胞的功能分析。无菌分离骨髓细胞并对其进行磁珠分选,得到LK细胞,用EdU增殖试验检测LK细胞的增殖能力;用ELISA的方法检测骨髓造血微环境中IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6和GM-CSF的水平;提取LK细胞的总RNA,并应用实时荧光定量RT-PCR检测LK细胞中转录因子Batf2、IRF8、GATA2和NOTCH1的表达水平,分析BC G感染对LK细胞分化的影响。（6）IL-2治疗作用分析。在大剂量BCG入血感染后,应用IL-2对发生T细胞耗竭及骨髓造血细胞增殖分化异常的小鼠进行干预治疗。IL-2干预后,检测上述指标的变化,分析IL-2的治疗效果及机制。结果:（1）临床病例资料分析。我们回顾性分析了 2015年至2019年兰州市肺科医院收治的结核病病例28,047例,其中粟粒性肺结核病例共118例。根据患者外周血血细胞检测结果分析患者各类血细胞变化,发现118例粟粒性肺结核患者中89%发生淋巴细胞减少（105例）、23%发生白细胞减少（27例）、8.5%发生中性粒细胞减少（10例）、49.2%发生血红蛋白减少（58例）、11%发生红细胞减少（13例）、8.5%发生血小板减少（10例）、全血细胞减少6例,占4.2%。以上数据表明粟粒性肺结核常继发淋巴细胞减少,其次可继发白细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少等各类血细胞减少症。（2）BCG感染对外周血血细胞数量和脏器指数的影响。在BCG感染后5周,与PBS组相比,大剂量BCG尾静脉注射组小鼠外周血白细胞、淋巴细胞和血小板减少,小鼠脾脏指数、肝脏指数和肺脏指数明显升高,提示脾脏、肝脏和肺脏明显肿大。（3）BCG感染对T细胞功能的影响。在BCG感染后3周、5周和8周,与PBS组、低剂量BCG滴鼻组和高剂量BCG滴鼻组相比,高剂量BCG尾静脉注射组脾脏CD8+T细胞明显高表达抑制性受体PD-1（p<0.05）。EdU增殖试验表明:低剂量BCG滴鼻组脾脏CD8+T细胞增殖能力明显强于其他组;相对于PBS组、低剂量BCG滴鼻组和高剂量BCG滴鼻组,高剂量BCG尾静脉注射组脾脏CD8+T细胞的增殖能力明显降低（p<0.05）。ELISA检测脾脏淋巴细胞受特异性抗原PPD刺激分泌IFN-γ和IL-2的水平,结果如下:在3-5周时高剂量BCG尾静脉注射组较低剂量BCG滴鼻组及PBS组产生较高水平的IFN-γ（p<0.05）,8周后产生IFN-γ的能力明显降低;在感染3-5周低剂量BCG感染组产生IL-2的水平高于PBS组和高剂量BCG尾静脉注射组（p<0.05）。（4）BCG感染对骨髓造血细胞功能的影响。在BCG感染后3周,高剂量BCG尾静脉注射组LK细胞增殖能力明显高于PBS组（p<0.01）,随后逐渐降低。骨髓上清液中细胞因子的变化如下:在BCG感染后5周,相比PBS组,高剂量BCG尾静脉注射组产生较高水平的IFN-γ和TNF-α（p<0.05）,IL-2、IL-6和GM-CSF的水平无明显变化,但低剂量BCG滴鼻组IL-2、IL-6和GM-CSF明显增高（p<0.05）。高剂量BCG尾静脉注射组骨髓LK细胞群中转录因子的表达水平与PBS对照组相比也发生了明显变化:髓系分化相关的转录因子Batf2和IRF8表达上调,而淋巴系分化相关的转录因子GATA2和NOTCH1表达下调。（5）IL-2的治疗作用。在大剂量BCG入血感染小鼠后,用IL-2进行干预治疗。结果发现,IL-2干预后,T细胞耗竭得以逆转。结论:回顾性分析临床粟粒性肺结核患者的病例资料,结果发现粟粒性肺结核患者会出现淋巴细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少等造血功能受损表现,和文献报道一致。应用小鼠模型研究发现,大剂量BCG入血感染可致外周血淋巴细胞和血小板减少,诱导骨髓造血微环境中细胞因子IFN-γ和TNF-α的水平增高,导致骨髓LK细胞增殖能力降低,并上调髓系分化相关的转录因子Batf2和IRF8的表达,下调淋巴系分化相关转录因子GATA2和NOTCH1的表达,最终导致T细胞耗竭。补充IL-2后T细胞耗竭有所逆转。本研究结合临床病例资料和动物实验研究,从骨髓造血细胞发育分化的角度揭示粟粒性肺结核免疫功能低下的机制及骨髓造血功能的改变,为粟粒性肺结核防治提供了参考。T细胞发育分化过程需要糖酵解和氧化磷酸化提供能量,尤其是效应T细胞的糖酵解代谢更为活跃。上一章研究我们发现大剂量BCG入血感染会使T细胞过度活化,导致T细胞耗竭的发生。我们推测抑制糖酵解,减轻T细胞的活化,有可能阻断T细胞耗竭的发生。糖酵解也是肿瘤代谢的重要特征。我们实验室前期通过蛋白质组学筛选到宫颈癌组织高表达糖酵解酶烯醇化酶1（ENO1）。用ShRNA干扰沉默ENO1基因的表达可明显降低宫颈癌Hela和SiHa细胞的成瘤能力及侵袭转移能力,说明抑制ENO1表达可以阻断糖酵解,从而起到治疗肿瘤的作用。目的:虽然应用shRNA干扰ENO1表达可抑制肿瘤生长,但RNA干扰技术受到病毒载体和运输系统的限制。为了促进临床应用,本课题拟制备ENO1的单克隆抗体,进一步研究其抗肿瘤作用。此外,前两章的研究发现结核分枝杆菌抗原持续刺激和大剂量BCG入血感染会导致T细胞功能低下甚至耗竭,如何扭转耗竭对于结核病防治有重要意义。细胞代谢变化可决定T细胞功能,因而细胞代谢被认为是T细胞功能和分化的关键调节因子。本研究制备ENO1的单克隆抗体,后期将进一步通过干预T细胞代谢,研究治疗T细胞耗竭的新方法和策略。方法:本课题拟用真核表达系统表达ENO1蛋白,纯化ENO1蛋白,制备ENO1单克隆抗体。预期ENO1的单克隆抗体通过干扰肿瘤细胞表面ENO1可以降低肿瘤细胞迁移侵袭能力。我们筛选有较强抗宫颈癌SiHa细胞迁移侵袭能力的ENO1单克隆抗体。对编码ENO1单克隆抗体的基因进行测序,将其可变区基因序列重组构建在腺相关病毒上。后续我们将对腺相关病毒表达抗体可变区蛋白多肽的功能进行鉴定,对ENO1单克隆抗体对糖酵解的抑制作用展开深入研究。（1）ENO1的克隆、表达和纯化方案一:以pET30a-ENO1质粒为模板,将ENO1基因克隆入真核表达载体pcDNA中,构建重组质粒pcDNA3.1-ENO1,并将pcDNA3.1-ENO1以瞬时转染的方式成功转入人胚肾细胞（HEK-293T细胞）中,表达出ENO1蛋白,并用Ni-NTA介质进行纯化。方案二:将pcDNA3.1-ENO1以稳定转染的方式成功转染入中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1细胞）中,表达和纯化ENO1蛋白。方案三:将ENO1基因克隆入杆状病毒表达载体pFastBac1中,转入昆虫细胞Sf9中,表达和纯化ENO1蛋白。（2）ENO1单克隆抗体的制备。用ENO1蛋白反复免疫BALB/c小鼠,取出抗体滴度较高的小鼠脾脏细胞,与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。对阳性杂交瘤细胞进行反复筛选,获得效价较高的杂交瘤细胞株,诱导腹水产生,纯化得到ENO1单克隆抗体。（3）ENO1单克隆抗体的抗肿瘤作用评价。采用细胞划痕实验和Transwell小室实验检测五个ENO1单克隆抗体对宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭能力的影响,筛选出效果最佳的ENO1单克隆抗体。（4）ENO1单克隆抗体可变区基因测序。分别提取五株杂交瘤细胞的RNA,通过RT-PCR获得相应的cDNA。基于抗体重链和轻链恒定区的已知序列设计3’-末端基因特异性引物,联合5’-末端的通用引物用于cDNA基因的PCR扩增,通过对扩增产物进行测序,获得ENO1单克隆抗体重链和轻链可变区基因序列。（5）腺相关病毒包装ENO1抗体的可变区基因。选择对宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力有明显抑制效果的ENO1单克隆抗体H1的轻链和重链可变区基因,中间用Linker--（GGGGS）3连接,克隆在pAAV-MCS载体上,由公司合成,简称rAAV-H1。对AAV辅助病毒系统中的pHelper、pAAV-RC和rAAV-H1菌液进行复苏、保种和扩增,并大量抽提质粒,将其转染入AAV-293细胞中,观察其转染效率、收集病毒并进行滴度测定。同时,将带有绿色荧光蛋白的pAAV-IRES-ZsGreen1转入AAV293细胞中,作为空载体对照（rAAV-GFP）。结果:（1）ENO1蛋白表达与纯化。首先将pcDNA3.1-ENO1以瞬时转染的方式成功转染入HEK-293T细胞中,表达纯化ENO1蛋白,但蛋白得率太低;将pcDNA3.1-ENO1以稳定转染的方式成功转染入CHO-K1细胞中,表达纯化目的蛋白,同样蛋白得率太低;最后将ENO1基因克隆入pFastBac1中,转入Sf9细胞中,蛋白表达量高,纯化出高纯度的ENO1蛋白。（2）ENO1单克隆抗体制备。ENO1蛋白免疫小鼠后,通过杂交瘤技术成功筛选到5株效价较高的阳性杂交瘤细胞株,纯化获得相应的单克隆抗体。（3）ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移、侵袭作用的影响。应用细胞划痕实验和Transwell小室实验,初步评价5个ENO1单克隆抗体的抗肿瘤细胞迁移、侵袭作用。检测结果示五个ENO1单克隆抗体对宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭能力均有抑制作用,其中H1的抑制作用最强。（4）ENO1单克隆抗体可变区基因测序。在得到单克隆抗体的基础上,利用通用引物从杂交瘤细胞的RNA钓取抗体的重链和轻链可变区基因,对获得的抗体可变区基因进行测序,成功获得可变区基因序列。（5）腺相关病毒包装ENO1抗体的可变区基因。将得到的ENO1抗体重链和轻链可变区基因构建在腺相关病毒载体上,得到rAAV-H1。大量抽提得到浓度较高的pHelper、pAAV-RC和rAAV-H1质粒,将其转染入AAV293细胞中,结果示转染成功,且转染效率达到90%。结论:应用杆状病毒表达载体,成功表达和纯化出高纯度的ENO1蛋白;应用ENO1蛋白免疫小鼠,通过杂交瘤技术成功制备和筛选到5个高效价的ENO1单克隆抗体;通过ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力的抑制作用评价,筛选出有明显抑制效果的ENO1单克隆抗体H1;成功获得ENO1单克隆抗体的可变区基因序列。将ENO1抗体的可变区基因重组到腺相关病毒载体上,得到rAAV-H1。ENO1单克隆抗体的制备和相关研究为下一步研究ENO1单克隆抗体抑制糖酵解抗肿瘤和T细胞耗竭作用奠定了基础。
罗勇[5]（2019）在《肿瘤靶向性新型溶瘤单纯疱疹病毒的理性设计及其抗肿瘤作用机制研究》文中研究说明近年来,随着全球老龄化趋势加剧、人口的剧增、社会生活环境的改变等因素使得全球癌症的发病率和死亡率呈快速上升的趋势,全球癌症负担进一步加重。据2018年全球癌症流行病学统计数据显示,2018年全球癌症新发病例高达1810万,死亡病例高达960万。因此,对癌症的早诊、早治和综合干预已成为现阶段全球在癌症防控领域的重要任务。传统的癌症治疗手段,如化疗和放疗等存在副作用大、无法有效控制晚期恶性肿瘤的进展和不能有效改善难治性和广泛转移性癌症患者的生存期和生活质量等问题,因而无法从根本上控制癌症进展。肿瘤分子靶向治疗在肺癌、白血病和黑色素瘤等适应症的部分患者上取得了较大的成功,但分子靶向治疗药物仅对特定基因突变的肿瘤发挥作用而使得获益人群受限,且易产生耐药等问题,导致长期治疗效果不理想,同时由于副作用较大而限制了其临床应用。以 PD-1/PD-L1（Programmed Death 1/Programmed Death-Ligand 1）抑制剂疗法为代表的癌症免疫疗法因其具有良好的安全性和显着的肿瘤治疗效果,已成为当前肿瘤治疗领域最有希望攻克癌症的治疗方式。与传统的癌症治疗手段相比,癌症免疫疗法最突出的优势是疗效较持久,但其疗效受肿瘤微环境中PD-L1表达水平、肿瘤突变负荷、免疫细胞浸润水平、微卫星不稳定性的高低等多重因素影响,导致其对所有肿瘤的客观应答率仅为20%-30%,仍有大部分的肿瘤患者无法从免疫治疗中获益。因此,仍亟需开发新型高效的治疗手段使更多的肿瘤患者能获益。溶瘤病毒疗法是一种利用具有天然溶瘤活性的或经基因工程修饰的病毒选择性地在肿瘤细胞中高效复制并快速裂解肿瘤细胞,且释放的肿瘤相关抗原和损伤相关分子模式等“原位肿瘤疫苗”可有效的启动并活化抗肿瘤疫应答的新型肿瘤免疫治疗的方法。溶瘤病毒疗法相较于其他的肿瘤治疗方法,具有肿瘤选择性复制与杀伤、安全高效、广谱抗肿瘤活性和免疫调节等突出优势,现已成为极具前景的一类肿瘤免疫疗法。临床前基础研究和临床研究结果均表明通过溶瘤病毒局部注射可增加肿瘤组织中免疫细胞的浸润,将“冷”肿瘤转变为“热肿瘤”,协同增加PD-1/PD-L1抑制剂的抗肿瘤疗效。基于溶瘤病毒ImLygic TM的良好抗肿瘤特性,2015年美国FDA首次批准溶瘤病毒药物ImLygicTM（T-VEC）用于局部治疗首次手术切除后复发的恶性黑色素瘤。2018年《新英格兰医学》杂志发表了美国杜克大学开发的脊髓灰质炎溶瘤病毒PVSRIPO在复发性胶质瘤适应症上的I期临床试验结果显示,PVSRIPO治疗晚期胶质母细胞瘤患者的3年存活率为标准治疗的5倍（21%vs.4%）。围绕溶瘤病毒的药物开发和多药联合治疗是目前肿瘤免疫疗法领域内十分具有前景的研究方向之一。本研究是在野生型人I型单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus type I,HSV-1）KOS株的基础上通过分子遗传学改造而获得的具有肿瘤靶向性的溶瘤病毒OVH,并系统性的完成溶瘤病毒OVH的实验室安全性和药效学研究,并对其治疗机制进行了初步探索。本研究的第一部分旨在理性设计和重组筛选肿瘤靶向性新型溶瘤病毒OVH,并在多种细胞模型上评估OVH的肿瘤选择性和在多种小鼠模型上分别评估OVH的神经毒性和急性毒性。利用同源重组技术在KOS毒株基础上删除病毒主要神经毒力基因γ34.5（编码ICP34.5蛋白）和主要参与激活病毒β和γ基因表达,平衡病毒的潜伏性感染和裂解性感染及诱导病毒免疫逃逸的基因RL2（编码ICP0蛋白）,同时用hTERT启动子调控编码病毒立即早期蛋白ICP27的UL54基因表达,通过差异筛选最终获得具有极低的神经毒性和良好的肿瘤选择性的重组病毒OVH。体内外安全性评价结果均表明OVH相较于野生型病毒KOS、ICP0缺陷病毒dICP0、ICP0和ICP34.5双缺陷病毒OVN具有较好的肿瘤细胞选择性复制与杀伤的特性、显着降低的神经毒性和急性毒性。以上结果提示OVH具有进一步开发为溶瘤病毒药物的潜力,为探索应用低毒高效的溶瘤病毒治疗肿瘤奠定了基础。本研究的第二部分主要为溶瘤病毒OVH体内和体外溶瘤活性评估及机制研究,旨在明确溶瘤病毒OVH的体外溶瘤活性及探明其作用机制。本研究首先在53株人源肿瘤细胞上评估了 OVH的杀伤效果,其中40株肿瘤细胞对OVH超级敏感（将感染复数MOI（MultiplicityofInfection）=1时,OVH对肿瘤细胞的杀伤率超过50%定义为超级敏感型细胞,Hyper-sensitive（HS））,8株细胞株为敏感性细胞株(将感染复数MOI=1时,OVH对肿瘤细胞的杀伤率超过20%但小于50%,定义为敏感型细胞,Sensitive（S）,5株肿瘤细胞株为抵制型细胞株（将感染复数MOI=1时,OVH对肿瘤细胞的杀伤率小于20%,定义为抵制型细胞,Refractory（R））。此外,我们从临床手术切除的肿瘤标本中分离培养获得原代肝癌细胞、原代胶质瘤细胞和原代卵巢癌细胞。三株原代肿瘤细胞均为对OVH超级敏感型细胞。以上体外肿瘤细胞杀伤实验结果表明,OVH具有广谱的体外抗肿瘤活性。我们研究发现OVH感染肿瘤细胞后会诱导细胞凋亡并引起免疫原性细胞死亡（ATP和HMGB1胞外释放增加、钙网蛋白膜转位等）,提示OVH通过裂解肿瘤细胞可能会产生“原位肿瘤疫苗”,从而诱导系统性的抗肿瘤免疫应答。体内药效学结果显示,OVH瘤内注射治疗能显着抑制免疫缺陷鼠上7种人源肿瘤细胞移植瘤的生长和免疫健全小鼠上3种鼠源肿瘤细胞移植瘤的生长。在免疫系统健全的小鼠皮下移植瘤治疗模型中,OVH单侧治疗可以显着抑制甚至大部分的清除治疗侧和远端侧的肿瘤。以上体内药效学研究结果表明,溶瘤病毒OVH具有显着的体内溶瘤活性,且瘤内注射OVH能诱导全身性的抗肿瘤免疫反应抑制治疗侧和远端侧肿瘤的生长。我们进一步的研究发现,经OVH治愈的荷瘤小鼠未出现肿瘤复发,并可以有效防止相同肿瘤细胞的二次攻击。蛋白免疫印迹分析显示经OVH治愈的荷瘤小鼠的多抗血清与相同肿瘤细胞来源的细胞裂解液之间存在特异性反应,将这部分血清回输到接种了相同肿瘤细胞的荷瘤鼠上发现多抗血清具有良好的抑瘤效果,而特异性去除多抗的血清则没有治疗效果。上述结果显示,经过OVH治愈的小鼠体内产生了肿瘤特异性抗体。通过对治疗侧和远端侧肿瘤组织中的免疫细胞亚群分析发现,OVH的治疗可显着增加治疗侧和远端侧肿瘤组织中免疫细胞的浸润,包括上调和活化肿瘤组织中的CD8+T细胞,下调调节性T细胞的浸润水平等。体内抗体急性阻断免疫细胞的实验结果显示,OVH治疗的疗效主要依赖于CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫,B细胞、NK细胞和巨噬细胞等其他免疫细胞发挥了一定的抗肿瘤作用。联合PD-1抗体能进一步的提高溶瘤病毒OVH的抗肿瘤疗效,且该联合治疗的疗效也是主要依赖于CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。综上所述,本研究设计的溶瘤病毒OVH为γ34.5和RL2双基因缺失,同时用hTERT启动子调控编码病毒立即早期蛋白ICP27的UL54基因表达,具有良好的肿瘤选择性和安全性的溶瘤病毒。OVH体外对肿瘤细胞具有广谱的溶瘤活性,在多种小鼠肿瘤模型中均可显着抑制甚至清除小鼠治疗侧和远端侧皮下肿瘤。瘤内注射溶瘤病毒OVH治疗可重编程肿瘤免疫微环境,激活机体的抗肿瘤体液免疫应答和细胞免疫应答,宿主抗肿瘤免疫应答与溶瘤病毒介导的直接抗肿瘤作用相互协同,最终达到溶瘤治疗和免疫治疗叠加的双重抗肿瘤效果。更重要的是,我们发现联合PD-1抗体治疗能进一步的提高溶瘤病毒OVH的抗肿瘤效果。本研究开发的肿瘤靶向性新型溶瘤病毒OVH具有安全性、高效、广谱的抗肿瘤活性,为开发可用于恶性肿瘤治疗的溶瘤病毒创新药物奠定了基础。
孔德生[6]（2018）在《多价双特异性抗体介导的ADCC清除HIV-1潜伏感染细胞及HIV-1感染者血浆ADCC作用的研究》文中研究说明研究目的和意义HIV-1可以以原病毒cDNA的形式整合至宿主基因组中形成病毒储存库,储存库中的病毒基因表达处于沉默状态,潜伏感染的病毒和细胞不能被HAART和免疫系统清除,因此一旦停止HAART治疗短时间就会造成病毒的反弹。HIV-1储存库的存在已成为彻底治愈HIV-1的主要障碍。“功能性治愈”（Functional cure）是基于对HIV-1“完全治愈”（Sterilizingcure）的难度的而提出的概念,即在停止抗逆转录病毒治疗后,体内病毒能控制在检测限以下并且CD4+T细胞的数量和功能维持正常,临床无免疫缺陷和疾病进展的表现。通过使用逆转录病毒激活剂（Latency Reversing Agents,LRAs）激活潜伏感染的 HIV-1 储存库（“Shock”）;然后通过宿主免疫反应和/或细胞毒性药物清除HIV-1潜伏感染细胞（“Kill”）的激活和杀灭策略则是目前研究最为广泛的一种功能性治愈策略。广谱中和抗体（bNAbs）不仅可以有效的中和游离的病毒粒子还可以通过其Fc片段介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）杀伤HIV-1感染的细胞。在对bNAbs以及Env靶蛋白的研究基础上通过基因工程手段制备的双特异性甚至三特异性广谱中和抗体表现出更优秀的抗病毒特性。前期我们的合作者美国国家癌症研究所构建了一种基于可溶性CD4单结构域（mD1.22）和靶向共受体结合位点抗体结构域（m36.4）的去岩藻糖基化的多价双特异抗体（LSEVh-LS-F）。尽管我们的中美合作项目的合作者---美国国家癌症研究所已报道了 LSEVh-LS-F的中和作用和ADCC效应。然而,HIV-1是高度变异的病毒,LSEVh-LS-F对我国临床分离株的中和能力还需要进一步的研究,特别是能否依靠其ADCC效应清除激活的潜伏感染细胞仍未报道。为此,本课题系统分析了 LSEVh-LS-F的中和宽度和广度并着重分析了 LSEVh-LS-F对我国临床分离株的中和能力;LSEVh-LS-F对稳定表达膜Env蛋白的细胞系以及HIV-1感染细胞的ADCC效应并重点研究了 LSEVh-LS-F与LRAs的联合应用对HIV-1潜伏感染细胞,特别是经过HAART治疗静息细胞的杀伤作用并同岩藻糖基化抗体进行了对比,为抗体与病毒激活剂的联合应用在减少HIV-1病毒储存库和HIV-1/AIDS功能性治愈方面提供了科学依据。此外,本研究还对HIV-1感染者血浆介导ADCC效应的能力同其与靶细胞的结合能力和中和强度的相关性作了系统的分析,探讨了 Env蛋白构象的变化对抗体ADCC作用的影响,为进一步了解HIV-1感染者血浆抗体ADCC特征奠定了基础。研究方法1.HIV-1病毒株的分离和制备密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）,将HIV-1感染者PBMCs和健康人PBMCs共培养分离和复制HIV-1病毒,使用GHOST细胞系检测临床分离株辅助受体的使用情况。采用两段法扩增HIV-1近全长基因组,测序后构建进化树分析病毒株的亚型。293T细胞通过转染pNL4-3及pWT/Bal质粒得到NL4-3及Bal实验室标准株。在TZM-bl以及PBMCs上测定分离或复制病毒的滴度。2.基于TZM-bl或PBMCs的中和试验HIV-1病毒与倍比稀释的LSEVh-LS-F共孵育后加入TZM-bl或PBMCs,通过检测TZM-bl细胞相对光单位（relativelight unit,RLU）值或上清p24的含量计算抗体50%抑制浓度（IC50）及90%抑制浓度（IC90）。HIV-1感染的细胞与倍比稀释的LSEVh-LS-F共孵育后加入TZM-bl细胞,通过检测TZM-bl细胞RLU的值分析抗体对病毒通过细胞间接触感染的抑制情况。3.NK细胞的活化和抗体ADCC效应检测通过检测NK细胞表面CD107a分子的表达量以及上清细胞因子和趋化因子的含量分析LSEVh-LS-F对NK细胞的活化水平。通过流式检测LSEVh-LS-F对稳定表达膜Env蛋白的细胞系以及HIV-1感染细胞的亲和力。使用基于检测乳酸脱氢酶（LDH）释放或流式细胞术的细胞毒性试验检测LSEVh-LS-F介导PBMCs或NK效应细胞对稳定表达Env的细胞系、HIV-1感染细胞的ADCC效应,同时与岩藻糖基化的多价双特异抗体（LSEVh-LS）介导的ADCC效应作对比。LSEVh-LS-F与HIV-1感染的靶细胞以及效应细胞共孵育后通过检测上清p24的含量计算出病毒抑制率,分析抗体的抗体依赖性细胞介导的病毒抑制作用（ADCVI）。4.HIV-1潜伏病毒的激活和杀灭通过检测上清p24的含量以及Env蛋白的表达量鉴定了三种逆转录病毒激活剂（LRAs）:伏立诺他（SAHA）、Apicidin 和西达本胺（Chidamide）对 ACH2和U1潜伏感染细胞系的激活水平。通过检测LDH的释放,分析LSEVh-LS-F对激活的ACH2细胞的杀伤效果。使用实验室标准株及中国临床分离株制备静息CD4+ T潜伏感染细胞模型,通过检测上清p24的含量或上清感染TZM-bl后的RLU值分析LSEVh-LS-F对激活的静息CD4+ T潜伏感染细胞模型的的杀伤作用。从经过经HAART治疗的HIV-1感染者中分离静息CD4+T潜伏细胞并用PHA或LRAs进行激活。通过检测上清p24的含量分析LSEVh-LS-F对经过HAART治疗的HIV-1感染者中分离的静息CD4+T潜伏感染细胞的杀伤作用。5.HIV-1感染者血浆ADCC效应分析基于流式细胞术的细胞毒性试验检测了 62份未经抗逆转录病毒治疗的HIV-1感染者血浆对8E5或NL4-3感染的CEM.NKR.CCR5靶细胞的ADCC活性;流式检测HIV-1感染者血浆对靶细胞的亲和力;通过对14株不同亚型HIV-1假病毒的中和作用判断HIV-1感染者血浆的中和强度;分析HIV-1感染者血浆介导的ADCC效应同其对靶细胞亲和力和中和强度的相关性。研究结果1.多价双特异性抗体（LSEVH-LS-F）具有优秀的中和广谱性和中和强度基于TZM-bl细胞的中和试验结果表明LSEVh-LS-F对49株（100%）分离的临床病毒株均具有中和效果,且中和IC50的几何平均数比VRC01低了 4.9倍（4.7 nM）。在更接近人体情况的基于PBMCs的中和试验中,LSEVh-LS-F能完全中和所检测的临床病毒株,且中和IC50的几何平均数比VRC01低了 4.2倍（0.9 nM）。利用国际中和抗体检测平台的标准假病毒,LSEVh-LS-F对14株假病毒具有很好的中和效果,IC50的几何平均数比VRC01降低了 11倍（0.28nM）;IC90的几何平均数比VRC01降低了近4倍（3.9 nM）。LSEVh-LS-F与N6具有相近的中和强度但具有更好的中和广度。LSEVh-LS-F对NL4-3和Bal实验室标准株的中和效果优于VRC01,IC50分别为0.005 nM和0.05 nM。此外,LSEVh-LS-F还可以有效抑制HIV-1病毒在细胞间的接触感染。去岩藻糖基化修饰对多价双特异性抗体的中和作用无影响。2.多价双特异性抗体（LSEVH-LS-F）能介导有效的ADCC效应LSEVh-LS-F可以有效的活化NK细胞脱颗粒,并可活化NK细胞释放IFN-y以及β-趋化因子等抗病毒因子。LSEVh-LS-F和LSEVh-LS能够特异性结合稳定表达膜Env蛋白的细胞系（8E5和CHOZA-gp160sc细胞）以及HIV-1感染的细胞（CD4+T以及CEM.NKR.CCR5细胞）,且两者之间的结合能力无差异。LSEVh-LS-F能通过ADCC作用特异性杀伤表达Env蛋白的细胞（稳定表达膜Env蛋白的细胞系以及HIV-1感染的细胞）,且其杀伤效果显着优于LSEVh-LS和VRC01。LSEVh-LS-F还可有效介导HIV-1感染者PBMCs对8E5细胞的ADCC效应。LSEVh-LS-F在效应细胞存在时对HIV-1在CD4+T以及CEM.NKR.CCR5细胞内复制的抑制作用持续存在,而LSEVh-LS对病毒复制的抑制作用则随时间的延长逐渐降低。3.HIV-1潜伏感染细胞的激活和杀伤三种 LRAs:SAHA、Apicidin 和 Chidamide 处理 ACH2 和 U1 细胞后上清 p24含量以及ACH2细胞Env蛋白的表达量在一定范围内随激活剂浓度的增加而升高。LSEVh-LS-F可对激活的ACH2细胞介导有效的ADCC作用且效果优于LSEVh-LS。LSEVh-LS-F对激活的ACH2细胞介导的ADCC作用随ACH2细胞表面Env蛋白表达量的增加而升高。LSEVh-LS-F处理组对NL4-3和GX2016EU03感染的静息CD4+ T细胞潜伏感染细胞模型比无抗体对照组p24的含量分别下降了 40倍和5倍,通过检测细胞上清感染TZM-bl细胞的RLU值也得到了相似的结果,分别下降了 85倍和27倍。进一步从HAART治疗的HIV-1感染者中分离出静息CD4+ T淋巴细胞,通过使用PHA或者SAHA和Apicidin两种组蛋白去乙酰化酶抑制剂类组合进行激活后,LSEVh-LS-F处理组p24的含量显着低于无抗体对照组、M336、VRC01和LSEVh-LS处理组。提示LSEVh-LS-F对抗病毒治疗临床病人体内激活的静息细胞具有杀伤作用。4.HIV-1感染者血浆抗体介导ADCC效应分析多数HIV-1感染者血浆对不同亚型假病毒和NL4-3具有一定的中和活性,但是中和强度差异较大。HIV-1感染者血浆对8E5和NL4-3感染的CEM.NKR.CCR5两种靶细胞介导的ADCC效应具有明显不同的特征。HIV-1感染者血浆对8E5细胞介导ADCC效应同其IgG类与8E5细胞的结合能力以及中和强度呈明显正相关;而对NL4-3感染CEM.NKR.CCR5细胞介导ADCC效应同其IgG类抗体与NL4-3感染的CEM.NKR.CCR5细胞的结合能力呈明显负相关,而同中和强度无相关性。同CD4+T细胞共孵育改变了 8E5细胞膜表面Env的构象状态,不同中和活性HIV-1感染者血浆对Env构象改变的8E5细胞介导ADCC效应的特征发生改变。结论新型多价双特异性抗体LSEVh-LS-F具有很好的中和广谱性和中和强度,特别是对我国不同亚型的HIV-1临床分离株呈现出很好的中和效果;LSEVh-LS-F能活化NK细胞并有效介导对HIV-1感染细胞的ADCC效应,尤其是以未治疗和治疗的HIV-1感染者PBMCs为效应细胞时,仍可介导较强的ADCC效应;LSEVh-LS-F可以杀伤激活的HIV-1潜伏感染细胞系,抑制HIV-1在CD4+ T潜伏感染细胞模型内的复制,更重要的是可以杀伤抗病毒治疗临床病人体内激活的CD4+ T静息细胞。该研究为抗体与病毒激活剂的联合应用在减少HIV-1病毒储存库和HIV-1/AIDS功能性治愈方面提供了科学依据。靶细胞Env蛋白的构象对HIV-1感染者血浆介导的ADCC作用具有重要的影响。HIV-1感染者血浆介导ADCC作用的抗体主要针对Env蛋白的CD4i表位,且中和作用较弱的HIV-1感染血浆能介导更强的ADCC作用。这些结果为进一步了解HIV-1感染者血浆抗体的ADCC特征和新型抗体的研制奠定了基础。
辛英豪[7]（2018）在《猪源噬菌体抗体库的构建与抗PRRSV抗体的筛选》文中指出中和抗体能够与病毒表面的抗原结合,从而阻止病毒吸附靶细胞受体,防止病毒侵入细胞,在抗病毒感染中发挥重要作用。因此,中和抗体是一种具有很好应用前景的抗病毒治疗制剂。但是,采用小鼠单克隆抗体技术制备的抗病毒中和抗体对于人或畜禽等动物存在异源性等特性,导致其临床应用受到限制。近年来,随着抗体制备技术的发展,制备人源或动物源的中和抗体成为研究热点。目前,针对人类免疫缺陷病毒、流感病毒、埃博拉病毒、登革热病毒等多种病毒的全人源中和抗体开发取得了显着进展,而且还发现人体内可能存在具有抗病毒中和作用的天然中和抗体。相对于人源中和抗体研究,猪等动物源中和抗体的开发尚处于起步阶段。猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS Virus,PRRSV）引起的妊娠母猪繁殖障碍、仔猪严重呼吸系统症状和生长迟缓等临床表现的病毒性传染病。PRRSV感染或免疫能诱发很强的体液免疫反应,一般于感染后79 d可检测到特异性抗体,但这些抗体对体内、外的病毒都没有中和能力甚至会增强感染,而有效的中和抗体一般出现于28 d以后。由于中和抗体产生的时间晚、水平低,使该病的防治十分困难。为深入研究猪对PRRSV的抗体反应,本研究利用噬菌体展示技术构建了猪源抗体库,并从中筛选到具有中和能力的抗体。进一步研究发现筛选到的中和抗体为多反应性抗体,主要结合细胞蛋白KRT8（Keratin 8）和MYH9（Nonmuscle myosin heavy chain II-A）。具体研究内容如下:1.猪源天然抗体库的构建与抗PRRSV抗体的筛选分离PRRSV抗原、抗体阴性猪的PBMCs（Peripheral Blood Mononuclear Cells）,提取mRNA,利用RT-PCR技术扩增得到抗体重链可变区（VH）、轻链可变区（VL）基因,通过overlap PCR将VH、VL用一条柔性多肽基因组装成scFv（single-chain antibody）片段。噬粒pComb3XSS与scFv片段经Sfi I酶切、回收、连接、电转化感受态细胞,获得库容为1.5×108的初级库,经鉴定插入片段大小的正确率为80%。通过测序发现VH序列的相似度介于63.3%92.5%,未发现相同序列,说明抗体库的多样性好。与IMGT数据库比对发现天然库VH基因家族的分布符合文献报道的最多的3个基因家族占比>40%,最多的6个基因家族占比>70%的规律,而且天然库的VH基因分布于13个不同的基因家族,进一步证实构建的天然库具有很好的多样性。加入辅助噬菌体超感染获得重组噬菌体抗体库,用纯化的PRRSV病毒粒子进行筛选,获得4株噬菌体抗体N-28、N-36、N-48、N-67。将获得的抗体基因连接至pET-22b表达载体,经鉴定重组蛋白主要以包涵体的形式表达。对包涵体进行变性、复性后,测定了4株抗体中和PRRSV的能力,发现其中N-28、N-67具有一定的中和PRRSV的能力。2.猪源PRRSV免疫抗体库的构建与抗PRRSV抗体的筛选为筛选具有广谱抗PRRSV的中和抗体,首先用PRRSV商品化弱毒活疫苗免疫30日龄仔猪,然后用高致病性PRRSV毒株（WUH3株）、两种美国流行毒株（VR2385、VR2549）、国内分离的流行毒株（NADC30L）对仔猪进行感染。经过8次免疫/感染后,实验猪体内产生了针对PRRSV WUH3株、VR2385株、VR2549株和NADC30L株的高滴度中和抗体,中和效价介于1∶63.51∶858.7之间。分离高免疫猪的PBMCs,扩增抗体基因,经过多次电转获得库容为2×107的初级库,经鉴定插入片段大小的正确率为89.4%。通过测序发现VH序列的相似度介于70.3%93.5%,未发现相同序列,说明免疫抗体库的多样性好;VH基因家族则由天然库的13个下降为6个,说明经过多次免疫/感染后试验猪的抗体基因使用率发生了明显的变化。用纯化的PRRSV病毒粒子对构建的抗体库进行富集、筛选,最终获得3株噬菌体抗体I-2154、I-1320、I-141。将抗体基因连接至原核表达载体pET-22b中,表达纯化后测定了3株抗体对PRRSV WUH3株、VR2549株、NADC30L株的中和能力,结果表明3株抗体对3株病毒均有一定的中和作用,其中I-141的中和效果最好。3株病毒对抗体的敏感度也不相同,其中NADC30L对I-141最为敏感。进一步分析了I-141对NADC30L的抑制机制,发现I-141并不影响病毒的吸附而是抑制了病毒的侵入。3.scFv结合蛋白的质谱鉴定与功能研究首先用生物素标记的N-28、I-141分别与感染或不感染PRRSV的MARC-145细胞裂解液孵育,用链霉亲和素偶联的磁珠分离与scFv结合的蛋白,然后对分离的蛋白进行了质谱鉴定。根据质谱结果检索PRRSV WUH3编码蛋白,在2个接毒组中均未能鉴定到病毒蛋白;对4个实验组鉴定到的蛋白分析发现有30种蛋白在4个实验组均能被鉴定到,提示N-28、I-141可能为多反应性抗体。为了确认这两株scFv的多反应性,选择了KRT8、MYH9这两种已知在病毒感染细胞过程中发挥重要作用的蛋白作为研究对象,通过免疫共沉淀实验发现N-28、I-141能与KRT8、MYH9发生互作,确认了这两种scFv的多反应性。然后在PK-15CD163细胞中干扰或超表达这两种蛋白,证实这两种蛋白参与了PRRSV的感染,并且在PRRSV侵入细胞过程中这两种蛋白的表达量上调。
马瑞雪[8]（2017）在《汉滩病毒包膜糖蛋白H-2Kb限制性CTL表位的筛选与鉴定》文中指出【研究背景】肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）,是一种急性病毒性传染病,全球90%的HFRS病例发生在我国,该病来势凶猛,变化较快,病死率较高,一直以来严重危害我国人民的身心健康。汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）是引起我国HFRS的主要病原之一,探究HTNV特异性T细胞应答规律以及鉴定HTNV结构蛋白上相关表位对研究其免疫应答机制、免疫治疗方法,以及研发HFRS新型疫苗均具有重要意义。现有的多数研究表明,HTNV核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,NP）上具有细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）表位,包膜糖蛋白（Glycoprotein,GP）上存在有中和表位和血凝表位。CTL在识别靶细胞后,可通过穿孔素途径和死亡受体途径杀伤病毒感染细胞,并引起感染细胞的死亡或凋亡,此外还可通过分泌细胞因子调节机体免疫功能。因此,HTNV CTL表位的研究对HTNV感染后的免疫保护和免疫治疗十分关键。近期研究发现HTNV GP也具有诱导T细胞应答的能力,并明确了HTNV GP上存在辅助性T淋巴细胞（Helper T lymphocyte,Th）表位,而目前尚无HTNV GP上是否存在特异性CTL表位的成熟研究报道。若能在HTNV GP上发现并鉴定出CTL特异性表位,对于HTNV新型疫苗的研究具有重要意义。本研究利用生物信息学软件对HTNV GP一级结构进行了相关参数分析,最终预测并合成了15个H-2Kb限制性CTL表位肽,并对其进行了筛选、鉴定及生物学活性和免疫学特性研究,以期明确HTNV GP上是否存在CTL特异性表位。【研究方法】用生物信息学表位预测软件IEDB（Immune epitope database and analysis resource）将HTNV GP一级结构进行相关参数分析,对可能存在的CTL表位进行预测;同时用另一生物信息学软件BIMAS（Bio Informatics and molecular analysis section）,综合评价各预测表位与小鼠主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex,MHC）编码产物H-2Kb分子的结合指数,最后初步筛选出15个H-2Kb限制性HTNV CTL表位肽并合成。通过酶联免疫斑点实验（Enzyme Linked Immunospot assay,ELISPOT）,将HTNV感染C57BL/6小鼠脾细胞,分别用上述预测的15个HTNV CTL表位肽刺激,并用已知HTNV NP特异性CTL表位肽NP1作为阳性对照,筛选出可有效刺激感染小鼠脾脏中T细胞分泌IFN-γ的多肽;进而,以CD4+T细胞去除后的小鼠脾细胞（CD4depleted SP）或CD8+T细胞去除后的小鼠脾细胞（CD8 depleted SP）作为效应细胞,利用ELISPOT实验筛选并鉴定出能刺激CD8+T细胞反应的CTL优势表位肽。通过CTL杀伤实验,以HTNV感染小鼠脾细胞作为效应细胞,分别用抗原肽致敏的EL-4细胞和HTNV感染的巨噬细胞作为CTL杀伤实验的靶细胞,进一步验证各HTNV GP CTL表位肽是否具有刺激效应细胞应答的潜能。在上述工作的基础上,我们进一步研究并分析了HTNV GP CTL表位肽的生物学活性及免疫学特性。通过淋巴细胞增殖实验检测CTL表位肽促进C57BL/6小鼠外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）增殖的能力;采用胞内细胞因子染色法检测CTL表位肽刺激小鼠脾细胞分泌IFN-γ的能力。进而,将CTL表位肽与弗氏佐剂充分乳化后,皮下多点注射免疫C57BL/6小鼠,以已知HTNV NP特异性CTL表位肽NP1、HFRS灭活疫苗作为阳性对照;以PBS、弗氏佐剂作为阴性对照。总共免疫4次,每次间隔10天,在末次免疫后第10天,通过ELISPOT和CTL杀伤实验,分别检测免疫小鼠脾细胞分泌IFN-γ的能力以及CTL的特异性杀伤活性,进而评价抗原表位肽在体内所介导的细胞免疫应答水平;通过酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA）和微量细胞中和实验,分别检测免疫小鼠血清中抗HTNV NP及GP的特异性抗体滴度和中和抗体滴度,进而评价抗原表位肽在体内所介导的体液免疫应答水平。同时取HTNV 76-118株以105 pfu/只的感染剂量,采用肌肉注射的途径感染免疫小鼠,病毒感染后第3天,通过ELISA和实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）,分别检测免疫小鼠各组织脏器中HTNV特异性抗原和核酸。从而综合评价CTL表位肽对HTNV感染小鼠的保护作用。【实验结果】根据IEDB预测表位肽的Percentile Rank排名（Percentile Rank值越低,意味着预测的CTL表位肽可能诱导机体产生的免疫应答能力越强）,筛选出HTNV GP上排名前15个H-2Kb限制性CTL表位肽,均由8个氨基酸组成,分别为GP1（aa39-aa46:SVIGYVEL）、GP2（aa44-aa51:VELPPVPL）、GP3（aa64-aa71:SMDNHQSL）、GP4（aa208-aa215:IVCFFVAV）、GP5（aa420-aa427:VNFVCQRV）、GP6（aa456-aa463:ITSLFSLL）、GP7（aa489-aa496:VTFCFGWV）、GP8（aa499-aa506:PAITFIIL）、GP9（aa797-aa804:ITIRYSRR）、GP10（aa845-aa852:TLLFFGPL）、GP11（aa925-aa932:QSFNTSTM）、GP12（aa987-aa994:VGFTLTCL）、GP13（aa1102-aa1109:FSGNWIVL）、GP14（aa1113-aa1120:CVFLLFSL）、GP15（aa1114-aa1121:VFLLFSLV）;BIMAS综合评价了各预测表位肽与H-2Kb分子的结合指数,表明预测的15个CTL表位肽均可与H-2Kb分子结合,结合指数越高意味着其与H-2Kb分子之间的亲和力越大。ELISPOT结果显示,在预测的15个CTL表位肽中,只有GP1、GP2、GP3、GP6、GP8、GP10等6个可诱导HTNV感染小鼠脾脏中T淋巴细胞分泌IFN-γ,其平均斑点形成细胞数（Spot-forming cells,SFC）分别为225,130,257,461,196,162。用上述6个阳性抗原肽分别刺激去除CD4+T细胞的淋巴细胞时,GP1、GP2、GP3、GP8、GP10均未明显诱导淋巴细胞分泌IFN-γ,而GP6保持较高的斑点数,其平均SFC为421;同时,用上述6个阳性抗原肽分别刺激去除CD8+T细胞的淋巴细胞时,结果恰好相反,GP1、GP2、GP3、GP8、GP10刺激淋巴细胞后保持较高的斑点数,其平均SFC分别为216、129、229、183、179,而GP6未明显诱导淋巴细胞分泌IFN-γ。而且GP6的实验结果与阳性对照NP1的实验结果一致。上述结果表明,GP6可能为HTNV GP特异性CTL优势表位肽。CTL杀伤实验结果显示,当HTNV感染的小鼠脾细胞分别用GP6、阳性对照NP1刺激后作为效应细胞,抗原肽致敏的EL-4细胞（H-2Kb限制性）、HTNV感染的小鼠腹腔巨噬细胞作为靶细胞时,随着效靶比（Effector cell/Target cell,E/T）的升高,其特异性杀伤活性也随之提高;然而,当抗原肽未致敏的EL-4细胞、HTNV未感染的巨噬细胞,以及P815细胞（H-2Dd限制性）作为靶细胞时,效应细胞的非特异性杀伤活性均较低,未超过10%。结果表明,GP6能够有效刺激CTL对HTNV感染的靶细胞进行特异性杀伤。对HTNV GP6进行生物学活性鉴定,其流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测结果显示,GP6可有效刺激小鼠PBMC的增殖,与阴性对照组相比,增殖的细胞占细胞总数的比例明显增加,二者存在显着的统计学差异;并且GP6可强烈诱导小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ,与阴性对照组相比,其IFN-γ+CD8+T细胞占CD8+T细胞总数比例明显增加,二者存在显着的统计学差异。对HTNV GP6进行免疫学活性检测的结果表明,GP6可刺激C57BL/6小鼠产生强烈的细胞免疫应答,且免疫小鼠脾细胞IFN-γ应答水平均显着高于其他各组。CTL杀伤实验结果表明,随着E/T的升高,GP6特异性CTL的杀伤活性不断增强。但GP6未能诱导C57BL/6小鼠产生针对HTNV GP的特异性抗体以及中和抗体。对免疫小鼠进行动物保护实验的ELISA结果显示,在GP6和阳性对照NP1免疫组小鼠的肝脏、脾脏、肾脏中,其HTNV特异性抗原含量与PBS、弗氏佐剂对照组相比,明显降低。qRT-PCR结果显示,在GP6和阳性对照NP1免疫组小鼠的肝脏、脾脏和肾脏中,其HTNV核酸载量与PBS、弗氏佐剂对照组相比,明显降低,该结果与ELISA检测结果相一致。在GP6免疫组小鼠的肝脏、脾脏、肾脏中,其HTNV特异性抗原含量以及核酸载量,与阳性对照NP1免疫组相比,无统计学差异。上述结果表明,GP6在体内所介导的细胞免疫应答对HTNV感染小鼠具有一定的保护作用。【结论】本研究成功筛选并鉴定出HTNV GP上一个CTL优势表位肽—GP6,可强烈诱导CD8+T细胞应答,并具有良好的生物学活性。将其与弗氏佐剂混合免疫C57BL/6小鼠后,可有效诱导机体产生特异性细胞免疫应答,而且相关细胞免疫检测指标均优于HFRS灭活疫苗组。免疫小鼠保护实验结果证实,GP6抗原表位肽所介导的细胞免疫应答对HTNV感染小鼠具有一定的保护作用。本研究为探究HTNV GP上特异性CTL表位提供了依据。
阮萍[9]（2013）在《树鼩慢性感染乙肝病毒过程中肝组织病理学观察及枯否细胞变化意义的探讨》文中研究指明目的乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是全球面临的重大公共卫生问题,是引起急慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病原。建立一种简便、有效、稳定的HBV感染动物模型对于探索其感染机制、寻找有效的防治方法、研制抗HBV药物都具有重要的意义。本课题组前期研究证实,新生期接种HBV的树鼩能够长期感染HBV,并且HBV能够在树鼩体内稳定复制和长期存在。本研究拟在课题组以往研究的基础上,一方面继续观察慢性感染HBV的树鼩肝组织的病理组织学改变进展、分析和比较其与人类慢性感染HBV后的病理变化过程的异同,另一方面,为寻找树鼩HBV感染率的影响因素,本课题还对慢性感染HBV的树鼩肝组织的枯否细胞数量、功能及其可能的调节因子进行检测,以探索枯否细胞在树鼩感染HBV慢性化过程中的意义,为进一步优化树鼩模型提供线索。方法动物分为3组：A组,6只,为前期实验已确定慢性感染HBV（接种后1-6年）的树鼩；B组,3只,为前期实验疑似慢性感染HBV的树鼩（接种后3-4年）；C组,4只,为未接种HBV的正常对照树鼩。全部动物定期抽血和进行肝活检手术,采集的血清和肝组织标本分别作以下两部分研究。第一部分,分析慢性感染HBV的树鼩肝组织病理学变化,主要内容有：1.检测HBV感染指标,包括应用ELISA/TRFIA方法定性/定量检测HBV血清免疫学标志（两对半）、应用FQ-PCR定量检测血清和肝组织的HBVDNA水平、应用免疫组织化学方法检测肝组织中的HBsAg和HBcAg阳性肝细胞。2.观察肝组织病变,包括对组织切片应用HE染色,结合网状纤维、Masson等特殊染色及透射电镜等方法,观察肝脏病理组织学及细胞超微结构的改变,评价病变级别；同时,通过Ki67、P53和Cyclin D1免疫组化染色,评价肝细胞增殖水平。第二部分,分析慢性感染HBV的树鼩肝内枯否细胞的功能和数量变化,并分析其可能的影响因子。主要内容有：1.检测树鼩肝组织中枯否细胞数量变化,即应用流式细胞术检测从树鼩肝活检组织分离的肝非实质细胞中CD163+细胞的比例,以及用免疫组化染色方法原位检测树鼩肝组织中的枯否细胞数量。2.检测树鼩肝组织中枯否细胞的功能,即对手术切取的树鼩肝组织进行枯否细胞的分离、鉴定和原代培养,然后检测枯否细胞的迁移功能、吞噬功能及合成促炎症介质TNF-a的功能。其中,迁移功能的检测为以原代培养的枯否细胞开展细胞迁移实验,以及用免疫荧光染色法检测枯否细胞内的与迁移能力有关的细胞骨架成分微丝蛋白及微管蛋白的表达水平；吞噬功能的检测为应用溶酶体荧光探针检测原代培养的枯否细胞内溶酶体数量,以及用免疫组化方法原位检测肝组织中溶菌酶的表达情况；合成促炎症介质TNF-a功能的检测为应用VVestern blot及实时荧光定量RT-PCR方法,分别检测肝组织TNF-a蛋白及原代培养的枯否细胞TNF-a mRNA表达水平。3.检测树鼩肝组织中可能影响枯否细胞功能的因子,即应用实时荧光定量RT-PCR方法,检测原代培养的枯否细胞TLR-2及TLR-4等基因mRNA表达水平。结果第一部分,1.A组树鼩呈现HBV持续感染状态,6只动物于最后一次检测（接种HBV后1-6年）仍全部显示血清HBsAg和HBV DNA阳性、肝组织中有HBsAg阳性肝细胞；B组仅1只动物为血清HBsAg马阳性,其余指标阴性；C组全部动物的HBV感染标志均为阴性。2.A组各动物肝组织均有不同程度的慢性肝炎改变,表现为散在或弥漫分布的肝细胞水肿、脂肪变性、嗜酸性变,以及汇管区炎症——汇管区出现较明显的以淋巴细胞为主的炎细胞浸润,伴随小胆管增生；其中1只感染时间最长的动物（A1,接种HBV后6年）还出现小叶内多处坏死灶融合甚至桥接坏死及纤维化、大细胞性不典型增生等组织学改变。A组树鼩的肝活检组织学评分均值为5.33±3.93,显着高于B组（1分,P=-0.018）和C组（0分,P=0.008）；秩相关分析结果表明,组织学评分与动物HBV感染时长及其血清HBV DNA拷贝数呈显着的正相关关系（与感染时长的关系为r=0.808、P=0.000,与血清HBVDNA拷贝数的关系为r=0.494、P=0.014）。电镜下,A组动物的肝细胞超微结构变化表现为部分肝细胞肿大、表面微绒毛肿胀、溶酶体数量增多、胞质中糖原颗粒多少不均、线粒体肿胀变大、内质网扩张或形成不规则囊泡。免疫组化检测肝组织中的细胞增殖因子结果显示,A组动物的Ki67、P53和Cyclin D1表达水平均显着高于B组（分别为P=0.043、P=0.039和P=0.016）和C组（分别为P=0.050、P=0.021和P=0.007）；秩相关分析结果表明,肝组织的Ki67、P53及Cyclin D1的表达水平与肝组织学评分、血清HBV DNA考贝数及肝组织HBV DNA拷贝数均有显着的正相关关系（与组织学评分的关系,分别为r=0.829和P=0.000、r=0.815和P=0.001、r=0.913和P=0.000；与血清HBV DNA拷贝数的关系,分别为r=0.868和P=0.000、r=0.919和P=0.000、r=0.874和P=0.000；与肝组织HBV DNA拷贝数的关系,分别为r=0.744和P=0.004、r=0.846和P=0.000、r=0.876和P=0.000）。第二部分,树鼩肝组织分离枯否细胞的产量约为1.2±0.2x106个细胞/g肝脏,细胞活力为90%,纯度为85%。对原代培养的枯否细胞以及对肝组织中的枯否细胞原位检测结果显示：1.A组树鼩肝内枯否细胞数量增加——经流式细胞术测定,A、B、C三组CD163+细胞占肝非实质细胞的比例分别为89.80±0.36%、77.92±1.22%及77.97±1.13%,A组显着高于B组（P=0.034）和C组（P=0.021）；免疫组化检测结果显示,A、B、C三组肝组织内CD163阳性细胞计数分别为39.92±6.61、24.73±3.85和21.78±2.31个/高倍视野,A组显着高于B组（P=0.028）和C组（P=0.010）；秩相关分析结果显示,枯否细胞的数量与动物感染HBV时长及血清HBV DNA拷贝数存在正相关关系（与感染时长的关系为r=0.737、P=0.000,与血清HBV DNA拷贝数的关系为r=0.497、P=0.013）。2.A组树鼩枯否细胞功能下降——经细胞迁移实验检测,A、B、C三组的迁移细胞数均数分别为6.50±0.93、16.13±0.70和16.25±0.87,A组显着低于B组（P=0.034）和C组（P=0.021）；A组枯否细胞的微丝蛋白及微管蛋白的荧光强度、细胞溶酶体荧光强度、溶菌酶免疫组化阳性表达的细胞计均低于B组和C组（微丝蛋白,P=0.034和P=0.021；微管蛋白,P=0.034和P=0.021；溶酶体荧光,P=0.034和P=0.021；溶菌酶,P=0.020和P=0.011）；A组枯否细胞TNF-a mRNA的表达水平低于B组和C组（P=0.034和P=0.021）,肝组织的TNF-a蛋白质表达水平也支持上述结果。秩相关分析结果显示,溶菌酶阳性细胞计数与动物感染HBV时长及其血清HBV DNA拷贝数均存在显着的负相关关系（与感染时长的关系为r=-0.890、P=0.000；与血清HBVDNA拷贝数的关系为r=-0.601、P=0.002）,而TNF-a mRNA表达量与动物肝组织的HBV DNA拷贝数也呈负相关关系（r=-0.622、P=0.041）。3.检测可能影响枯否细胞功能的因子的结果显示,A组TLR-2mRNA及TLR-4mRNA表达水平均低于B组（P=0.034及P=0.021）和C组（P=0.034及P=0.021）。秩相关分析结果显示,TLR-2mRNA及TLR-4mRNA表达水平均与动物的肝组织HBV DNA拷贝数呈负相关关系（分别为r=-0.622、P=0.041和r=-0.673、P=0.023）；而该二基因的mRNA表达水平与枯否细胞的其它指标则均呈正相关关系,如与枯否细胞迁移数的关系（分别为r=0.809、P=0.003和r=0.845、P=0.001）、与溶酶体密度的关系（分别为r=0.745、P=0.008和r=0.609、P=0.047）,以及与TNF-a mRNA表达水平的关系（分别为r=0.782、P=0.006和r=0.739、P=0.010）结论1..慢性感染HBV的树鼩在血清病毒学指标、组织病理学改变、超微结构特点及病程发展等方面与人类慢性感染HBV后的改变有诸多相似之处,此为其他同类动物模型所不具备的特点,是动物感染HBV研究领域的首次报道,提示树鼩感染HBV模型更适用于人类感染HBV相关的基础和临床研究。2.慢性感染HBV的树鼩肝组织损伤、肝细胞增殖指数分别与其感染HBV病程的长短、血清HBV DNA拷贝数呈显着的正相关关系,提示HBV在宿主体内的持续感染及复制可促进肝组织慢性病变的发展；对这些慢性感染HBV的树鼩继续进行观察,将有可能证明HBV是肝癌的独立诱发因素之一。3.慢性感染HBV的树鼩肝脏枯否细胞数量增加,但该细胞的迁移功能、吞噬功能及合成促炎症介质TNF-a等功能均下降,后者可能由该细胞表达TLR-2mRNA和TLR-4mRNA的水平下降所致；树鼩感染HBV的病程与其肝内枯否细胞的数量及功能变化显着相关。此系列结果提示,枯否细胞在宿主感染HBV的慢性化过程中可能起一定的调节作用。
孟佳子[10]（2013）在《人源HIV-1广谱中和Fab抗体的鉴定》文中提出中和抗体的产生是机体针对病毒感染的主要免疫应答,同时也是设计研发有效疫苗的基础。就HIV-1而言,中和抗体在机体对抗病毒感染中起着尤其重要的作用,诱导机体产生有效的中和抗体也是疫苗免疫反应的一个重要组成部分。在遏制HIV-1感染的疫苗设计中,一个关键目标是通过疫苗免疫能够诱导机体产生中和不同HIV-1毒株的广谱中和抗体。因此,分离和鉴定具有广谱中和活性的抗体,在抗HIV-1感染的研究中正得到越来越多的关注。然而,HIV-1在长期的进化中产生出许多拮抗机体免疫应答的方法,从而逃避机体免疫系统的抗病毒反应。这就使得机体在感染HIV-1时,产生的中和抗体往往中和病毒的活性弱,而且这些抗体只能中和某种特定亚型的病毒。迄今为止,只有为数不多的中和抗体具有广谱交叉中和活性,包括2F5.4E10、2G12、b12、VRC01、PG9、PG16、X5、17b等。最近,一个新的针对HIV-1gp41膜邻接区域（membrane-proximal external region, MPER）靶位的强有效的广谱中和抗体10E8被发现,它是继2F5、4E10后另外一个针对此区域的中和抗体。相比较于2F5、4E10局限的中和反应谱,10E8可以中和接近98%的病毒。这也使它成为目前拥有最为广谱中和活性的抗体。HIV-1广泛的基因变异、快速的增殖、频繁的重组使其成为自然界进化最快的、拥有最为复杂的进化分枝及亚型的微生物之一,而且这一特点在中国艾滋病流行中表现的尤为突出。HIV-1在中国的流行病株主要包括三个亚型：CRF01AE、B’和C/CRF07BC/CRF08BC/B’C （C/07/08/BC）。目前已知的广谱中和抗体对中国流行毒株的中和活性并不理想,其中包括最近才发现的对90%HIV-1具有中和活性的VRC01,这无疑给针对中国流行株的疫苗研发带来了更大的挑战。此外,美国、南非、欧洲、肯尼亚以及印度HIV-1感染者血清中和抗体的研究为全世界艾滋病疫苗的研制提供了重要的参考信息。然而,针对中国HIV-1感染者血清中和抗体反应的研究非常薄弱。最近,中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心报道了国内103例HIV-1B’亚型感染者血清针对25株不同亚型HIV-1假病毒的中和反应,其中包括主要的中国流行株CRF07BC、CRF01AE等亚型。这些被列入研究的感染者没有接受过抗病毒药物治疗并且长期携带病毒超过10年未发病,即艾滋病精英控制者（elite controllers）。研究发现,29%（30例）的血清能够中和80%的检测病毒,其中血清样本F524能够中和全部25株病毒,这提示具有中和活性的感染者血清内可能存在广谱的中和抗体,也为设计研发针对中国流行株的艾滋病疫苗带来了新的希望。因此,本实验室试图从F524感染者中分离具有广谱中和活性的抗体,力图通过对新抗体进行深入研究,为开发有效的HIV疫苗奠定理论基础。我们前期的工作利用F524感染者的外周血单个核淋巴细胞（PBMC）标本构建了噬菌体展示抗体库,并通过交叉利用来源于A和C亚型HIV-1的三聚体形式包膜蛋白富集筛选的方法,成功分离得到一个新的具有广谱反应活性的单克隆Fab抗体A16。本课题聚焦于研究A16的广谱中和活性、中和机制和抗原识别表位。通过基于假病毒中和实验的方法对A16抗体的中和活性做了鉴定,利用受体结合阻断实验和抗体竞争实验对A16的中和机制进行了初步分析,同时利用噬菌体随机肽库结合生物信息学方法预测并确定了抗体所识别的表位,对抗体的中和机制进行了解释。研究发现,A16能够中和包括A, B, C, B’, CRFAG, CRF07BC和CRF01AE等亚型在内的多株HIV毒株。有意义的是,A16针对中国流行株有着更好的中和活性,能够中和HIV-1中国流行株BC和B’亚群中对另两个针对CD4结合区的广谱中和抗体b12和VRC01抵抗的多株病毒。通过对A16抗原表位的研究发现,A16识别位于gp120的CD4结合区的保守位点：主要由loop D区,p20-21发夹结构的N425,及W96,I109,R480位点组成。其表位有别于另外两个同样针对该区域的广谱中和抗体VRC01及b12。推测A16主要通过与病毒竞争受体CD4的结合,进而发挥其广谱的中和活性。A16另一突出的特点是,其重链和轻链可变区（VH和VL）都具有相对较长的CDR3序列和较低的体细胞突变率。综上所述,A16抗体能够广谱并且有效地中和不同HIV-1亚型的代表毒株,尤其是在中国流行的BC和B’亚型,其中一些毒株难于被其他一些广谱中和抗体中和,提示A16可能可以与这些抗体联合使用,用于治疗HIV-1感染。另外,我们的研究结果表明,A16识别的位于CD4结合区loop D为主的表位能够被机体免疫系统识别并且.产生具有广谱活性的抗体。本研究可能为开发有效的诱导机体产生广谱中和抗体的疫苗提供线索。
二、抗体工程研究进程及在控制病毒感染中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗体工程研究进程及在控制病毒感染中的作用（论文提纲范文）
（2）两种弱毒疫苗对新发PRRSV-2的效力评价与PRRSV-2 NSP1β突变疫苗株、阻断单抗研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪繁殖与呼吸综合征概述及PRRSV分子生物学特征 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述 |
| 1.2 PRRSV分子生物学特征 |
| 2 PRRSV流行病学研究进展 |
| 2.1 PRRSV-2在中国的流行情况 |
| 2.2 PRRSV-1在中国的出现及流行 |
| 3 PRRSV免疫学及疫苗研究进展 |
| 3.1 PRRSV与天然免疫 |
| 3.2 PRRSV与细胞免疫 |
| 3.3 PRRSV与体液免疫 |
| 3.4 PRRSV疫苗研究进展 |
| 4 PRRSV侵染PAMs机制研究进展 |
| 4.1 核心受体pCD163的结构和功能 |
| 4.2 唾液酸粘附素的主要功能 |
| 4.3 PRRSV感染PAMs模型 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第二章 新发PRRSV-2复制特性与基因组特征分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 临床样品来源及处理 |
| 2.2 ORF5、ORF6、NSP2基因特异性引物设计 |
| 2.3 RNA提取及RT-PCR检测 |
| 2.4 ORF5、ORF6、NSP2基因的克隆及测序 |
| 2.5 阳性样品的ORF5、ORF6、NSP2系统发育树构建及氨基酸序列比 |
| 2.6 猪原代肺泡巨噬细胞的制备 |
| 2.7 PRRSV-2 JK-100单抗制备-免疫原准备 |
| 2.8 PRRSV-2 JK-100单抗制备-细胞融合 |
| 2.9 PRRSV-2 JK-10O单抗筛选 |
| 2.10 PRRSV-2 JK-100单抗识别蛋白及广谱性鉴定 |
| 2.11 新发PRRSV-2分离与鉴定 |
| 2.12 新发PRRSV-2的全基因组测序 |
| 2.13 新发PRRSV-2进化分析 |
| 2.14 新发PRRSV-2的重组分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病料检测及测序结果 |
| 3.2 基于ORF5、ORF6的系统进化分析 |
| 3.3 阳性样本GP5、M、NSP2氨基酸序列比对 |
| 3.4 PRRSV-2 JK-100单克隆抗体制备 |
| 3.5 PRRSV-2 JK-100单克隆抗体识别蛋白鉴定 |
| 3.6 新发PRRSV-2的分离、鉴定 |
| 3.7 新发PRRSV-2细胞嗜性、复制特性 |
| 3.8 新发PRRSV-2全基因组测序及进化分析 |
| 3.9 新发PRRSV-2重组分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 两种弱毒疫苗对ZJnb16-2株的临床保护效果及对新发PRRSV-2效力评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 疫苗 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 ZJnb16-2、SDbz16-2、JS18-3毒株致病性研究方案 |
| 2.2 攻毒后血清中病毒滴度及N蛋白抗体水平检测 |
| 2.3 攻毒后解剖学及病理学变化检测 |
| 2.4 两种弱毒疫苗对ZJnb16-2毒株交叉保护性评价方案 |
| 2.5 攻毒后特异性N蛋白抗体及免疫后中和抗体水平检测 |
| 2.6 攻毒后血清中病毒滴度测定 |
| 2.7 攻毒后细胞免疫反应测定 |
| 2.8 攻毒后病理解剖学和病理组织学变化 |
| 2.9 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ZJnb16-2、SDbz16-2、JS18-3攻毒后仔猪体温变化和病毒血症 |
| 3.2 ZJnb16-2、SDbz16-2、JS18-3毒株引起的猪只病理解剖学和病理组织学变化 |
| 3.3 攻毒后猪只临床症状观察 |
| 3.4 攻毒前和攻毒后猪只病毒血症测定 |
| 3.5 弱毒疫苗免疫后28天血清对ZJnb16-2中和作用 |
| 3.6 弱毒疫苗中和抗体交叉反应性 |
| 3.7 弱毒疫苗细胞免疫交叉反应性 |
| 3.8 攻毒后猪只肺部、淋巴结解剖学和病理学变化 |
| 4 讨论 |
| 第四章 NSP1β点突变的HuN4-F112疫苗株病毒拯救 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒及细胞 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 HuN4-F112株片段扩增及全基因组测序 |
| 2.2 HuN4-F112全基因组感染性克隆的构建 |
| 2.3 HuN4-F112病毒拯救及鉴定 |
| 2.4 NSP1β蛋白点突变的HuN4-F112感染性克隆构建 |
| 2.5 疫苗株HuN4-F112对天然免疫的抑制作用 |
| 2.6 NSP1β突变株的拯救 |
| 2.7 NSP1β突变株在Marc-145细胞上生长曲线测定 |
| 2.8 NSP1β突变株在Marc-145细胞上蚀斑测定 |
| 2.9 NSP1β突变株遗传稳定性检测 |
| 2.10 NSP1β突变株在PAMs上生长特性检测 |
| 2.11 NSP1β突变株在PAMs上引起的免疫反应检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 HuN4-F112株片段扩增及全基因组测序 |
| 3.2 HuN4-F112株全基因组感染性克隆的构建 |
| 3.3 HuN4-F112株拯救 |
| 3.4 NSP1β突变株拯救 |
| 3.5 NSP1β突变株在Marc-145细胞上生长特性及遗传稳定性检测 |
| 3.6 NSP1β突变株在PAMs上生长特性 |
| 3.7 疫苗毒株HuN4-F112抑制PolyI:C刺激产生的干扰素基因上调 |
| 3.8 NSP1β突变株在PAMs上引起的干扰素反应 |
| 4 讨论 |
| 第五章 NSP1蛋白随机突变的PRRSV-2病毒库构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 NSP1随机突变编码基因扩增 |
| 2.2 pCMV-1-8122-RMNSP1重组质粒构建 |
| 2.3 pCMV-1-16K-RMNSP1重组质粒构建 |
| 2.4 vRM-NSP1随机突变病毒拯救 |
| 3 结果 |
| 3.1 NSP1随机突变编码基因扩增 |
| 3.2 pCMV-1-8122-RMNSP1 |
| 3.3 pCMV-1-16K-RMNSP1重组质粒构建 |
| 3.4 vRM-NSP1突变病毒拯救及IFA鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第六章 阻断PRRSV-2感染PAMs单抗制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、细胞、菌株、病毒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 pCD163蛋白编码基因扩增 |
| 2.2 pFast-HTB-pCD163-SRCR5-9重组质粒的构建及杆粒鉴定 |
| 2.3 pCD163-SRCR5-9蛋白表达鉴定 |
| 2.4 pCD163-SRCR5-9纯化与体外结合病毒能力测定 |
| 2.5 pCD163-SRCR5-9单克隆抗体制备 |
| 2.6 单克隆抗体亚类分析 |
| 2.7 单克隆抗体纯化 |
| 2.8 免疫血清及单抗阻断PRRSV-2感染PAMs-IFA鉴定 |
| 2.9 单抗阻断PRRSV-2感染PAMs-病毒滴度及拷贝数测定 |
| 2.10 阻断单抗识别表位鉴定 |
| 2.11 阻断单抗编码基因的扩增 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCD163-SRCR5-9的表达鉴定及纯化 |
| 3.2 pCD163-SRCR5-9对病毒感染PAMs的抑制作用 |
| 3.3 pCD163-SRCR5-9的免疫血清对病毒感染PAMs的阻断作用 |
| 3.4 pCD163-SRCR5-9的单克隆抗体制备 |
| 3.5 pCD163-SRCR5-9单克隆抗体的纯化 |
| 3.6 pCD163-SRCR5-9单克隆抗体对于病毒感染PAMs的阻断作用 |
| 3.7 阻断单抗对病毒感染PAMs的阻断作用-病毒拷贝数及滴度测定 |
| 3.8 阻断单抗8H2、4H7识别表位鉴定 |
| 3.9 阻断单抗8H2、4H7可变区编码基因扩增 |
| 4 讨论 |
| 全文结论及展望 |
| 创新性 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）抗H7N9禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及初步应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 抗H7N9禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验试剂与仪器 |
| 1.1.2 细胞株和实验动物 |
| 1.1.3 病毒株 |
| 1.1.4 溶液配制 |
| 1.1.5 动物免疫 |
| 1.1.6 细胞融合 |
| 1.1.7 杂交瘤细胞筛选及扩大培养 |
| 1.1.8 单克隆杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 1.1.9 单克隆抗体的腹水制备 |
| 1.1.10 单克隆抗体的纯化与脱盐 |
| 1.1.11 单克隆抗体的亚型鉴定 |
| 1.1.12 单克隆抗体的亲和力分析 |
| 1.1.13 单克隆抗体的特异性分析 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 单克隆抗体的制备及亚型鉴定 |
| 1.2.2 单克隆抗体的亲和力鉴定 |
| 1.2.3 单克隆抗体的特异性鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 第二部分 基于单克隆抗体H7N9禽流感病毒免疫学检测方法的建立 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验试剂与仪器 |
| 2.1.2 病毒株 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.1.4 H7N9禽流感病毒胶体金检测试纸条的组装 |
| 2.1.5 H7N9 禽流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒的组装 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 H7N9禽流感病毒胶体金检测试纸条的组装结果 |
| 2.2.2 H7N9 禽流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒的组装结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三部分 单克隆抗体对感染H7N9禽流感病毒小鼠的预防和治疗作用 |
| 3.1 实验材料与实验方法 |
| 3.1.1 实验试剂与仪器 |
| 3.1.2 细胞株和实验动物 |
| 3.1.3 病毒株 |
| 3.1.4 单克隆抗体的HI效应 |
| 3.1.5 单克隆抗体的中和作用 |
| 3.1.6 单克隆抗体的ADCC效应 |
| 3.1.7 单克隆抗体的逃逸突变位点鉴定 |
| 3.1.8 小鼠预防实验 |
| 3.1.9 小鼠治疗实验 |
| 3.1.10 小鼠肺组织学检查 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 抗H7N9 禽流感单克隆抗体的体外保护作用 |
| 3.2.2 单克隆抗体的逃逸突变位点 |
| 3.2.3 单克隆抗体在小鼠体内的作用 |
| 3.2.4 小鼠肺组织病理学分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 流感疫苗和药物研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
（4）结核分枝杆菌抗原致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究暨烯醇化酶-1单克隆抗体制备与作用初步研究（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 结核病与免疫耗竭 |
| 1.1.2 T细胞免疫耗竭 |
| 1.1.3 骨髓造血干细胞及其增殖分化调节 |
| 1.1.4 分枝杆菌感染可影响造血干细胞的分化 |
| 1.1.5 造血干细胞功能障碍与T细胞耗竭 |
| 1.1.6 选题思路 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料和仪器 |
| 1.2.2 实验对象 |
| 1.2.3 实验方法 |
| 1.2.3.1 BCG的培养 |
| 1.2.3.2 SDS-PAGE蛋白电泳相关试剂配制及方法 |
| 1.2.3.3 蛋白抗原制备 |
| 1.2.3.4 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓造血细胞增殖分化异常模型的建立 |
| 1.2.3.5 IL-2对骨髓造血细胞增殖分化异常的干预治疗 |
| 1.2.4 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 BCG的培养 |
| 1.3.2 蛋白抗原的制备 |
| 1.3.3 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓造血细胞增殖分化异常模型的检测结果 |
| 1.3.3.1 结核分枝杆菌抗原持续刺激致脾脏抗原特异性CD4~+T细胞分泌IFN-γ水平降低 |
| 1.3.3.2 结核分枝杆菌抗原持续刺激致TB10.4 _(4-12)特异性的记忆性CD8~+T细胞数量减少 |
| 1.3.3.3 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓LK细胞增殖能力下降 |
| 1.3.4 IL-2对骨髓造血细胞增殖分化异常的治疗作用 |
| 1.3.4.1 IL-2治疗使脾脏抗原特异性CD4~+ T细胞分泌IFN-γ水平升高 |
| 1.3.4.2 IL-2治疗使TB10.4 _(4-12)特异性的CD8~+记忆性T细胞数量增加 |
| 1.3.4.3 IL-2治疗后骨髓LK细胞的增殖能力回升 |
| 1.3.4.4 结核分枝杆菌抗原持续刺激和IL-2治疗后,骨髓造血细胞转录因子的变化 |
| 1.3.4.5 结核分枝杆菌抗原持续刺激和IL-2治疗后,骨髓造血微环境中细胞因子的变化 |
| 1.3.4.6 结核分枝杆菌抗原持续刺激和IL-2治疗后,JAK3和STAT5的表达上调 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 应用结核分枝杆菌抗原持续刺激模拟结核分枝杆菌感染引起的免疫病理损伤 |
| 1.4.2 骨髓造血细胞的表型鉴定 |
| 1.4.3 骨髓造血细胞与T细胞互相作用 |
| 1.4.4 结核分枝杆菌抗原持续刺激对细胞因子IFN-γ和IL-2分泌的影响 |
| 1.4.5 IFN-γ对骨髓造血干细胞的调节作用 |
| 1.4.6 IL-2对骨髓造血干细胞的调节作用 |
| 1.4.7 不同结核分枝杆菌抗原诱导T细胞耗竭的能力不同 |
| 1.4.8 骨髓造血细胞增殖分化异常与T细胞耗竭的关系 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 粟粒性肺结核的临床病例分析和BCG感染诱导骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.1.1 粟粒性肺结核与骨髓造血功能障碍 |
| 2.1.2 分枝杆菌感染与造血干细胞分化 |
| 2.1.3 细胞因子网络对造血干细胞增殖分化的调节作用 |
| 2.1.4 选题思路 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料和仪器 |
| 2.2.2 实验对象 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.3.1 BCG感染动物模型的建立 |
| 2.2.3.2 IL-2对大剂量BCG入血感染小鼠的干预治疗 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 病例分析 |
| 2.3.2 BCG感染动物模型免疫检测结果 |
| 2.3.2.1 大剂量BCG入血感染致白细胞、淋巴细胞和血小板减少 |
| 2.3.2.2 大剂量BCG入血感染致小鼠脾脏、肺脏和肝脏肿大 |
| 2.3.2.3 大剂量BCG滴鼻感染致脾脏CD4~+T细胞表面高表达PD-1 |
| 2.3.2.4 大剂量BCG入血感染致脾脏CD8~+T细胞表面高表达PD-1 |
| 2.3.2.5 大剂量BCG滴鼻感染致脾脏CD4~+T细胞增殖能力增强 |
| 2.3.2.6 大剂量BCG入血感染致脾脏CD8~+T细胞增殖能力降低 |
| 2.3.2.7 BCG感染对外周血血清中IFN-γ的影响 |
| 2.3.2.8 BCG感染对脾脏T细胞分泌细胞因子的影响 |
| 2.3.2.9 BCG感染对骨髓LK细胞增殖能力的影响 |
| 2.3.2.10 BCG感染对骨髓造血微环境中细胞因子水平的影响 |
| 2.3.2.11 BCG感染对骨髓LK细胞转录因子表达的影响 |
| 2.3.3 IL-2治疗大剂量BCG入血感染动物模型的效果评价 |
| 2.3.3.1 IL-2治疗可降低脾脏CD8~+T细胞PD-1的表达 |
| 2.3.3.2 IL-2治疗可增强脾脏T细胞的增殖能力 |
| 2.3.3.3 IL-2治疗可部分逆转骨髓LK细胞的增殖能力 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 临床粟粒性肺结核的血液学变化 |
| 2.4.2 BCG感染途径和剂量对T细胞及骨髓造血功能的影响 |
| 2.4.3 BCG感染模型与临床粟粒性肺结核感染 |
| 2.4.4 BCG感染后骨髓造血微环境细胞因子的变化与骨髓造血细胞增殖分化异常 |
| 2.4.5 BCG感染后骨髓造血细胞增殖能力改变 |
| 2.4.6 后续研究计划 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 糖酵解酶ENO1单克隆抗体制备及其作用初步研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.1.1 糖代谢 |
| 3.1.2 烯醇化酶1(ENO1)与糖代谢 |
| 3.1.3 ENO1与肿瘤 |
| 3.1.4 ENO1与宫颈癌 |
| 3.1.5 单克隆抗体的制备 |
| 3.1.6 腺相关病毒(AAV) |
| 3.1.7 选题思路 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料和仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 重组质粒pcDNA3.1-ENO1的构建 |
| 3.2.2.2 PcDNA3.1-ENO1在HEK-293T细胞中的表达和纯化 |
| 3.2.2.3 PcDNA3.1-ENO1转染CHO-K1细胞 |
| 3.2.2.4 PFastBac1-ENO1的构建 |
| 3.2.2.5 ENO1蛋白的表达和纯化 |
| 3.2.2.6 ENO单克隆抗体制备 |
| 3.2.2.7 ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移侵袭能力的抑制作用 |
| 3.2.2.8 杂交瘤细胞RNA提取 |
| 3.2.2.9 ENO1单克隆抗体可变区基因测序 |
| 3.2.2.10 腺相关病毒载体包装ENO1单抗可变区基因 |
| 3.2.3 统计学处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组质粒pcDNA3.1-ENO1的构建 |
| 3.3.2 PcDNA3.1-ENO1在HEK-293T细胞中的表达和纯化 |
| 3.3.3 PcDNA3.1-ENO1转染CHO-K1细胞 |
| 3.3.4 ENO1基因在杆状病毒表达载体中的克隆、表达和纯化 |
| 3.3.5 ENO1单克隆抗体的制备 |
| 3.3.6 ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移侵袭能力的抑制作用 |
| 3.3.7 ENO1单克隆抗体单克隆抗体可变区基因测序 |
| 3.3.8 腺相关病毒包装ENO1单克隆抗体可变区基因 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 真核表达系统的选择 |
| 3.4.2 单克隆抗体的制备及测序 |
| 3.4.3 ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移侵袭能力的抑制作用 |
| 3.4.4 腺相关病毒载体的应用 |
| 3.4.5 后续研究计划 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成果 |
| 致谢 |
（5）肿瘤靶向性新型溶瘤单纯疱疹病毒的理性设计及其抗肿瘤作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 全球癌症流行病学概况 |
| 1.2 全球癌症经济负担概况 |
| 1.3 全球癌症危险因素 |
| 1.4 癌症的传统治疗方法 |
| 1.5 癌症的靶向疗法 |
| 1.6 癌症免疫疗法概述及研究进展 |
| 1.6.1 靶向CTLA-4信号通路的癌症免疫疗法研究进展 |
| 1.6.2 靶向PD-1/PD-L1信号通路的癌症免疫疗法研究进展 |
| 1.6.3 溶瘤病毒免疫疗法概述 |
| 1.7 本研究的目的、意义及研究思路 |
| 1.7.1 研究目的和意义 |
| 1.7.2 本研究的思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第一节 材料 |
| 1.1 本研究中使用的主要仪器和设备 |
| 1.2 本研究中所用的主要耗材 |
| 1.3 本研究中所用的细胞株 |
| 1.4 本研究中所用的实验动物 |
| 1.5 本研究中所用病毒株 |
| 1.6 分子克隆相关试剂 |
| 1.7 细胞培养相关试剂 |
| 1.8 病毒实验相关试剂 |
| 1.9 免疫学相关抗体及试剂 |
| 1.10 临床标本 |
| 1.11 研究所需试剂配制 |
| 第二节 研究方法 |
| 2.1 分子克隆实验方法 |
| 2.2 哺乳动物细胞培养方法 |
| 2.3 细胞冻存 |
| 2.4 血球计数板细胞计数 |
| 2.5 全自动细胞计数仪细胞计数 |
| 2.6 哺乳动物细胞转染 |
| 2.7 病毒体外培养和扩增 |
| 2.8 病毒滴定测定 |
| 2.9 溶瘤病毒体外细胞杀伤活性评估实验 |
| 2.10 溶瘤病毒体外复制效率实验 |
| 2.11 更昔洛韦对HSV-1病毒体外复制抑制性实验 |
| 2.12 病毒关键蛋白的鉴定实验 |
| 2.13 溶瘤病毒体外诱导免疫原性细胞死亡的实验方法 |
| 2.14 溶瘤病毒体内安全性评价实验方法 |
| 2.15 小鼠肿瘤模型上评估溶瘤病毒疗效和机制研究实验方法 |
| 2.16 溶瘤病毒OVH联合PD-1抗体治疗肿瘤的疗效评估 |
| 2.17 数据处理及统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分: 具有肿瘤选择性复制与杀伤的溶瘤病毒OVH的构建、性质鉴定和安全性评估 |
| 第一节 溶瘤病毒OVH的构建和性质鉴定 |
| 1.1 溶瘤病毒OVH的构建 |
| 1.2 四种病毒感染U-2OS细胞的病变特征 |
| 1.3 四种病毒在U-2OS细胞上形成的病毒空斑大小比较 |
| 1.4 四种病毒在U-2OS细胞上的增殖和关键病毒蛋白的检定 |
| 1.5 溶瘤病毒OVH的肿瘤选择性评估 |
| 第二节. 溶瘤病毒OVH的安全性评估 |
| 2.1 溶瘤病毒OVH维持对抗疱疹病毒药物的敏感性 |
| 2.2 溶瘤病毒OVH的神经毒性显着降低 |
| 2.3 溶瘤病毒OVH的急性毒性显着降低 |
| 第一部分 小结 |
| 第二部分: 溶瘤病毒OVH体内和体外溶瘤活性评估及机制研究 |
| 第一节 溶瘤病毒OVH的体外溶瘤活性评估和体外溶瘤机制研究 |
| 1.1 溶瘤病毒OVH具有广谱抗肿瘤作用 |
| 1.2 溶瘤病毒OVH在肿瘤细胞上的复制效率 |
| 1.3 从实体瘤来源的肿瘤标本中分离培养原代肿瘤细胞 |
| 1.4 从腹水瘤来源的肿瘤标本中分离培养原代肿瘤细胞 |
| 1.5 溶瘤病毒OVH对原代肿瘤细胞具有显着的杀伤效果 |
| 1.6 溶瘤病毒OVH感染肿瘤细胞后诱导免疫原性细胞死亡 |
| 第二节 溶瘤病毒OVH动物肿瘤模型上的疗效评估和机制研究 |
| 2.1 溶瘤病毒OVH显着抑制免疫缺陷鼠皮下肿瘤的生长 |
| 2.2 溶瘤病毒OVH显着抑制免疫鼠皮下自体瘤的生长 |
| 2.3 溶瘤病毒OVH的体内抗肿瘤作用机制研究 |
| 第二部分 小结 |
| 第四章 讨论 |
| 第一节 溶瘤病毒研究面临的挑战 |
| 1.1 平衡溶瘤病毒的有效性和安全性 |
| 1.2 溶瘤病毒递送障碍、扩散障碍和免疫应答障碍 |
| 第二节 溶瘤病毒疗法未来发展方向 |
| 2.1 优化溶瘤病毒载体和递送策略 |
| 2.2 溶瘤病毒联合免疫检验点抑制剂治疗肿瘤 |
| 2.3 溶瘤病毒联合CAR-T治疗肿瘤 |
| 2.4 溶瘤病毒联合化疗药物治疗肿瘤 |
| 2.5 溶瘤病毒联合小分子靶向药物治疗肿瘤 |
| 2.6 溶瘤病毒作为手术前的新辅助治疗联合手术治疗肿瘤 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（6）多价双特异性抗体介导的ADCC清除HIV-1潜伏感染细胞及HIV-1感染者血浆ADCC作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 多价双特异性抗体介导的ADCC清除HIV-1潜伏感染细胞的研究 |
| 引言 |
| 第一章 HIV-1临床病毒株的分离及多价双特异性抗体中和活性分析 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 小结 |
| 第二章 多价双特异性抗体ADCC效应分析 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 小结 |
| 第三章 HIV-1潜伏感染细胞的激活及清除 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 小结 |
| 第二部分 HIV-1感染者血浆ADCC作用的研究 |
| 引言 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 小结 |
| 结论与创新 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人基本情况 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（7）猪源噬菌体抗体库的构建与抗PRRSV抗体的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 抗体的研究进展 |
| 1.1.1 抗体的结构研究 |
| 1.1.2 抗体的生物学功能 |
| 1.1.3 抗体制备技术的研究 |
| 1.1.4 抗体库技术 |
| 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展 |
| 1.2.1 PRRSV概述 |
| 1.2.2 PRRSV与天然免疫 |
| 1.2.3 PRRSV与细胞免疫 |
| 1.2.4 PRRSV与体液免疫 |
| 1.2.5 PRRSV与自身多反应性抗体 |
| 1.2.6 PRRSV与KRT8、MYH9 |
| 第2章 研究目的与意义 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 细胞、毒株、疫苗与菌株 |
| 3.1.3 载体与质粒 |
| 3.1.4 引物序列 |
| 3.1.5 工具酶及主要试剂 |
| 3.1.6 培养基与抗生素及其配制 |
| 3.1.7 主要缓冲液与相关试剂及其配制 |
| 3.1.8 主要仪器设备 |
| 3.1.9 分子生物学分析软件 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 动物免疫与抗体效价检测 |
| 3.2.2 总RNA提取及RT-PCR扩增 |
| 3.2.3 PCR产物或酶切产物的回收 |
| 3.2.4 噬粒pComb3XSS及scFv连接产物的制备 |
| 3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.2.6 辅助噬菌体毒种的制备 |
| 3.2.7 噬菌体抗体库的构建 |
| 3.2.8 微孔板筛选法筛选抗体库 |
| 3.2.9 重组噬菌体的鉴定 |
| 3.2.10 scFv重组蛋白的表达 |
| 3.2.11 scFv结合活性的测定 |
| 3.2.12 scFv中和活性的鉴定 |
| 3.2.13 scFv抑制PRRSV增殖的机制 |
| 3.2.14 间接免疫荧光实验 |
| 3.2.15 scFv识别蛋白的质谱鉴定 |
| 3.2.16 统计学方法 |
| 第4章 结果与分析 |
| 4.1 猪源天然抗体库的构建与抗PRRSV抗体的筛选 |
| 4.1.1 PRRSV的扩增与纯化 |
| 4.1.2 猪外周血单核细胞(PBMCs)的分离及cDNA的合成 |
| 4.1.3 scFv的扩增 |
| 4.1.4 噬粒pComb3XSS及scFv片段的酶切、连接 |
| 4.1.5 辅助噬菌体的制备 |
| 4.1.6 猪源天然抗体库的构建 |
| 4.1.7 天然抗体库的富集、筛选、鉴定 |
| 4.1.8 天然库scFv重组蛋白的表达、纯化、鉴定 |
| 4.1.9 天然库scFv中和活性的测定 |
| 4.2 猪源免疫抗体库的构建与抗PRRSV抗体的筛选 |
| 4.2.1 动物的免疫与抗体效价测定 |
| 4.2.2 免疫抗体库的构建 |
| 4.2.3 免疫抗体库的富集、筛选、鉴定 |
| 4.2.4 免疫库scFv重组蛋白的表达 |
| 4.2.5 免疫库scFv中和活性的测定 |
| 4.2.6 scFvI-141抑制PRRSV增殖的机制 |
| 4.3 scFv识别蛋白的质谱鉴定与功能研究 |
| 4.3.1 IFA验证scFv的反应性 |
| 4.3.2 scFv结合蛋白的分离 |
| 4.3.3 scFv结合蛋白的质谱鉴定 |
| 4.3.4 scFv结合蛋白的生物信息学分析 |
| 4.3.5 KRT8、MYH9的功能研究 |
| 第5章 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 实验动物的选择 |
| 5.1.2 猪源抗体基因片段的扩增 |
| 5.1.3 抗体库的构建 |
| 5.1.4 scFv的表达 |
| 5.1.5 I-141抑制PRRSV增殖的机制 |
| 5.1.6 多反性抗体、自身反应性抗体 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（8）汉滩病毒包膜糖蛋白H-2Kb限制性CTL表位的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 HTNV GP特异性CTL表位的筛选及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 动物 |
| 1.4 多肽 |
| 1.5 细胞培养液 |
| 1.6 试剂 |
| 1.7 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 HTNV GP特异性CTL表位 (H-2K~b限制型)的预测 |
| 2.2 利用ELISPOT实验初步筛选HTNV GP特异性CTL表位肽 |
| 2.3 利用CTL杀伤实验检测各CTL表位肽的杀伤活性 |
| 3 结果 |
| 3.1 HTNV GP特异性CTL表位肽 (H-2K~b限制型)的设计与合成 |
| 3.2 预测的CTL表位肽刺激小鼠脾细胞分泌IFN-γ 水平的ELISPOT检测 |
| 3.3 预测的CTL表位肽刺激HTNV感染小鼠脾细胞后的CTL杀伤活性检测 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 HTNV GP特异性CTL表位肽的生物学活性鉴定及免疫学特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 动物 |
| 1.4 抗体 |
| 1.5 细胞培养液 |
| 1.6 试剂 |
| 1.7 仪器与器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 HTNV GP6的生物学活性鉴定 |
| 2.2 HTNV GP6的免疫学特性研究 |
| 2.3 HTNV GP6免疫动物保护实验 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 HTNV GP6的生物学活性鉴定 |
| 3.2 HTNV GP6免疫小鼠所诱导的免疫应答水平检测 |
| 3.3 HTNV GP6免疫动物保护实验 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（9）树鼩慢性感染乙肝病毒过程中肝组织病理学观察及枯否细胞变化意义的探讨（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果与讨论 |
| 1、第一部分结果 |
| 2、第一部分讨论 |
| 3、第二部分结果 |
| 4、第二部分讨论 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述：固有免疫在乙型肝炎病毒感染中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）人源HIV-1广谱中和Fab抗体的鉴定（论文提纲范文）
| 目录 |
| 图表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| (一) HIV的分子生物学特征 |
| (二) HIV主要的致病机制 |
| (三) 机体对HIV感染的免疫反应 |
| (四) HIV广谱中和抗体研究现状及意义 |
| 实验材料与方法 |
| (一) 主要试剂与实验材料 |
| (二) 主要仪器设备 |
| (三) 实验方法 |
| 1. Fab形式抗体A16的表达及纯化 |
| 2. ELISA检测A16交叉反应活性 |
| 3. A16与去构象HIV-1 gp120的结合反应(gp120 reduction ELISA) |
| 4. 竞争ELISA(Competition ELISA) |
| 5. HIV-1假病毒的制备 |
| 6. 基于HIV-1假病毒的中和实验 |
| 7. 噬菌体表面展示肽库筛选A16所识别的模拟肽 |
| 8. 预测A16所识别的表位 |
| 9. 点突变分析对预测的A16结合位点进行验证 |
| 10. A16所识别表位的结构展示及分析 |
| 实验结果 |
| (一) Fab形式抗体A16的亲和纯化 |
| (二) 抗体A16反应活性的鉴定 |
| (三) 抗体A16具有广谱的中和活性 |
| (四) 抗体A16识别位于gp120上的CD4结合区域的构象表位 |
| (五) 抗体A16、b12、VRC01对中国HIV-1主要流行毒株中和活性的比较 |
| (六) 对抗体A16所识别的表位进行鉴定 |
| (七) A16表位与抗体b12及VRC01表位的比较 |
| (八) 抗体A16可变区(V区)基因序列分析结果 |
| 结果分析与讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、抗体工程研究进程及在控制病毒感染中的作用（论文参考文献）
- [1]新发病毒性传染病疫苗研发态势[J]. 梁慧刚,黄翠,向小薇,张永丽,陈新文. 军事医学, 2020(09)
- [2]两种弱毒疫苗对新发PRRSV-2的效力评价与PRRSV-2 NSP1β突变疫苗株、阻断单抗研制[D]. 韩广伟. 浙江大学, 2020(01)
- [3]抗H7N9禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及初步应用[D]. 杨帆. 浙江大学, 2020(02)
- [4]结核分枝杆菌抗原致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究暨烯醇化酶-1单克隆抗体制备与作用初步研究[D]. 李菲. 兰州大学, 2019
- [5]肿瘤靶向性新型溶瘤单纯疱疹病毒的理性设计及其抗肿瘤作用机制研究[D]. 罗勇. 厦门大学, 2019
- [6]多价双特异性抗体介导的ADCC清除HIV-1潜伏感染细胞及HIV-1感染者血浆ADCC作用的研究[D]. 孔德生. 中国疾病预防控制中心, 2018(01)
- [7]猪源噬菌体抗体库的构建与抗PRRSV抗体的筛选[D]. 辛英豪. 华中农业大学, 2018(01)
- [8]汉滩病毒包膜糖蛋白H-2Kb限制性CTL表位的筛选与鉴定[D]. 马瑞雪. 第四军医大学, 2017(03)
- [9]树鼩慢性感染乙肝病毒过程中肝组织病理学观察及枯否细胞变化意义的探讨[D]. 阮萍. 广西医科大学, 2013(10)
- [10]人源HIV-1广谱中和Fab抗体的鉴定[D]. 孟佳子. 北京协和医学院, 2013(11)