一、FEN 1基因反义阻断细胞株(FL FEN 1~-)的建立（论文文献综述）
戴芳[1]（2021）在《CMTM6表达促进肺癌增殖侵袭及机制研究》文中研究指明[目的]肺癌是世界上发病率和死亡率最高,增长最快的恶性肿瘤之一,是全球男性和女性癌症死亡的主要原因。肺癌病理类型包括非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）,超过85%的病例为非小细胞肺癌。非小细胞肺癌具有遗传和细胞异质性。虽然在肺癌的诊断和治疗上取得了长足的进步,但是NSCLC的总体治愈率和生存率仍然很低,尤其是在转移性疾病中。肺癌发生和转移的具体分子机制目前还不完全清楚。肺癌的发生和侵袭是一个复杂而动态的过程,涉及肿瘤组织的内在遗传异常及其与免疫系统的相互作用。鉴于此,深入研究肺癌的发生、发展和转移的机制,对开发有效的治疗措施、提高肺癌的生存率具有重要的临床价值和社会效益。近年来发现,CMTM6 基因（chemokine-like MARVEL transmembrane domain containing family member 6）与肿瘤免疫逃逸有关。此基因又名趋化素样因子超家族6。该基因位于3号染色体短臂2区2带3亚带,其编码的蛋白质产物具有四次跨膜蛋白超家族（TM4SF）和MARVEL结构域,因此与多种肿瘤密切相关。研究显示CMTM6和PD-L1共同定位于肿瘤细胞表面,呈正相关,CMTM6通过稳定肿瘤细胞表面PD-L1分子,从而使T细胞抑制,使肿瘤细胞逃脱T细胞杀伤。然而CMTM6和PD-L1的表达不完全呈正相关,表明CMTM6不只与PD-L1相关,可能还有其它的重要分子和CMTM6相互作用共同影响肿瘤预后。同时其它研究显示CMTM6在多种肿瘤组织中表达,与肿瘤预后不良有非常密切的关系。但在原发肺肿瘤中表达及与预后的关系尚未清楚,且CMTM6在肺癌发生发展中的功能及分子机制亦知之甚少。同时,CMTM6作为一种新的生物标志物,对其功能的研究还远远不够。为此本课题拟检测CMTM6在非小细胞肺癌中的表达情况,分析其表达与相关临床病理参数之间的关系;通过体内外实验,研究肺癌发生、发展和转移过程中的作用;探究CMTM6调节肺癌细胞增殖和侵袭的机制。[方法]1.利用免疫组织化学检测石蜡标本非小细胞肺癌组织、正常肺组织中CMTM6的表达,并分析CMTM6的表达与肿瘤分化、分期、转移和临床预后等相关临床病理参数的关系;2.建立干扰CMTM6的稳转肺癌细胞株,通过体外MTT实验,平板克隆形成实验,流式细胞检测凋亡检测肿瘤细胞的增殖能力;通过划痕实验检测肿瘤细胞的迁移能力;Transwell实验检测肿瘤细胞的侵袭能力。3.体内实验:用干扰CMTM6的稳转肺癌细胞株建立裸鼠皮下肺癌移植瘤模型,检测CMTM6在裸鼠体内对肺癌细胞增殖的影响;检测裸鼠心、肝、脾、肺、肾、大脑、大肠、小肠有无肿瘤侵袭。4.利用转录组测序筛选CMTM6差异表达基因,通过对敲低CMTM6的肺癌细胞和对照组肺癌细胞mRNA基因表达量的统计,找出差异表达基因;对差异基因进行GO功能富集和KEGG信号通路富集;构建蛋白质互作网络并用cytoscape软件进行了可视化,提取和CMTM6相互作用的核心基因;构建了差异基因-信号通路网络,提取主要作用信号通路的相关蛋白。5.差异表达基因验证:通过流式细胞术检测干扰CMTM6肺癌细胞周期分布;通过western blot检测干扰CMTM6后细胞周期相关蛋白P53,P21,P27,Cyclin A,Cyclin D,Cyclin E,CDK2,CDK4 和 ERK,pERK,AKT,pAKT 的表达情况。[结 果]一、CMTM6在肺癌组织中的表达1.免疫组化结果显示CMTM6阳性表达主要定位于细胞膜和细胞质,呈棕褐色或棕黄色。2.肺癌组织CMTM6蛋白表达水平（161.04±86.60）高于邻近正常肺组织（71.20±45.10）（P<0.05）。3.CMTM6表达与肿瘤T分期、肿瘤组织学类型和肿瘤浸润淋巴细胞相关（P<0.05）,与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、淋巴结浸润无关。4.Kaplan-Meier生存分析结果显示,CMTM6高表达患者的5年总体生存期明显短于低表达患者（P<0.01）。二、CMTM6促进肺癌细胞增殖和迁移、侵袭能力1.体外实验:MTT结果显示,CMTM6干扰的稳转肺癌株生长速度显着慢于对照组（P<0.01）。平板克隆形成实验显示,CMTM6干扰的稳转肺癌株克隆形成的数量显着少于对照组（P<0.05）。流式细胞术检测凋亡结果显示,CMTM6干扰稳转肺癌株凋亡率高于对照组（P<0.05）。划痕实验结果显示,CMTM6干扰的稳转肺癌株细胞迁移的速度明显减慢（P<0.05）。Transwell实验结果显示,CMTM6干扰稳转肺癌株侵袭细胞的数量明显少于对照组（P<0.05）。2.体内实验:裸鼠皮下成瘤实验表明,与对照组相比,CMTM6干扰的稳转肺癌株肿瘤生长速度较慢,肿瘤体积较小（P<0.05）。免疫组化结果显示,CMTM6干扰组的Ki-67阳性率（39.6%）显着低于对照组（76.4%）（P<0.05）。裸鼠心、肝、脾、肺、肾、大脑、大肠、小肠HE检测未见转移瘤。三、CMTM6调节肺癌细胞增殖和侵袭的机制1.转录组测序得到CMTM6差异表达基因4993个,上调基因2466个,下调基因2527个。2.对这些基因进行GO功能富集和KEGG信号通路富集,发现CMTM6差异表达基因在生物学过程主要富集在有丝分裂细胞周期相变,DNA复制和染色体分离。细胞组成主要富集在染色体,着丝粒区,染色体区和着丝粒。分子功能主要集中在作用于DNA的催化活性,核孔结构组成和微管蛋白结合。3.KEGG信号通路主要富集在DNA复制,细胞周期和碱基切除修复。4.蛋白质互作网络提取与CMTM6相互作用的核心基因10个,分别为UBC,TP53,PRDM10,HSP90AA1,TSPO,UBB,CDK1,TOP2A,CAD,CDK2。5.差异基因-信号通路网络得到主要作用信号通路的相关蛋白。作用P53信号通路的主要由TP53,CDK1,CDK2,CCND1,CCND3等。作用于细胞周期信号通路的主要有TP53,CDK1,CDK2,CDK6,CCNB1等。作用于DNA复制信号通路的主要有MCM2,MCM5,MCM7,POLE2,LIG1等。6.CMTM6差异表达的基因主要富集在细胞周期。7.流式细胞仪检测细胞周期结果显示,干扰CMTM6则使细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞不能进入G2/M期,抑制细胞增殖。8.western blot 检测细胞周期相关蛋白 P53,P21,P27,CyclinA,CyclinD,Cyclin E,CDK2,CDK4的表达,干扰CMTM6可以通过激活P53,进一步诱导P27基因的表达,从而抑制Cyclin A的活性,将细胞周期阻滞在G0/G1期。9.western blot 检测 ERK,pERK,AKT,pAKT 蛋白表达,结果显示 CMTM6干扰稳转肺癌株下调了 pERK的表达,抑制ERK的磷酸化,但对AKT没有影响。[结 论]1.非小细胞肺癌组织中CMTM6表达水平显着上调,CMTM6表达与肿瘤T分期、肿瘤组织学类型和肿瘤浸润淋巴细胞相关。2.CMTM6表达与肺癌预后呈负相关。3.干扰CMTM6抑制肺癌细胞的增殖、侵袭迁移能力。4.CMTM6促进肺癌细胞的增殖、侵袭迁移能力,其调控机制可能与P53介导细胞周期阻滞有关。CMTM6通过MAPK/ERK信号通路介导肺癌细胞的增殖和迁移。5.CMTM6可作为评估NSCLC预后的独立危险因素,为临床制定个体化NSCLC治疗方案提供依据。
张志莹[2]（2021）在《西黄丸治疗非小细胞肺癌疗效的系统评价及作用机制研究》文中提出研究背景:肺癌是临床常见的恶性肿瘤,在世界范围内,发病率在恶性肿瘤中居第二位,死亡率居第一位。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌的主要类型,发展新的治疗手段和方法,一直是NSCLC临床需要解决的一大难题。NSCLC的中医研究也在不断发展,西黄丸作为具有确切临床疗效的经典抗癌中药名方,对NSCLC的治疗也发挥了作用。既往的基础研究发现西黄丸可通过诱导肿瘤细胞凋亡、逆转上皮间质转化、调节免疫微环境等多种作用机制发挥抗肿瘤作用,但研究多围绕乳腺癌、胃癌,对于治疗肺癌的机制,仅涉及有效率、体内实验抑瘤率等,较为局限,因此,西黄丸治疗NSCLC的研究还存在较大空间,值得进一步深入。研究目的:本研究结合系统综述、网络药理学、体外实验、体内实验、转录组学等多种方法,研究西黄丸治疗NSCLC的相关机制,为西黄丸在临床治疗NSCLC提供更多的数据支持和科学依据。研究方法:1.首先通过系统综述和meta分析,评价西黄丸在临床随机对照试验中治疗NSCLC的效果,评价指标包括:近期客观有效率、临床症状改善、生活质量、不良反应等。2.通过网络药理学,对西黄丸抗NSCLC的活性成分和主要作用靶点进行预测。首先通过中药数据库BATMAN-TCM检索西黄丸中所有的活性成分及对应靶点,然后通过疾病数据库DisGeNET、GeneCards、OMIM检索NSCLC相关基因,将西黄丸的作用靶点和NSCLC疾病靶点两个数据集进行映射,筛选重复靶点,构建“西黄丸-NSCLC-靶点”数据集。将数据集导入String数据库进行蛋白质蛋白质互作网络,将获得的网络导入Cytoscape3.8.0软件中进行拓扑参数分析,获得“西黄丸-NSCLC-靶点”的核心作用靶点。然后使用Metascape工具对核心靶点进行生物功能注释,分析西黄丸抗NSCLC的主要信号通路和生物过程等。3.通过细胞实验和动物实验,进行西黄丸抗NSCLC的药效学验证。在细胞实验中,通过CCK-8实验、流式细胞术、Transwell实验检测西黄丸对小鼠Lewis肺癌细胞株LL/2增殖、凋亡、细胞周期、迁移能力和侵袭能力的影响。在动物实验中,以C57/BL6小鼠Lewis肺癌皮下瘤为模型,将小鼠分为对照组、西黄丸低剂量组（0.617g/kg,每日灌胃两次）、西黄丸中剂量组（1.233g/kg,每日灌胃两次）、西黄丸高剂量组（2.466g/kg,每日灌胃两次）、顺铂组（3 mg/kg,每周腹腔注射一次）,并另设无瘤的空白组。药物干预15天,观察小鼠的一般状态、皮下移植瘤体积及重量、体重及内脏系数,并通过HE染色观察肿瘤和肝脏的组织病理变化和皮下瘤的肺转移,通过Ki-67免疫组化染色观察对肿瘤增殖的影响,并通过流式细胞数检测小鼠脾脏淋巴细胞的 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+和 CD3+CD4+/CD3+CD8+免疫分型。4.通过转录组学方法,对西黄丸高剂量组和对照组的肿瘤组织进行RNA测序,进行mRNA差异分析和基因功能注释,分析西黄丸抗小鼠Lewis肺癌的主要信号通路和生物过程等。5.通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）和蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）,对网络药理学和转录组学筛选出的目标分子变化进行检测,包括热休克蛋白（heatshockprotein,HSP）家族、雌激素受体（estrogenreceptor,ER）、维甲酸X受体（Retinoid X receptor,RXR）、过氧化物酶体增殖激活受体（peroxisome proliferator activated receptor,PPAR）等。研究结果:1.Meta分析结果显示,西黄丸辅助治疗NSCLC能够提高近期客观有效率,改善患者的临床症状,提高患者的生活质量。但在改善肝肾功能异常、改善消化道症状和血液系统抑制方面,西黄丸辅助治疗并未有明显获益。2.网络药理学分析显示,西黄丸共检索到74个靶点可预测的活性成分,“西黄丸-NSCLC-靶点”的核心作用靶点共230个,包括HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA1A、ESR1、ESR2、RXRA、RXRB、RXRG、PPARG、PPARA 等。西黄丸抗 NSCLC 的相关KEGG通路有癌症通路、PI3K-Akt信号通路、内分泌抵抗、foxo信号通路、雌激素信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗、HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路、催乳素信号通路、Ras信号通路、黏着斑和非小细胞肺癌等。GO富集分析显示,西黄丸抗NSCLC涉及的主要生物过程有细胞对有机环状化合物的反应、细胞对激素刺激的反应、细胞对脂质的反应、凋亡信号通路、对类固醇激素的反应、细胞迁移的正调控、细胞死亡的正调控、细胞运动的正调控等。3.药效学实验显示,西黄丸含药血清在体外对Lewis肺癌细胞株LL/2并无显着的增殖抑制作用,西黄丸浸提液对LL/2有浓度依赖的抑制作用,作用24 h时,西黄丸浸提液对LL/2细胞的IC50为1.830 mg/mL。流式结果显示,作用24 h时,西黄丸浸提液对LL/2细胞有明显的促凋亡作用,能够促进LL/2细胞株向G2/M期转化。Transwell实验结果显示,作用24h时,西黄丸浸提液能够降低LL/2细胞株的迁移能力和侵袭能力,且这种作用呈浓度依赖性。在小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型中,西黄丸对皮下肿瘤的生长抑制作用具有浓度依赖性,其中西黄丸高剂量组能够抑制小鼠皮下瘤的生长,其剂量为临床等效剂量的2倍。肿瘤的病理结果显示,西黄丸高剂量组和顺铂组有大片的细胞坏死区。Ki-67免疫组化染色结果显示,西黄丸和顺铂均能降低Ki-67阳性肿瘤细胞的个数,西黄丸的这种作用与浓度关系不大。肝脏的病理结果显示,各组的肝组织均为正常的肝实质,无明显异常。脾细胞流式分型结果显示,各组小鼠脾脏淋巴细胞中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3+CD4+/CD3+CD8+未见显着统计学差异。4.对西黄丸高剂量组和对照组的皮下瘤进行转录组学测序,结果筛选出406个差异基因,其中130个基因表达上调,276个基因表达下调,差异基因包括:Hspb7、Hspb1、Hspb6等。对差异基因进行KEGG通路富集分析,结果显示,显着性改变明显的信号通路有:肿瘤坏死因子（tumornecrosis factor,TNF）信号通路、雌激素信号通路、胰岛素分泌、环鸟苷酸依赖性蛋白激酶（cyclic guanosine monophosphate-dependent protein kinase,cGMP-PKG）信号通路、脂肪细胞中的脂肪分解调节、脂肪细胞因子信号通路、催产素信号通路、过氧化物酶体增殖激活受体信号通路等。5.PCR和WB结果显示,西黄丸能够降低小鼠Lewis肺癌肿瘤组织中Hspb6、Hspb7、Hspb1、Hspb2、Hspa1a、Hspa8、Hsph1 和的 mRNA 表达水平,且能够降低 HSPB7、HSP27、HSP70、HSPH1蛋白的表达水平,升高HSC70的蛋白质表达水平,而不影响HSP20、HSP90的蛋白质水平。西黄丸能够降低小鼠Lewis肺癌肿瘤组织中Esr1、Rxra、Krt19、Ppara、Ppard和Pparg的mRNA表达水平,并降低ER、RXRα蛋白的表达,升高PPARδ和PPARγ的蛋白表达,对KRT19和PPARα的表达水平无明显影响。研究结论:1.西黄丸辅助治疗NSCLC能够提高近期客观有效率,改善患者的临床症状,提高患者的生存质量。2.网络药理学实验和转录组学实验显示,西黄丸通过多靶点、多通路作用于NSCLC,核心作用靶点包括HSP家族、ER等。3.西黄丸在体外实验和体内实验中,均表现出抗小鼠Lewis肺癌的作用,在体内实验中无明显毒性,其有效剂量为临床等效剂量的2倍。其抗小鼠Lewis肺癌的机制可能与降低HSP27、HSP70、HSPH1、ER的mRNA和蛋白质表达水平,升高PPARγ的蛋白质表达水平相关。
韩玮[3]（2021）在《苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究》文中进行了进一步梳理目的:观察苦豆碱（ALO）对结直肠癌（CRC）细胞生物学行为的影响,研究苦豆碱在CRC中对miR-296-5p和转导和转录激活因子3（STAT3）的表达影响,从而进一步探讨苦豆碱抗CRC的作用及其潜在机制。方法:1.用不同浓度的ALO处理细胞,MTT法检测CRC细胞增殖。2.qRT-PCR检测不同浓度的ALO处理CRC细胞中miR-296-5p的表达。3.利用生物信息网站TargetScan V7.2对基于miRNA序列的靶基因进行预测,并采用双荧光素酶报告分析（dual-luciferase reporter assay）对预测结果进行验证。4.在室温下转染或共转染miR-296-5p mimics、过表达 STAT3 质粒、miR-296-5p inhibitor、siSTAT3,并且予以 ALO 处理。采用 qRT-PCR 检测处理后CRC细胞miR-296-5p的表达情况,Western blot检测STAT3的表达情况。5.采用细胞克隆形成实验检测ALO处理后转染的HCT116和SW480细胞增殖影响情况,使用流式细胞仪检测细胞凋亡影响情况,最后采用western-blot检测细胞凋亡蛋白相关影响情况。6.采用划痕愈合实验检测ALO对采用不同转染方案的HCT116和SW480细胞迁移影响,使用Transwell侵袭试验细胞侵袭影响。7.采用western-blot检测处理后EMT相关蛋白N-cadherin和E-cadherin的表达影响况。结果:1.采用MTT法检测,结果表明ALO对不同CRC细胞增殖具有不同程度抑制作用,并且具有剂量依耐性。其中针对不同的CRC细胞抑制作用不同,以对SW480细胞增殖的抑制作用最强,但对HCT116细胞增殖的抑制作用最弱,并且SW480细胞的IC50为 0.611mmol/L,而 HCT116 细胞的 IC50 为 1.141mmol/L。2.通过 StarBasev3.0 分析比较了结直肠腺癌和正常样本miR-296-5p,明确了 miR-296-5p再结直肠腺癌中低表达,再通过 qRT-PCR 验证了 CRC 细胞系（SW480、HCT116、HT29、SW620）内 miR-296-5p 的表达低于人肠上皮细胞HIEC,并且miR-296-5p在SW480细胞表达最高,HCT116表达最低。选择SW480细胞和HCT116细胞做为代表,经过ALO处理24h后,检测两者miR-296-5p表达,结果表明ALO能够上调SW480细胞和HCT116细胞miR-296-5p的表达,并且呈现剂量依赖性。3.采用TargetScan V7.2对miR-296-5p进行靶基因预后,结果提示STAT3是靶基因,并且目标位点位于3’-UTR。构建野生型（STAT3-WT）和突变型（STAT3-MUT）基因靶点STAT3的3’UTR-荧光素酶表达载体。对miR-296-5p表达最低的HCT116细胞行miR-296-5p mimic共转染,对miR-296-5p表达最高的SW480细胞进行miR-296-5p inhibitor共转染。双荧光素酶报告基因系统分析后,结果提示与STAT3-MUT共转染的细胞相比,miR-296-5p mimic和STAT3-WT共转染的HCT116细胞的荧光素酶活性明显抑制,而与miR-296-5p inhibitor和STAT3-WT共转染的SW480细胞的荧光素酶活性增强,从而证明STAT3是miR-296-5p靶基因。4.miR-296-5p mimics和ALO都抑制了 CRC细胞中STAT3的表达,但miR-296-5p inhibitor增强了 STAT3的表达。从而得出结论:上调MIR-296-5p和ALO处理均抑制STAT3的表达。5.上调miR-296-5p和ALO抑制了 CRC细胞的增殖以及Bcl-2的表达,但促进凋亡以及Bax表达,并且这些作用都通过过表达的STAT3逆转。实验结果表明ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC细胞增殖和凋亡。6.上调miR-296-5p和ALO抑制了 CRC细胞的迁移、侵袭,并且通过过表达的STAT3逆转。实验结果表明ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC细胞迁移和侵袭。7.上调miR-296-5p和ALO抑制CRC细胞的N-cadherin的表达,但促进E-cadherin的表达,这些作用可以被过表达的STAT3逆转,结果表明:ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控EMT相关蛋白的表达。结论:ALO以剂量依赖性的方式抑制CRC细胞增殖。miR-296-5p在CRC组织和细胞中低表达,ALO促进miR-296-5p的表达。STAT3是mi R-296-5p的靶基因,上调miR-296-5p和ALO均抑制STAT3的表达。ALO可以通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC的增殖、凋亡、迁移、侵袭和EMT。
吴勇[4]（2021）在《长链非编码RNA Linc00909在结直肠癌中的表达及其对放化疗敏感性的影响》文中认为结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是一种最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均居恶性肿瘤第三位,且过去的10年里在我国呈逐年上升趋势,已严重影响国人的身心健康。对于局部进展期中低位直肠癌（Local Advanced Rectal Cancer,LARC）的患者,术前接受新辅助放化疗（Neo-adjuvant chemoradiotherapy,NCRT）,再行根治性手术治疗已成为标准治疗方案。研究表明,采取上述治疗方案在直肠癌的肿瘤缩小、降期、提高保肛率以及减少局部复发等方面具有明显优势。但部分患者因放化疗抵抗引起治疗失败、疾病复发,进而导致预后较差。因此探究直肠癌对放化疗敏感机制并寻找放化疗抵抗的新型治疗靶点用以增强放化疗敏感,使患者获得更大收益。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）是指一类转录本长度大于200bp,但不编码蛋白质的长链RNA分子,能够在转录前、转录及转录后等多种层面上调控相关基因的表达,从而发挥关键的生物学功能。近年来,越来越多的研究结果表明LncRNA与结直肠癌的发生、发展、耐药、复发及转移存在密切关系,并且可以作为结直肠癌诊断及预测患者预后潜在的分子标志物和治疗靶点。现有研究已经揭示了部分LncRNA在结直肠癌中的表达水平异常,并且其中一部分有较为深入的研究报道,但还有大部分LncRNA在结直肠癌发生、发展过程中的生物学功能和分子机制尚不明确。Linc00909是一个新的LncRNA分子,目前相关的研究报道表明其可以作为一种重要的致癌性LncRNA,同时在结直肠癌组织呈现高表达并提示不良预后,但其是否参与调控直肠癌NCRT敏感性,目前尚未见报道。本研究首先通过分析Linc00909在结直肠癌中表达及与预后关联性,并在体内和体外初步探讨了改变Linc00909表达对放化疗敏感性的影响及其可能的分子机制。研究具体分为以下两个部分第一部分Linc00909在结直肠癌及放化疗组织中的表达及临床意义研究目的探讨Linc00909在直肠癌NCRT抵抗组织和敏感组织之间以及结直肠癌组织和癌旁组织之间的表达差异,分析该LncRNA的表达与患者术后生存预后及放化疗敏感性是否具有相关性,为证明其能否作为预测放化疗敏感性和评估患者预后的分子标记物提供理论依据。方法收集2017年1月至2017年12月福建医科大学附属协和医院术前接受新辅助放化疗和根治性切除术的患者,收集手术切除获得的直肠癌NCRT抵抗组织和敏感组织标本30例（NCRT抵抗组织19例,NCRT敏感组织11例）,采用RT-qPCR实验,检测Linc00909在两组间的表达水平;收集2017年1月至2017年12月福建医科大学附属协和医院196对结直肠癌患者癌组织和相邻癌旁组织标本;采用RT-qPCR实验,检测Linc00909在两组间的表达水平,同时对相应患者进行随访,获得对应的临床信息和随访信息,统计分析Linc00909与患者术后生存预后及临床病理信息之间的相关性。Linc00909的相对表达水平用ΔCt表示,即ΔCt越小,相对表达水平越高。结果RT-qPCR结果表明,与NCRT敏感组织（ΔCt=10.02±0.73）相比,Linc00909在NCRT抵抗组织（ΔCt=7.59±0.37）中的表达水平显着上调（P<0.01）;而且在癌组织（ΔCt=8.78±0.16）中的表达水平明显高于癌旁组织（ΔCt=10.64±0.12）（P<0.001）。临床病理信息相关性分析结果显示,Linc00909的表达水平与p M分期显着正相关。生存分析结果表明,Linc00909的表达水平与患者的总生存时间和无病生存时间呈负相关。COX回归分析表明,神经侵犯（HR=3.109,95%CI:1.245-7.764,P=0.015）和Linc00909的表达水平（HR=5.067,95%CI:1.629-15.765,P=0.005）与患者OS的独立相关;Linc00909的表达水平（HR=5.335,95%CI:2.467-7.764,P<0.001）与患者DFS的增加显着相关。结论Linc00909在NCRT抵抗组织中明显高表达;也在癌组织中呈现表达水平上调的状态;Linc00909的表达水平与患者的OS和DFS呈负相关,并且可以作为影响患者OS和DFS的独立危险因素。Linc00909有潜力可以作为预测患者放化疗敏感性及评估患者预后的分子标记物。第二部分Linc00909通过增强结直肠癌细胞干细胞样特性影响放化疗敏感性目的探索过表达Linc00909基因对结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响,并初步探讨其影响结直肠癌细胞放化疗敏感性可能存在的分子机制。方法构建Linc00909慢病毒载体并转染结直肠癌细胞株SW620、DLD1建立过表达Linc00909稳转细胞株;采用RT-qPCR检测Linc00909在转染细胞中的表达情况;通过CCK-8和克隆实验检测其对细胞增殖的影响;用流式细胞术分析其对细胞周期和细胞凋亡影响;干细胞成球实验检测过表达Linc00909对细胞成球能力的影响;用CCK-8法、流式细胞术测定过表达Linc00909后结直肠癌细胞对5-FU（5-Fluorouracil,5-氟尿嘧啶）和放疗的敏感性差异。再通过裸鼠皮下移植瘤实验评估过表达Linc00909基因对结直肠癌细胞体内成瘤的影响。最后通过生物信息学分析预测可能与Linc00909相互作用的miRNA及其下游靶基因,利用RT-qPCR和Western-blot实验初步探索Linc00909以ce RNA的方式在结直肠癌细胞放化疗敏感性中的分子机制。结果RT-qPCR结果显示过表达组与空载慢病毒组（Vector）以及对照组（Control）细胞比较,Linc00909表达水平明显上调（P<0.01）。过表达Linc00909后,结直肠癌细胞的增殖能力、克隆形成能力、抗凋亡能力、细胞成球能力和对5-FU和放疗的抵抗能力均显着增强;能诱导结直肠癌细胞周期转变促进细胞增殖;并且可以促进结直肠癌细胞在裸鼠体内的生长。通过生物信息学分析,我们预测出miR-625-5p可能与Linc00909存在结合位点。RT-qPCR结果表明,过表达Linc00909后结直肠癌细胞系SW620和DLD1中miR-625-5p的表达水平下调。同时,通过生物信息学分析我们预测出SOX2是miR-625-5p可能的靶基因之一。RT-qPCR和Western-blot结果表明,过表达Linc00909后结直肠癌细胞系SW620和DLD1中SOX2的表达水平显着上调。结论Linc00909可以影响结直肠癌细胞的增殖、克隆形成、凋亡、周期调控、成球能力、对5-FU和放疗的敏感性;并且过表达Linc00909基因可以促进结直肠癌细胞在裸鼠体内的生长。Linc00909可能通过吸附miR-625-5p调节下游靶基因SOX2表达影响结直肠癌细胞对放化疗敏感性。Linc00909可以作为结直肠癌潜在的治疗靶点。
祖玛丽[5]（2021）在《绞股蓝皂苷gypenoside L和gypenoside LI抑制乳腺癌细胞增殖及诱导凋亡的机制研究》文中研究说明研究目的:绞股蓝Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino属于传统中药和民族药,在我国西南少数民族地区应用广泛,是传统壮医的常用草药之一,用于治疗各种疾病,壮药名为gocaetmbaw。绞股蓝皂苷gypenoside L和gypenoside LI是从绞股蓝中分离提取的皂苷类活性成分,为一对同分异构体。已有研究表明gypenoside L和gypenoside LI对多种癌细胞的生长具有抑制作用,但其在乳腺癌中的药理作用及其机制尚未见报道。2020年世卫组织国际癌症研究机构统计显示乳腺癌发病率居全球第一,女性生命健康受到严重威胁,目前对乳腺癌的治疗方式主要有手术、内分泌治疗、化疗、放疗以及靶向治疗等。由于缺乏有效的靶向治疗,高度转移性三阴乳腺癌（TNBC）的治疗仍具有很大的挑战性。E2F1转录因子为E2F家族成员之一,参与细胞周期调控和细胞凋亡。临床数据表明E2F1异常上调经常发生在各种类型的癌症中,与恶性进展和不良预后有关。ERCC6L是SNF2家族成员之一,参与染色质重塑、DNA重组和DNA修复,与多种癌症进展有关。因此,本课题目的是探究绞股蓝皂苷gypenoside L和gypenoside LI对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的抑制作用及分子机制。研究方法及结果:细胞表型实验证明gypenoside L和gypenoside LI均可抑制乳腺癌细胞增殖和迁移,还可诱导内源性细胞凋亡,而且gypenoside LI的药效要强于gypenoside L,尤其对于三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231。RNA-seq 测序、KEGG 和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）发现gypenoside L和gypenoside LI均可通过调控细胞周期发挥作用。流式周期检测发现gypenoside L可诱导乳腺癌细胞周期阻滞在G2/M期,gypenoside LI使细胞周期阻滞在G0/G1期。GO分析发现gypenoside L与细胞分裂、染色体分离有关;而gypenoside LI主要影响DNA复制。Metascape在线工具分析发现gypenoside LI下调的差异基因集或周期相关基因集主要受E2F1调控,转染实验及rescue实验证实gypenoside LI可通过抑制E2F1使细胞周期阻滞在G0/G1期,还可通过下调E2F1抑制ERCC6L的表达。而gypenoside L则不调控E2F1的表达。此外,gypenoside LI与siE2F1联合处理可发挥协同作用,使gypenoside LI在低浓度条件下便可杀死肿瘤细胞。而gypenoside L虽然不能抑制E2F1的表达,但可下调ERCC6L,结合在线数据库推测这可能与有丝分裂有关。此外,Western blot结果显示gypenoside L和gypenoside LI均不能改变p53的表达。由此可见,gypenoside L和gypenoside LI这对同分异构体发挥抗肿瘤作用并不依赖p53途径。结论:本研究证明gypenoside L和gypenoside LI可抑制乳腺癌细胞增殖、阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用均不依赖p53途径,但是二者的作用机制却有所不同:gypenoside L可使乳腺癌细胞周期阻滞在G2/M 期,而 gypenoside LI阻滞在G0/G1期;同时,gypenoside LI可通过E2F1下调ERCC6L的表达,而gypenoside L却不改变E2F1的表达,结合数据库分析推测下调ERCC6L可能与有丝分裂途径有关。
刘超[6]（2020）在《MG53与胃泌素缓解急性肾损伤的研究》文中提出急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）已成为全世界范围内的公共卫生问题,它起病急、发病率高且无特效治疗药物,具有很高的死亡风险,而其预后不良则可进展至慢性肾脏病,给我们带来了沉重的医疗负担。近年来,由于心血管介入诊断治疗与碘造影剂的广泛运用,以及创伤、休克的发生和肾移植手术的开展,造影剂诱导的AKI（contrast-induced acute kidney injury,CI-AKI）以及缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）诱导的AKI成为两类比较常见的AKI。身体是一个有机整体,我们之前发现其他器官如骨骼肌和胃肠道对肾脏有一定的“对话”作用。当发生AKI时,骨骼肌和胃肠道可能对损伤的肾脏有什么影响呢?因此,我们围绕这一思路,尝试了以下两个主要部分的探究:（1）肌肉因子MG53（Mitsugumin 53）缓解造影剂诱导的急性肾损伤的作用与机制研究;（2）胃肠激素胃泌素缓解缺血再灌注诱导的急性肾损伤的作用及机制研究。第一部分MG53缓解造影剂诱导的急性肾损伤的作用与机制研究研究背景:MG53是一种新发现的由骨骼肌分泌的膜修复蛋白,通过其膜修复功能,MG53能缓解多种器官的损伤;CI-AKI是临床上由于碘造影剂（contrast media,CM）的使用而引起的常见肾脏并发症。有文献报道在CI-AKI中,碘造影剂对肾小管细胞的毒性作用可能是由其对细胞膜的直接损伤而引发。因此,我们提出假设:MG53可能通过其细胞膜修复作用而缓解CI-AKI。目的:探究MG53对CI-AKI是否具有缓解作用及其潜在的作用机制,为临床上治疗及预防CI-AKI提供可能的新策略。方法:（1）建立大鼠CI-AKI模型,检测大鼠血肌酐（Serum creatinine,SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）的含量,验证建模是否成功;通过免疫印迹（Western Blot,WB）检测CI-AKI大鼠血浆和肾脏中MG53蛋白的含量变化;通过免疫组化染色检测CI-AKI大鼠肾脏内源性MG53的定位变化;通过免疫荧光观察外源性荧光标记重组人源MG53蛋白（recombinant human MG53,rh MG53）能否在CI-AKI大鼠肾脏聚集。（2）通过检测SCr与BUN水平,并通过大鼠肾脏切片苏木素伊红（hematoxylin-eosin,H&E）染色,明确rh MG53预处理对CI-AKI有无缓解作用。（3）通过TUNEL染色,探究CI-AKI后大鼠肾小管细胞凋亡的变化,并研究rh MG53预处理有无缓解凋亡的作用。（4）建立体外碘普罗胺诱导肾近端小管（renal proximal tubular,RPT）细胞损伤的细胞模型,采用TUNEL染色验证碘普罗胺对RPT细胞凋亡的影响,并研究rh MG53预处理对其有无保护作用。（5）通过细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）检测rh MG53对碘普罗胺诱导的RPT细胞损伤有无缓解作用。（6）通过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）释放实验与FM1-43荧光染色检测碘普罗胺对RPT细胞膜的损伤作用,并研究rh MG53预处理对RPT细胞膜是否有保护作用。（7）通过免疫荧光染色检测MG53在RPT细胞中的定位分布。（8）通过q PCR与WB分别检测MG53的m RNA及蛋白水平变化。（9）通过免疫荧光染色观察MG53与Annexin V（一种在凋亡细胞外膜上标记磷脂酰丝氨酸的敏感且特异的探针）的共定位情况。结果:（1）大鼠CI-AKI模型被成功建立,其血浆MG53蛋白含量减少而肾脏MG53蛋白增多,提示MG53从血浆向肾脏富集;MG53在大鼠肾小管细胞中存在表达,而CI-AKI后MG53向肾小管管腔侧聚集;外源性荧光标记rh MG53在CI-AKI大鼠肾脏聚集。（2）SCr、BUN水平以及H&E染色分别表明rh MG53预处理能够缓解CI-AKI的肾功能损伤及肾脏病理损伤。（3）CI-AKI大鼠肾小管细胞凋亡显着增加,rh MG53预处理可减少其中的细胞凋亡。（4）碘普罗胺可导致培养的RPT细胞凋亡,rh MG53预处理可缓解碘普罗胺诱导的RPT细胞凋亡。（5）碘普罗胺以浓度和时间依赖性方式导致RPT细胞损伤,而rh MG53预处理可缓解该损伤。（6）碘普罗胺导致RPT细胞膜损伤,而rh MG53以浓度依赖性方式缓解碘普罗胺诱导的膜损伤。（7）MG53在RPT细胞膜与胞浆均有分布,但碘普罗胺处理后,MG53向RPT细胞膜聚集。（8）碘普罗胺处理后RPT细胞MG53的m RNA及蛋白表达无明显改变,但碘普罗胺损伤的RPT细胞可大量摄取rh MG53蛋白。（9）MG53与Annexin V存在共定位,提示MG53通过与磷脂酰丝氨酸结合发挥其膜修复作用。结论:肌肉因子MG53可以通过修复细胞膜损伤及减少细胞凋亡来缓解CI-AKI,MG53可能成为治疗或预防CI-AKI的有效药物。第二部分胃泌素缓解缺血再灌注诱导的急性肾损伤的作用及机制研究研究背景:急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）的另一类主要原因为缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤;胃肠道与肾脏之间存在密切的调节联系,“胃肾轴”是近年来被提出的新颖概念,有文献报道,胃肠激素胃泌素参与了对肾脏排钠功能的调节并进一步参与血压调控。然而,胃泌素是否也能在I/R损伤的肾脏中发挥一定的作用仍不清楚。因此,我们提出假设:胃泌素可能对肾脏I/R损伤有一定的保护作用。目的:探究胃泌素对肾脏I/R损伤的作用及其机制,为临床预防及治疗肾脏I/R损伤提供新的可能的方法。方法:（1）构建肾脏I/R损伤的小鼠模型,分别通过q PCR、WB及IHC检测肾脏I/R后胃泌素受体（也称胆囊收缩素B型受体,cholecystokinin B receptor,CCKBR）的表达及定位有无改变。（2）小鼠肾脏I/R前给予胃泌素,通过检测肾功能指标SCr与BUN、肾脏切片H&E与过碘酸-雪夫（periodic acid-Schiff,PAS）染色以及小管损伤标志物肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1,KIM-1）的表达,判断胃泌素预处理能否缓解肾脏I/R损伤。（3）通过TUNEL染色及caspase-3活性测定,探究胃泌素对I/R诱导的细胞凋亡有无影响,并通过WB检测胃泌素对凋亡上游分子Akt磷酸化水平的影响。（4）建立体外HK-2（human kidney-2）细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）损伤模型,CCK-8及LDH检测胃泌素对H/R处理的HK-2细胞活力的影响。（5）通过WB检测体外H/R处理后HK-2细胞CCKBR蛋白的表达变化。（6）通过TUNEL染色及caspase-3活性测定,探究胃泌素对H/R处理的HK-2细胞凋亡的影响。（7）通过二氢乙锭（dihydroethidium,DHE）染色、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）及丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平测定,探究胃泌素对H/R处理的HK-2细胞氧化应激的影响。（8）通过WB检测胃泌素对HK-2细胞PI3K、Akt及Bad磷酸化的影响。（9）通过CCK-8检测渥曼青霉素（PI3K抑制剂）及Akt抑制剂VIII能否阻断胃泌素介导的HK-2细胞活力保护作用。结果:（1）小鼠肾脏I/R损伤后,CCKBR的m RNA及蛋白水平均显着上调,CCKBR在肾小管细胞膜及胞浆均有分布。（2）小鼠肾脏I/R前给予胃泌素,缓解了I/R导致的SCr及BUN的升高幅度,缓解了肾小管病理损伤,减少了小管损伤标志物KIM-1的增高幅度。（3）胃泌素预处理缓解了I/R诱导肾小管细胞凋亡,且胃泌素促进肾组织Akt的磷酸化水平。（4）胃泌素在常氧条件下对HK-2细胞活力无明显影响,但以浓度依赖性方式缓解H/R导致的HK-2细胞活力损伤,且该保护作用能被胃泌素特异性拮抗剂CI-988阻断。（5）H/R处理后,HK-2细胞CCKBR蛋白的表达显着上调。（6）胃泌素缓解H/R诱导的HK-2细胞凋亡及细胞氧化应激。（7）胃泌素预处理H/R损伤的HK-2细胞后,PI3K、Akt及Bad磷酸化水平增加。（8）渥曼青霉素（PI3K抑制剂）与Akt抑制剂VIII可阻断胃泌素对HK-2细胞活力的保护作用。结论:胃肠激素胃泌素可通过PI3K/Akt/Bad通路缓解I/R诱导的肾小管细胞凋亡,从而缓解I/R诱导的急性肾损伤,胃泌素可能成为临床预防或治疗急性肾损伤的潜在药物。研究背景:肾损伤与高血压之间存在极为密切的关系,血管紧张素II 1型受体（angiotensin II type 1 receptor,AT1R）被认为是高血压治疗的关键靶点。分选蛋白（sorting nexins,SNXs）是一组以含有PX（phox homology）结构域为特征的胞内物流系统蛋白,它们在蛋白质分选和运输的调控中起关键作用。有文献报道分选蛋白1（sorting nexin 1,SNX1）参与肾脏多巴胺D5受体的分选和运输,而血管紧张素和多巴胺是血压调节中相互拮抗的系统,SNX1是否也参与了AT1R的分选和运输仍不清楚。因此,我们提出假设:SNX1缺失可能导致血管平滑肌中AT1R的分选及运输障碍,从而导致AT1R含量增多、血管收缩功能增强及高血压。目的:探究SNX1是否参与血管平滑肌细胞中AT1R的分选和运输,为高血压的预防与治疗提供新思路。方法:（1）通过CRISPR/Cas9技术构建基于C57BL/6背景的SNX1基因敲除(Snx1-/-)小鼠,分别从DNA、m RNA及蛋白水平层面验证小鼠的基因型。（2）采用尾套法测量Snx1-/-小鼠及其同窝野生型小鼠的收缩压、舒张压及平均动脉压水平。（3）通过肠系膜血管环实验,检测Snx1-/-小鼠肠系膜动脉对苯肾上腺素、硝普钠及血管紧张素II的反应性变化。（4）通过WB检测Snx1-/-小鼠动脉组织中AT1R、AT2R及D5R的蛋白表达变化;通过免疫荧光染色共定位分析探究野生型小鼠动脉组织中AT1R与SNX1有无共定位。（5）在A10细胞中敲低SNX1后,检测AT1R蛋白含量的变化及其下游Ca2+信号变化;通过免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）检测A10细胞中AT1R与SNX1的有无结合。（6）在A10细胞中敲低SNX1后,检测AT1R的m RNA水平变化;用放线菌酮（cycloheximide,CHX）抑制新蛋白从头合成后,检测SNX1是否影响AT1R蛋白的衰减。（7）用CHX抑制新蛋白从头合成后,再分别抑制溶酶体及蛋白酶体途径,探究AT1R蛋白的降解途径。结果:（1）Snx1-/-小鼠被成功构建,其收缩压、舒张压及平均动脉压较其同窝野生型小鼠均显着增高。（3）Snx1-/-小鼠肠系膜动脉对苯肾上腺素、硝普钠的反应性未发生显着改变,但其对血管紧张素II的反应性显着增强。（4）Snx1-/-小鼠主动脉组织中AT2R与D5R的蛋白表达较对照组未见明显改变,但其AT1R的表达显着增加,且WT小鼠主动脉中AT1R与SNX1存在共定位。（5）在A10细胞中敲低SNX1后,AT1R蛋白含量显着增加,且其下游Ca2+信号增强,且A10细胞中AT1R与SNX1存在结合。（6）在A10细胞中敲低SNX1后,AT1R的m RNA水平无明显变化,而用CHX进一步抑制新蛋白从头合成后,在SNX1敲低的A10细胞中,AT1R蛋白衰减显着减慢。（7）用CHX抑制新蛋白从头合成,并用clasto-乳胞素β-内酯（clasto-lactacystinβ-lactone,CLBL）抑制蛋白酶体降解途径,AT1R蛋白的降解进一步被抑制。结论:SNX1缺失可导致血管平滑肌细胞中AT1R的分选和运输异常、AT1R在蛋白酶体系统中的降解减少,进而导致AT1R含量增加及血管收缩性增强,最终导致血压升高。
王海洋[7]（2020）在《三氧化二砷抑制肝癌转移及肝癌干细胞的作用与机制研究》文中研究表明全球肝细胞癌的每年新发病例数约为84万,而死亡病例则高达每年78万,其肿瘤相关死亡率在恶性肿瘤中排名前三。这不仅由于晚期肝癌向远端转移的倾向更高,有效治疗手段和药物的缺乏也是导致其不良预后的主要原因。寻找对晚期肝癌安全有效的治疗方案是肝癌研究中亟待解决的难题。在不断探索新的分子靶向药物和免疫治疗的同时,“老药新用”的策略不失为一个更具疗效指向性、更低成本、更高成功率的探索思路。在晚期肝癌的临床研究中,传统中药三氧化二砷（Arsenic Trioxide,ATO）的经验性使用最终被证实疗效显着便是一个成功的案例。三氧化二砷是被中国及美国FDA批准的治疗急性早幼粒细胞白血病（Acute Promyelocytic Leukemia,APL）的一线用药,由于其作用靶点明确,作用方式直接,使得这一血液系统恶性肿瘤得到了高达90%的治愈率。在后续诸多实体瘤的临床试验中,三氧化二砷对晚期肝癌患者表现出了良好的治疗效果。但与其在白血病中的作用机制非常明确不同,三氧化二砷对晚期肝癌的作用靶点及其机制尚未得到阐明,这在一定程度上限制了其应用的安全性和疗效的提高。由于晚期肝癌通常伴有转移,肿瘤细胞侵犯门静脉、局部淋巴结,或远端器官。而越来越多的研究表明转移发生的元凶是肿瘤组织中的一小群处于更高层级的、具有高度自我更新及多向分化能力的、可以在转移部位重建肿瘤组织的肿瘤细胞,这一小群细胞被定义为“肿瘤干细胞”（Cancer Stem Cells,CSCs）。根据三氧化二砷的分子特性和临床经验性使用的疗效特征,我们推测三氧化二砷在晚期肝癌的治疗作用可能与抑制肝癌干细胞有关。因此,本研究主要围绕三氧化二砷是否抑制肝癌干细胞以及如何调控肝癌干细胞等系列问题展开探索。首先为了论证三氧化二砷是否对肝癌干细胞发挥调控作用,我们利用多种动物模型,包括小鼠皮下成瘤模型、二次移植模型及肝脏原位荷瘤肺转移模型,考察三氧化二砷对肝癌干细胞体内功能的影响。结果显示三氧化二砷可以在动物体内抑制肝癌干细胞介导肿瘤启动、肿瘤复发及远端转移的能力,甚至可以在肝癌肺转移小鼠模型中将小鼠的中位生存时间从32天延长至41天,显着改善小鼠生存状态;之后我们利用多个肝癌细胞系,以及通过肿瘤干细胞表面标志富集或通过肿瘤成球富集得到的肝癌干细胞样细胞,进一步探究了三氧化二砷在体外对肝癌干细胞相关表型及功能的作用,包括流式细胞术检测肿瘤干细胞表面标志、实时定量PCR检测干性基因的表达,耐药性质、肿瘤干细胞球形成能力以及Transwell侵袭能力的评估等。最终证实了三氧化二砷可以抑制肝癌干细胞相关的多种特性与功能。在上述结论的基础上,为了探讨三氧化二砷发挥作用的分子机制,我们进一步利用高通量基因芯片检测,筛选鉴定三氧化二砷作用于肝癌细胞的生物靶分子。我们发现三氧化二砷显着下调肝癌细胞微小染色体维持蛋白7（Minichromosome maintenance protein 7,MCM7）的表达,这一下调作用在多个肝癌细胞系以及小鼠皮下肿瘤原位注射模型中均得到验证;然而MCM7是否是介导三氧化二砷对肝癌干细胞作用的关键靶分子?我们进一步利用MCM7低表达的肝癌细胞株,重复了上述小鼠肝脏原位荷瘤肺转移实验及部分体外实验,发现MCM7的下调表达可使肝癌肺转移率从64.7%下降至30%,且显着抑制肝癌干细胞在体外的相关表型与功能,证实了MCM7对肝癌转移及肝癌干细胞的重要调控作用。而MCM7在肝癌细胞中的过表达则可抵消三氧化二砷对肝癌干细胞成球的抑制作用,从而明确了MCM7是介导三氧化二砷作用的关键分子。在此基础上,我们还对以上研究结果进行了临床验证,将80例肝癌患者的肿瘤组织及癌旁组织进行MCM7的免疫组化染色,发现MCM7在考察的所有患者的肝癌组织中都较癌旁组织呈显着的核内高表达,并且MCM7的表达水平与肝癌进展及预后密切相关。这一结论为解释三氧化二砷的临床治疗效果提供了新的理论依据,对指导三氧化二砷更精准高效的应用也具有重要的意义。最后,为了明确三氧化二砷对MCM7分子的调控机制,我们利用免疫沉淀技术阐明了在肝癌细胞中存在血清反应因子（serum response factor,SRF）/MCM7复合物,以及该复合物通过SRF与MCM7启动子区结合调控MCM7转录的现象;利用有机砷荧光探针与MCM7蛋白芯片反应,确定了三氧化二砷的直接作用靶点为MCM7蛋白;双荧光素酶报告系统进一步阐明三氧化二砷通过抑制SRF/MCM7复合物对MCM7的转录进行调控,从而下调MCM7的表达。综上,我们的研究证实了三氧化二砷通过下调MCM7分子对肝癌转移及肝癌干细胞发挥抑制作用;阐明了三氧化二砷对MCM7的下调是通过与MCM7结合进而抑制SRF/MCM7复合物对MCM7转录调控而实现的。此系列研究结果为三氧化二砷在晚期肝癌的临床应用提供了新的理论支持,为指导其更加安全、科学、精准、高效的使用奠定了基础,同时也为针对MCM7分子及其调控通路的新药筛选提供了重要线索。
刘畅[8]（2020）在《基于纳米抗体靶向性泛素化降解技术的Survivin亚细胞功能探究》文中研究指明Survivin是凋亡抑制蛋白家族中最小的成员,降低细胞内源性Survivin的表达量可以抑制细胞增殖和促进细胞凋亡,目前有不少抑制Survivin表达的策略,但是缺乏一种基于抗体蛋白靶向的在蛋白水平上降解Survivin的方法。Survivin普遍存在于癌细胞的细胞质（包括线粒体）和细胞核中,不同亚细胞中Survivin发挥的功能可能也有所不同。因此,本课题的目的是通过建立一种纳米抗体靶向细胞内源性Survivin泛素化降解的方法,来研究Survivin降解后对细胞凋亡和细胞生长方面的影响,进而探究Survivin在不同亚细胞定位中发挥的主要功能。基于上述目的,本研究获得了以下结果与结论:首先,建立了由泛素连接酶TRIM21介导细胞内源性Survivin降解的方法,利用Survivin的纳米抗体Nb4A对Survivin的靶向性,以及抗体Fc区与TRIM21羧基末端PRYSPRY结构域特异性结合的能力,构建了 Nb4A-Fc-T2A-TRIM21系统。通过Western blot分析发现,Nb4A-Fc-T2A-TRIM21能大量降解细胞内源性Survivin蛋白,其降解Survivin的能力是Nb4A的3.72倍,TRIM21的2.84倍;并且利用蛋白酶体抑制剂MG132验证了该方法对Survivin的降解是由泛素-蛋白酶体途径介导的。其次,流式检测细胞凋亡结果显示,Nb4A-Fc-T2A-TIRM21对MCF-7细胞的凋亡率达到58.52%,然而对Survivin低表达的L-02细胞的凋亡率仅为14.56%,表明Nb4A-Fc-T2A-TIRM21可以通过降解癌细胞中的Survivin进而促进细胞凋亡。Western blot分析发现促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表达量与Survivin的表达量均成反比,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达与Survivin的表达水平无显着相关性,可以初步证明Survivin是通过直接或间接地抑制Caspase途径来发挥抗凋亡功能的,是区别于Bcl-2抗凋亡蛋白家族的抗凋亡途径。最后,将Nb4A-Fc-T2A-TRIM21融合核定位信号NLS,以靶向降解细胞核Survivin。通过比较细胞凋亡率发现,Nb4A-Fc-T2A-TRIM21对MCF-7细胞的促凋亡能力约是Nb4A-Fc-NLS-T2A-TRIM21-NLS 的 2.37 倍。MTT 实验发现Nb4A-Fc-NLS-T2A-TRIM21-NLS作用于MCF-7细胞48 h后,细胞存活率仅为49.44%,低于Nb4A-Fc-T2A-TRIM21组的细胞存活率（60.45%）,而其对L-02细胞的增殖活性无显着影响。通过对MCF-7细胞的细胞周期分布情况以及Cyclin D1表达水平的分析发现,靶向降解细胞核Survivin后,加速了 G1期向S期的转变,而且阻滞在S期和G2期,从而抑制了细胞分裂,并且细胞核Survivin的下调很大程度上会下调Cyclin D1的表达,但降解细胞质中的Survivin却没有明显影响细胞周期的进程。综上结果表明,Survivin的双重作用与其定位息息相关,细胞质Survivin主要发挥抗凋亡功能,而细胞核Survivin主要是促进细胞增殖并且参与细胞周期的调控。本研究为精准靶向Survivin的肿瘤治疗提供了新的策略与研究基础。
屈倩倩[9]（2020）在《奥科呋喃抗骨肉瘤作用及机制的实验研究》文中研究表明[目的]骨肉瘤好发于儿童和青少年,具有高度侵袭性及转移性,预后较差。因此,有必要开发新的药物或治疗方案以提高临床治愈率。奥科呋喃（C18H17NO6,6-乙酰-2-（1-氨基乙基）-7,9-二羟基-8,9b-二甲基-9bH-二苯丙呋喃-1,3-二酮）是从松萝中提取的二苯丙呋喃类化合物。本研究通过体外人骨肉瘤细胞的培养和体内裸鼠异种移植瘤模型的建立,探究奥科呋喃对人骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响和可能涉及的分子机制,为奥科呋喃的体内实验安全疗效观察甚至临床实验提供重要的理论依据。[方法]（1）常规培养人骨肉瘤细胞 MNNG/HOS C1#5[R-1059-D]（KCB2016037YJ,中科院昆明动物所细胞库）、人骨肉瘤细胞Saos-2（KCB200550YJ,中科院昆明动物所细胞库）。（2）CCK-8 检测 0 μM、0.15625 μM、0.3125 μM、0.625 μM、1.25 μM、2.5μM、5 μM、10μM、100 μM奥科呋喃作用于MNNG细胞和Saos-2细胞24 h、48 h、72 h 后的细胞存活率;CCK-8 检测 0 μM、0.15625μM、0.3125 μM、0.625μM、1.25 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM、100 μM 顺铂作用于 MNNG 细胞 48 h后的细胞存活率。以下实验分组为:奥科呋喃0 μM组、奥科呋喃1.5 μM组、奥科呋喃3 μM组、奥科呋喃4 μM组。（3）流式细胞术、TUNEL染色检测不同浓度奥科呋喃作用于MNNG细胞48 h后的细胞凋亡率。（4）划痕实验和Transwell小室实验检测不同浓度奥科呋喃作用于MNNG细胞48 h后对细胞迁移和侵袭的影响。（5）ELISA检测不同浓度奥科呋喃作用于MNNG细胞48 h后对MMP-2、MMP-9、VEGF分泌的影响。（6）免疫印迹检测经不同浓度奥科呋喃处理48 h后MNNG细胞中PCNA、Ki67、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT 的蛋白表达水平。（7）qRT-PCR检测经不同浓度奥科呋喃处理48 h后MNNG细胞中PCNA、Ki67、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、MMP-2、MMP-9、VEGF 的 mRNA表达水平。引入PI3K/AKT信号通路激动剂740Y-P和PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002后的实验分组为:奥科呋喃0 μM组、740Y-P 20 μM组、奥科呋喃4 μM组、奥科呋喃4μM+740Y-P 20μM组、LY294002 20 μM组、奥科呋喃4 μM+LY294002 20μM组。实验方法同上。（8）裸鼠异种移植骨肉瘤模型建立取0.2 ml 5×1 06个/ml对数生长期MNNG细胞悬浮液于裸鼠右侧背部皮肤注射,SPF级饲养。当肿瘤体积达到180-200 mm3时,将裸鼠随机分为对照组和实验组,每组3只。实验组给予2 mg/kg奥科呋喃,腹腔注射,每天一次;对照组按相同剂量和给药方式注射0.9%生理盐水。（9）瘤体体积、裸鼠体重、肝肾功能监测裸鼠成瘤后,每3天记录裸鼠体重、瘤体体积。裸鼠将在给药第20天以颈椎脱臼法处死。处死裸鼠前,尽可能多的收集裸鼠球后静脉血,检测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酐（CREA）、尿素氮（UREA）的水平。（10）生物学检测解剖下来的瘤体分成两部分,一部分保存于10%中性福尔马林溶液中,用于HE染色、TUNEL染色和IHC染色;一部分提取蛋白后用于免疫印迹检测;剩余部分-80℃冰箱保存。（11）二代高通量测序采用二代高通量测序检测经3 μM奥科呋喃处理48 h后、MNNG细胞中差异表达的miRNA,并经qRT-PCR验证。（12）质粒构建构建与转染根据二代高通量测序和qRT-PCR验证结果,以miR-16-5p序列为模板,构建过表达 LV-miR-16-5p mimics 和抑制表达 LV-miR-16-5p inhibitor 载体,转染MNNG细胞,以空载质粒LV-NC作为对照。实验分组为:对照组3μM奥科呋喃+MNNG细胞、阴性对照组3μM奥科呋喃+LV-NC细胞、3μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p mimics细胞、3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p inhibitor 细胞。（13）MNNG细胞生物学行为检测稳转细胞株经3μM奥科呋喃处理48 h后检测细胞存活率、凋亡率、侵袭和迁移等的变化。[结果]（1）奥科呋喃可抑制人骨肉瘤MNNG细胞和Saos-2细胞增殖CCK-8结果示,奥科呋喃对MNNG细胞和Saos-2细胞的增殖抑制作用呈时间-剂量依赖性;奥科呋喃对MNNG细胞的抑制作用优于顺铂;奥科呋喃显着下调MNNG细胞的PCNA和Ki67的蛋白及mRNA表达水平。确定后续实验对象为MNNG细胞,奥科呋喃实验浓度为1.5μM、3 μM、4μM。（2）奥科呋喃诱导人骨肉瘤MNNG细胞凋亡且呈剂量依赖性流式细胞术和TUNEL染色结果示,奥科呋喃呈剂量依赖性诱导MNNG细胞凋亡;免疫印迹结果示,奥科呋喃显着上调Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的蛋白表达水平,显着下调Bcl-2的蛋白表达水平;qRT-PCR结果示,奥科呋喃显着下调Bcl-2、Caspase-3的mRNA表达水平。（3）奥科呋喃抑制人骨肉瘤MNNG细胞迁移和侵袭划痕实验和Transwell小室实验结果示,奥科呋喃显着下调MNNG细胞迁移和侵袭能力;免疫印迹结果示,奥科呋喃显着下调MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimmentin的蛋白表达水平,显着上调E-cadherin的蛋白表达水平;ELISA结果示,奥科呋喃显着下调MMP-2、MMP-9、VEGF的分泌。（4）奥科呋喃抑制PI3K/AKT信号通路活性免疫印迹结果示,奥科呋喃显着下调p-PI3K和p-AKT的蛋白表达水平,但不影响总PI3K和总AKT的蛋白表达水平。（5）奥科呋喃通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥抗骨肉瘤作用CCK-8结果示,奥科呋喃和740Y-P共同孵育作用于MNNG细胞后,细胞存活率较奥科呋喃组有显着的提高;流式细胞术结果示,奥科呋喃和740Y-P共同孵育作用于MNNG细胞后,细胞凋亡率较奥科呋喃组显着降低;免疫印迹结果示,奥科呋喃和740Y-P共同孵育作用于MNNG细胞后,显着削弱了 740Y-P对 MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin、p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的上调作用;在E-cadherin的蛋白表达水平检测中,我们得到了与之相反的实验结果;LY294002显着下调p-PI3K和p-AKT的蛋白表达水平;奥科呋喃和LY294002共同孵育作用于MNNG细胞后,增强了对p-PI3K和p-AKT蛋白的下调作用。（6）奥科呋喃抑制裸鼠移植瘤的生长,但不影响裸鼠体重和肝肾功能从时间-肿瘤体积曲线得出,给药组瘤体体积明显小于对照组;从时间-裸鼠体重曲线得出,给药组裸鼠体重无明显变化;肝肾功能检测示,给药组裸鼠ALT（U/L）、AST（U/L）、CREA（μmol/L）水平较对照组显着下调。（7）奥科呋喃抑制瘤体肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡HE染色示,给药组瘤体组织染色较对照组细胞结构不清,细胞核固缩、深染、分裂,坏死率明显增加;TUNEL染色示,给药组瘤体组织发生凋亡的细胞数量明显高于对照组;IHC染色示,给药组瘤体组织中PCNA和Ki67的蛋白表达量明显低于对照组。（8）奥科呋喃抑制EMT和PI3K/AKT相关蛋白的表达奥科呋喃可显着下调瘤体中p-PI3K、p-AKT、N-cadherin、Vimentin的蛋白表达水平,上调E-cadherin的蛋白表达水平。（9）奥科呋喃对MNNG细胞中miR-16-5p的表达呈正调控二代高通量测序结果示,MNNG细胞经奥科呋喃处理后共12个miRNAs差异具有统计学意义（p<0.05）;经qRT-PCR验证后miR-16-5p的表达水平显着上调,与测序结果一致。（10）miR-16-5p功能获得上调奥科呋喃对MNNG细胞增殖的抑制作用CCK-8结果示,与对照组和阴性对照组相比,3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p mimics组MNNG细胞存活率显着下调,3μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p inhibitor组MNNG细胞存活率显着上调;免疫检测结果示,3μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p inhibitor组Ki67和PCNA的蛋白表达水平上调。（11）miR-16-5p功能获得上调奥科呋喃诱导MNNG细胞凋亡的能力流式细胞术结果示,3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p mimics组细胞凋亡率显着上调,3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p inhibitor组细胞凋亡率显着下调;免疫检测结果示,3μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p imics组Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9 的蛋白表达水平上调;3 μM 奥科呋喃+LV-miR-16-5p inhibitor组 Bax、Cleaved Caspase-3 和 Cleaved Caspase-9 的蛋白表达水平下调,Bcl-2 的蛋白表达水平上调。（12）miR-16-5p功能获得上调奥科呋喃对MNNG细胞侵袭和迁移的抑制作用划痕实验和Transwell小室实验结果示,3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p inhibitor组MNNG细胞迁移和侵袭能力显着上调;免疫检测结果示,3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p mimics组E-cadherin的蛋白表达水平上调;3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p inhibitor 组 E-cadherin 的蛋白表达水平下调,N-cadherin 和Vimentin的蛋白表达水平上调。（13）miR-16-5p功能获得上调奥科呋喃对PI3K/AKT信号通路的抑制作用免疫检测结果示,3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p mimics组p-AKT和p-P13K的蛋白表达水平下调。[结论]（1）奥科呋喃可抑制MNNG细胞增殖、侵袭和迁移,诱导细胞凋亡;奥科呋喃通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥其抗骨肉瘤作用;（2）奥科呋喃可显着抑制裸鼠异种移植瘤的生长,但不影响裸鼠体重和肝肾功能;（3）奥科呋喃可上调MNNG细胞中miR-16-5p的表达水平;miR-16-5p功能获得可上调奥科呋喃对MNNG细胞的增殖、迁移和侵袭以及PI3K/AKT信号通路的抑制作用和奥科呋喃诱导MNNG细胞凋亡的能力。
武喆[10]（2020）在《柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究》文中认为研究背景和目的乙型肝炎病毒（HBV）感染是严重的全球公共卫生问题,目前全球慢性HBV感染者约有2.4亿例,其中我国有约有8600万例。慢性乙型病毒性肝炎（CHB）、HBV感染相关肝硬化及HBV感染相关肝细胞性肝癌每年可导致全球超过80万人死亡,对社会造成极大的负担。目前用于治疗HBV感染的一线药物核苷（酸）类似物不能清除被感染肝细胞细胞核内的cccDNA,难以实现CHB的临床治愈,新型抗HBV药物亟需研发。柳胺酚是一种核糖核苷酸还原酶（RR）抑制剂,可以抑制细胞内核糖核苷酸（DNA）的生成,从而减少HBV的复制原料。研究发现柳胺酚对HBV复制及cccDNA形成具有强大的抑制作用,但其体内代谢过程仍不明确,生物学转化及代谢过程可能通过改变药物分子结构形成具有更强药理活性或毒性的代谢产物。本文拟对柳胺酚的代谢产物进行鉴定,并对柳胺酚代谢产物抗HBV活性进行分析,进而对活性代谢物抗HBV机制进行研究。方法1.通过超高效液相色谱串联飞行时间质谱（UPLC-QTOF/MS）鉴定柳胺酚在Sprague Dawley大鼠的体内药物代谢模型和人肝微粒体的体外药物代谢模型中的代谢产物,使用UNIFI软件对柳胺酚的体内代谢通路进行分析。进一步利用重组人肝脏药物代谢酶筛选系统明确参与柳胺酚代谢过程的肝脏药物代谢酶亚型。2.使用计算机虚拟分子对接技术计算柳胺酚代谢产物与RRM2活性位点之间的亲和力,筛选具有RRM2抑制活性的代谢物。使用HBV稳定复制细胞模型HepG2.2.15细胞系以及HBV核苷类似物交叉耐药细胞模型HepG2.A64细胞系验证筛选得到的柳胺酚代谢产物对细胞培养基上清中HBVDNA、HBsAg、HBeAg以及细胞内HBVDNA、cccDNA的抑制活性。通过细胞增殖活性实验及细胞凋亡实验明确具有抗HBV活性的柳胺酚代谢物LAF-OH的细胞毒性。进一步通过联合用药实验,使用ComboSyn软件计算LAF-OH与核苷（酸）类似物的联合用药指数。3.利用蛋白组学筛选LAF-OH作用后表达水平发生改变的差异蛋白并分析差异蛋白参与的生物学过程与抗HBV活性的关系。通过qPCR法、Western Blot法对差异蛋白表达水平进行验证并分析相关蛋白在mRNA及蛋白质水平表达变化对HBV复制的影响。通过流式细胞术测定LAF-OH对细胞周期比例的调节作用。通过ELISA法分析相关蛋白表达水平变化对RR活性的影响。结果1.分别收集SD大鼠经柳胺酚灌胃后在0-3h、3-8h、8-12h及12-24h时间段内的胆汁、粪便、血浆及尿液样本,在0-3h及3-8h收集的胆汁样品中鉴定到6个柳胺酚代谢产物（M1-M6）;在8-12h收集到胆汁样品中鉴定到2个柳胺酚代谢产物（M1、M2）;在0-3h及3-8h收集的粪便样品中鉴定到3个柳胺酚代谢产物（M1、M3和M6）;在其余时间段收集的胆汁、粪便及全部的血浆、尿液样本中未鉴定到柳胺酚的代谢产物。在与人肝微粒体孵育的柳胺酚样本中鉴定到5个柳胺酚代谢产物（M1、M7-M10）。柳胺酚主要的代谢过程包括羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化和代谢性降解等。重组人肝药物代谢酶筛选结果表明CYP1A2与CYP2C9参与了柳胺酚的Ⅰ相代谢反应;UGTIA1、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7与UGT2B15参与了柳胺酚的Ⅱ相代谢反应。2.计算机分子对接拟合结果表明柳胺酚葡萄糖醛酸化代谢产物M8、M10以及柳胺酚羟基化代谢产物LAF-OH与RRM2活性位点的亲和力较柳胺酚更强。基于HepG2.2.15细胞及HepG2.A64细胞的HBV抑制实验发现LAF-OH对HBV的抑制活性较柳胺酚更强且成时间与剂量依赖性,可以显着降低野生型HBV及耐药突变HBV模型细胞培养上清中HBV-DNA、HBsAg以及细胞内HBV-DNA、cccDNA的水平。细胞增殖活性及细胞凋亡实验发现LAF-OH在HepG2.2.15细胞、HepG2.A64细胞、HepG2细胞与HEK293细胞中半数细胞增殖抑制剂量IC50 分别为 173.4μM、366.7μM、222.3μM 与 191.8μM,在 150μM 浓度时未对细胞凋亡造成明显影响。联合药效试验结果表明LAF-OH与拉米夫定、恩替卡韦联合抗HBV具有协同效应;LAF-OH与阿德福韦、替诺福韦联合抗HBV具有相加效应。3.蛋白组学筛选发现LAF-OH处理后细胞细胞周期、IL-17信号通路及PPAR信号通路相关蛋白表达水平显着降低。Western Blot分析发现LAF-OH可以通过抑制Akt磷酸化水平降低cyclin D1的表达水平。细胞周期分析结果表明经LAF-OH处理后S期细胞比例明显下降。进一步通过qPCR及Western Blot分析发现LAF-OH可在不引起RRM2B表达代偿性上调的同时显着抑制RRM2蛋白表达水平下降。RR活性分析发现LAF-OH可通过同时抑制RRM2活性与表达水平的方式显着抑制RR活性。结论1.柳胺酚在体内主要通过羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化及代谢性降解等途径代谢。CYP1A2、CYP2C9、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7与UGT2B15是柳胺酚主要的肝脏代谢酶亚型。2.LAF-OH与RRM2活性位点具有较高的亲和力,其抗HBV活性较柳胺酚更高。LAF-OH在显着降低细胞培养基上清HBV-DNA、HBsAg与细胞内HBV-DNA、cccDNA水平的同时不产生明显的细胞毒性,具有良好的安全性。此外,LAF-OH对核苷类似物耐药HBV仍具有强大的抑制活性。LAF-OH在与核苷（酸）类似物联合使用时表现出相加效应或协同效应。3.LAF-OH通过降低Akt磷酸化水平而下调cyclin D1的表达水平,改善因HBV感染造成的细胞周期紊乱,以降低S期细胞比例的方式下调RRM2的表达水平,同时不使RRM2B表达水平代偿性增高。LAF-OH在下调RRM2表达水平的同时与RRM2活性位点竞争性结合,从而大幅抑制RR活性,发挥抗HBV作用。LAF-OH可通过调节IL-17介导的免疫学反应以及PPAR、Akt等信号通路为HBV治疗带来更多潜在获益。
二、FEN 1基因反义阻断细胞株(FL FEN 1~-)的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、FEN 1基因反义阻断细胞株(FL FEN 1~-)的建立（论文提纲范文）
（1）CMTM6表达促进肺癌增殖侵袭及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 CMTM6在肺癌组织中的表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 敲低CMTM6对非小细胞肺癌生物学行为的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三章 CMTM6调节肺癌细胞增殖和侵袭的机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 含有MARVEL跨膜结构域的趋化素样因子6研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）西黄丸治疗非小细胞肺癌疗效的系统评价及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 非小细胞肺癌的西医研究进展 |
| 综述二 西黄丸抗肿瘤的实验研究进展 |
| 综述三 热休克蛋白与肿瘤的关系 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 西黄丸治疗非小细胞肺癌的疗效：系统综述和Meta分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 西黄丸抗非小细胞肺癌的网络药理学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 西黄丸抗小鼠Lewis肺癌的药效学研究 |
| 实验一 西黄丸含药血清和浸提液对LL/2细胞株增殖的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 西黄丸浸提液对LL/2细胞株凋亡和细胞周期的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 西黄丸浸提液对LL/2细胞株迁移及侵袭能力的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 西黄丸抑制Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤生长的作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤的转录组学的影响 |
| 实验五 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤转录组学的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤热休克蛋白家族的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验七 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤的ER/RXRα/PPAR的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 祖国医学部分 |
| 1. 祖国医学对肿瘤的认识(历史沿革) |
| 2. 祖国医学对结直肠癌的认识 |
| 2.1 祖国医学对结直肠癌疾病的认识 |
| 2.2 祖国医学对结直肠癌病因病机的认识 |
| 2.3 祖国医学对结直肠癌证型的认识 |
| 2.4 祖国医学对结直肠癌辨病、辩证治疗的认识 |
| 2.5 祖国医药抗结直肠肿瘤的优势 |
| 2.6 中药治疗结直肠癌的研究进展 |
| 3. 中药苦豆子及其成分苦豆碱的研究进展 |
| 3.1 中药苦豆子的研究进展 |
| 3.2 苦豆碱的药理学作用及其机制研究进展 |
| 现代医学部分 |
| 1 现代医学对结直肠癌病因及机制的研究 |
| 1.1 结直肠癌分子标志物 |
| 1.2 结直肠癌相关信号通路 |
| 2 microRNAs与结直肠癌的研究进展 |
| 2.1 microRNAs与结直肠癌相关机制研究 |
| 2.2 microRNAs在结直肠癌临床应用 |
| 3 结直肠癌EMT的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一部分 ALO抑制结直肠癌细胞增殖 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞株的培养 |
| 2.2 ALO处理结直肠癌细胞 |
| 2.3 MTT实验 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 不同浓度ALO对不同结直肠癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.2 ALO对不同结直肠癌细胞的IC50 |
| 4. 总结 |
| 第二部分 ALO对miR-296-5p在结直肠癌细胞中表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 利用生物信息网站StarBasev3.0分析miR-296-5p的表达 |
| 2.3 qRT-PCR检测miR-296-5p在不同人结直肠癌细胞及人肠上皮细胞中的表达 |
| 2.4 qRT-PCR检测ALO处理后SW480和HCT116细胞miR-296-5p的表达 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 StarBasev3.0分析miR-296-5p的表达 |
| 3.2 qRT-PCR检测miR-296-5p在不同人结直肠癌细胞及人肠上皮细胞中的表达 |
| 3.3 qRT-PCR检测ALO处理后SW480和HCT116细胞miR-296-5p的表达 |
| 4. 总结 |
| 第三部分 STAT3和miR-296-5p存在结合位点 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 TargetScan V7.2靶基因预测 |
| 2.3 野生型(WT)和突变型(MUT)-STAT3 3'UTR片段设计和合成 |
| 2.4 质粒的建立、提取及鉴定 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 双荧光素酶报告基因分析 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 生物信息学网站TargetScan V7.2显示STAT3是miR-296-5p的靶基因 |
| 3.2 miR-296-5p mimics能够抑制STAT3-荧光素酶活性 |
| 3.3 miR-296-5p inhibitor增强STAT3-荧光素酶活性 |
| 4. 总结 |
| 第四部分 ALO和miR-296-5p对结直肠癌细胞STAT3表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 ALO处理结直肠癌细胞 |
| 2.4 qRT-PCR实验 |
| 2.5 Western blot实验 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 qRT-PCR检测miR-296-5p mimics、STAT3过表达、ALO等不同处理后HCT116细胞中miR-296-5p的表达 |
| 3.2 qRT-PCR检测miR-296-5p inhibitor、siSTAT3、ALO等处理后SW480细胞中miR-296-5p的表达 |
| 3.3 Western blot检测miR-296-5p mimics、STAT3过表达、ALO等处理后HCT116细胞中STAT3的表达 |
| 3.4 Western blot检测miR-296-5p inhibitor、siSTAT3、ALO等不同处理后SW480细胞STAT3的表达 |
| 4. 总结 |
| 第五部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控结直肠癌细胞增殖和凋亡 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 细胞克隆形成实验(Clone formation assay) |
| 2.4 细胞凋亡检测(Cell apoptosis detection) |
| 2.5 Western-blot检测细胞凋亡相关蛋白 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 克隆形成实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞增殖 |
| 3.2 克隆形成实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞增殖 |
| 3.3 细胞凋亡实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞凋亡 |
| 3.4 细胞凋亡实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞增殖 |
| 3.5 HCT116细胞凋亡相关蛋白的检测 |
| 3.6 SW480细胞凋亡相关蛋白的检测 |
| 4. 总结 |
| 第六部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控结直肠癌细胞迁移和侵袭 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 划痕愈合实验 |
| 2.4 Transwell细胞侵袭实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 划痕愈合实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞迁移 |
| 3.2 划痕愈合实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞迁移 |
| 3.3 Transwell细胞侵袭实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞侵袭 |
| 3.4 Transwell细胞侵袭实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞侵袭 |
| 4. 总结 |
| 第七部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控EMT相关蛋白的表达 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、 HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 Western blot实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 Western blot检测HCT116细胞EMT相关蛋白N-cadherin(N-cad)和E-cadherin(E-cad)的表达 |
| 3.2 Western blot检测SW480细胞EMT相关蛋白N-cadherin (N-cad)和E-cadherin (E-cad)的表达 |
| 4. 总结 |
| 第三章 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）长链非编码RNA Linc00909在结直肠癌中的表达及其对放化疗敏感性的影响（论文提纲范文）
| 英文缩写词汇表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 Linc00909 在结直肠癌及放化疗组织中的表达及临床意义研究 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分 Linc00909 通过增强结直肠癌细胞干细胞样特性影响放化疗敏感性 |
| 引言 |
| 1.主要试剂与仪器 |
| 2.方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| References |
| 综述 LncRNA在结直肠癌放化疗中的研究进展 |
| References |
| 致谢 |
（5）绞股蓝皂苷gypenoside L和gypenoside LI抑制乳腺癌细胞增殖及诱导凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 绞股蓝皂苷gypenoside L和gypenoside LI抑制乳腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡 |
| 第一节 Gypenoside L和gypenoside LI抑制乳腺癌细胞增殖 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第二节 Gypenoside L和gypenoside LI抑制乳腺癌细胞迁移 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第三节 Gypenoside L和gypenoside LI诱导乳腺癌细胞凋亡 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第四节 结论与讨论 |
| 第二章 Gypenoside LI下调E2F1使乳腺癌细胞周期阻滞在G0/G1期 |
| 第一节 Gypenoside LI影响乳腺癌细胞转录组 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第二节 Gypenoside LI诱导乳腺癌细胞周期阻滞在G0/G1期 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第三节 Gypenoside LI通过下调E2F1使乳腺癌细胞阻滞在G0/G1期 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第四节 Gypenoside LI通过下调ERCC6L抑制乳腺癌细胞增殖 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第五节 E2F1可调控ERCC6L的表达 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第六节 结论与讨论 |
| 第三章 Gypenoside L诱导乳腺癌细胞周期G2/M期阻滞和细胞凋亡机制研究 |
| 第一节 Gypenoside L影响乳腺癌细胞转录组 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第二节 Gypenoside L诱导乳腺癌细胞周期阻滞在G2/M期 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第三节 Gypenoside L下调乳腺癌细胞中ERCC6L的表达可能与有丝分裂有关 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第四节 Gypenoside L诱导乳腺癌细胞产生ROS |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第五节 结论与讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 天然产物调节转录因子预防及治疗癌症的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读学位期间主持及主要参与课题 |
（6）MG53与胃泌素缓解急性肾损伤的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一部分 MG53缓解造影剂诱导的急性肾损伤的研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 MG53缓解造影剂诱导的急性肾损伤的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要实验材料 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂及耗材 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 MG53 缓解大鼠CI-AKI |
| 2.2.2 MG53减少碘普罗胺诱导的RPT细胞凋亡 |
| 2.2.3 MG53减轻碘普罗胺诱导的RPT细胞膜损伤 |
| 2.2.4 MG53转位至胞膜并结合PS以介导膜保护作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第二部分 胃泌素缓解缺血再灌注诱导的急性肾损伤的研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 胃泌素缓解缺血再灌注诱导的急性肾损伤的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要实验材料 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 小鼠肾脏I/R损伤后CCKBR的表达增加 |
| 2.2.2 胃泌素缓解I/R损伤后肾功能及肾脏病理损害 |
| 2.2.3 胃泌素减少I/R诱导的肾小管细胞凋亡 |
| 2.2.4 胃泌素缓解H/R诱导的HK-2细胞活力抑制 |
| 2.2.5 胃泌素减少H/R诱导的HK-2 细胞凋亡和ROS生成 |
| 2.2.6 PI3K/Akt/Bad途径参与了胃泌素的保护作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三部分 SNX1 调控AT1R参与血压调节的初步拓展探究 |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 SNX1 调控AT1R参与血压调节的初步拓展探究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要实验材料 |
| 2.1.2 主要仪器设备与耗材 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 SNX1基因敲除小鼠的构建和鉴定 |
| 2.2.2 Snx1-/-小鼠血压升高、肠系膜动脉对Ang II的反应性增强 |
| 2.2.3 Snx1-/-小鼠动脉中AT1R的表达增加 |
| 2.2.4 SNX1 敲低的A10 细胞中AT1R的表达增加 |
| 2.2.5 蛋白酶体途径参与A10 细胞中SNX1 介导AT1R降解 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 急性肾损伤中细胞凋亡的研究进展 |
| 参考文献 |
| 读博士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）三氧化二砷抑制肝癌转移及肝癌干细胞的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 三氧化二砷对肝癌转移及肝癌干细胞的作用研究 |
| 第一章 三氧化二砷在小鼠模型中抑制肝癌发生、转移并延长小鼠生存期 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 三氧化二砷抑制肝癌细胞在NOD/SCID小鼠皮下成瘤的能力 |
| 1.3.2 三氧化二砷在肝脏原位荷瘤小鼠模型中抑制肝癌肺转移 |
| 1.3.3 三氧化二砷显着改善肝脏原位荷瘤小鼠的生存状态,延长小鼠生存期 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 三氧化二砷抑制肝癌干细胞相关的生物学特性及功能 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 三氧化二砷对肝癌细胞体外作用的浓度确定 |
| 2.3.2 三氧化二砷降低肿瘤干细胞标志阳性的肝癌细胞比例 |
| 2.3.3 三氧化二砷下调干性基因及肝癌恶性预后标志的表达 |
| 2.3.4 三氧化二砷提高肿瘤干细胞样肝癌细胞对化疗药物的敏感性 |
| 2.3.5 三氧化二砷抑制肝癌干细胞的肿瘤球形成能力 |
| 2.3.6 三氧化二砷抑制肝癌细胞的transwell侵袭能力 |
| 2.4 小结 |
| 第二部分 三氧化二砷作用于肝癌细胞的靶分子探究 |
| 第三章 MCM7是三氧化二砷对肝癌干细胞发挥抑制作用的关键靶点 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 利用表达谱芯片筛选三氧化二砷在肝癌细胞中调控的关键基因 |
| 3.3.2 三氧化二砷在细胞水平及小鼠皮下肿瘤中显着下调MCM7蛋白的表达 |
| 3.3.3 MCM7的敲低表达可重复三氧化二砷对肝癌转移的抑制作用 |
| 3.3.4 敲低MCM7的表达可再现三氧化二砷对肝癌干细胞的抑制作用 |
| 3.3.5 MCM7过表达抵消三氧化二砷对肝癌细胞成球的抑制作用 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 MCM7是肝癌进展与不良预后的重要标志 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 MCM7蛋白在人肝癌组织的亚细胞定位不同于癌旁组织 |
| 4.3.2 MCM7在人肝癌组织中高表达且表达量与肝癌分级呈正相关 |
| 4.3.3 MCM7在肝癌组织的核内相对表达量与肝癌进展及不良预后密切相关 |
| 4.4 小结 |
| 第三部分 三氧化二砷对MCM7分子表达调控机制的探究 |
| 第五章 三氧化二砷直接结合MCM7蛋白但与诱导蛋白降解无关 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 有机砷荧光探针在体外与重组人MCM7蛋白结合 |
| 5.3.2 有机砷荧光探针与肝癌细胞内源性MCM7蛋白结合 |
| 5.3.3 MCM7蛋白在三氧化二砷的作用下并未发生降解 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 三氧化二砷通过抑制SRF/MCM7 复合物下调MCM7 的表达 |
| 6.1 材料与试剂 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 SRF与 MCM7 在肝癌细胞中形成复合物 |
| 6.3.2 SRF与 MCM7 启动子区域结合并调控MCM7 的表达水平 |
| 6.3.3 三氧化二砷抑制SRF/MCM7 复合物对MCM7 的转录调控 |
| 6.4 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 实验仪器设备 |
| 附录2 抗体信息及用量 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 附 Cell Death and Disease 论文全文 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（8）基于纳米抗体靶向性泛素化降解技术的Survivin亚细胞功能探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 Survivin的结构与功能及其定位 |
| 1.1.1 Survivin的结构 |
| 1.1.2 Survivin的多重角色与功能 |
| 1.1.3 Survivin的亚细胞定位 |
| 1.2 降低细胞内源性Survivin表达量的不同策略 |
| 1.2.1 基因水平抑制Survivin的表达 |
| 1.2.2 蛋白水平的Survivin抑制剂 |
| 1.3 泛素-蛋白酶体途径 |
| 1.3.1 泛素蛋白酶体系统 |
| 1.3.2 三联基序蛋白TRIM21 |
| 1.4 基于抗体靶向Survivin的泛素化降解 |
| 1.5 本课题的研究目的与意义 |
| 第2章 靶向降解细胞内源性Survivin方法的建立与重组质粒的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 质粒及菌株 |
| 2.2.2 主要实验仪器与设备 |
| 2.2.3 酶类与试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 靶向癌细胞内Survivin泛素化降解的设计 |
| 2.3.2 基因序列的获取及蛋白质3D结构的预测 |
| 2.3.3 重组质粒的构建 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 蛋白3D模型预测的结果 |
| 2.4.2 重组质粒的构建 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 TRIM21介导癌细胞中Survivin的泛素化降解及其促凋亡评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 质粒 |
| 3.2.2 细胞株 |
| 3.2.3 主要仪器及设备 |
| 3.2.4 实验所需试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 细胞转染 |
| 3.3.3 细胞株的优选 |
| 3.3.4 Nb4A-Fc-T2A-TRIM21的抗肿瘤活性研究 |
| 3.3.5 Western blot检测细胞中Survivin以及凋亡相关蛋白的表达水平 |
| 3.3.6 蛋白酶体抑制剂MG132验证Survivin由泛素-蛋白酶体途径介导的降解 |
| 3.3.7 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 细胞株的优选 |
| 3.4.2 核染观察Nb4A-Fc-T2A-TRIM21对癌细胞的促凋亡作用 |
| 3.4.3 流式细胞仪分析细胞凋亡率 |
| 3.4.4 Western blot分析Nb4A-Fc-T2A-TRIM21对Survivin的降解能力以及对细胞中凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.4.5 Nb4A-Fc-T2A-TRIM21通过泛素-蛋白酶体途径介导Survivin的降解 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 探索Survivin在不同亚细胞定位中的功能 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 质粒 |
| 4.2.2 细胞株 |
| 4.2.3 主要仪器与设备 |
| 4.2.4 实验所需试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞核定位信号 |
| 4.3.2 免疫荧光分析Survivin的靶向降解 |
| 4.3.3 不同重组质粒对细胞活性的研究 |
| 4.3.4 靶向降解细胞核Survivin对细胞凋亡的影响 |
| 4.3.5 靶向降解细胞核Survivin对细胞周期的影响 |
| 4.3.6 统计学分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 核定位信号NLS的验证 |
| 4.4.2 靶向降解细胞质Survivin和细胞核Survivin的免疫荧光分析 |
| 4.4.3 细胞生长抑制的分析 |
| 4.4.4 细胞核中的Survivin降解后对细胞凋亡的分析 |
| 4.4.5 Survivin对细胞周期的调控 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间科研成果 |
（9）奥科呋喃抗骨肉瘤作用及机制的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 奥科呋喃抗骨肉瘤作用的体外机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 奥科呋喃抗骨肉瘤作用的体内机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 奥科呋喃通过上调miR-16-5p发挥抗骨肉瘤作用的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 mieroRNAs在骨肉瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（10）柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 柳胺酚代谢产物鉴定及代谢通路研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 配置柳胺酚溶液 |
| 3.2 动物实验方案 |
| 3.3 体内代谢产物样品的收集与处理 |
| 3.4 体外代谢产物的制备 |
| 3.5 色谱与质谱条件 |
| 3.6 数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 柳胺酚母离子分析 |
| 4.2 柳胺酚代谢产物鉴定 |
| 4.3 柳胺酚肝脏药物代谢酶亚型鉴定 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 第二部分 柳胺酚代谢产物抗HBV活性研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 RRM2活性位点与柳胺酚及其代谢产物分子对接 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 细胞增殖毒性测定 |
| 3.4 细胞凋亡检测 |
| 3.5 细胞水平抗乙肝病毒活性测定 |
| 3.6 柳胺酚羟基化代谢产物与核苷(酸)类似物联合效应测定 |
| 3.7 数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 RRM2分子活性位点定义 |
| 4.2 柳胺酚及其代谢产物与RRM2分子对接结果 |
| 4.3 LAF-OH对细胞增殖毒性影响的研究 |
| 4.4 LAF-OH对细胞凋亡影响的研究 |
| 4.5 LAF-OH抗HBV活性研究 |
| 4.6 LAF-OH与核苷(酸)类似物联合用药研究 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 第三部分 柳胺酚活性代谢物LAF-OH抗HBV机制研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 细胞株及载体 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 细胞转染 |
| 3.3 细胞内RRM2活性检测 |
| 3.4 LAF-OH处理后细胞内RRM1、RRM2、RRM2B在mRNA及蛋白水平的表达检测 |
| 3.5 iTRAQ标记定量蛋白组分析方法 |
| 3.6 细胞周期检测方法 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 LAF-OH对细胞周期及IL-17、PPAR等信号通路产生调控 |
| 4.2 LAF-OH通过降低Akt的磷酸化水平下调cyclin D1表达水平 |
| 4.3 LAF-OH在mRNA水平及蛋白质水平抑制RRM2的表达 |
| 4.4 LAF-OH对RR活性具有抑制作用 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 参考文献 |
| 综述 抗乙型肝炎病毒治疗药物研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
四、FEN 1基因反义阻断细胞株(FL FEN 1~-)的建立（论文参考文献）
- [1]CMTM6表达促进肺癌增殖侵袭及机制研究[D]. 戴芳. 昆明医科大学, 2021(02)
- [2]西黄丸治疗非小细胞肺癌疗效的系统评价及作用机制研究[D]. 张志莹. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究[D]. 韩玮. 南京中医药大学, 2021(01)
- [4]长链非编码RNA Linc00909在结直肠癌中的表达及其对放化疗敏感性的影响[D]. 吴勇. 福建医科大学, 2021(02)
- [5]绞股蓝皂苷gypenoside L和gypenoside LI抑制乳腺癌细胞增殖及诱导凋亡的机制研究[D]. 祖玛丽. 中央民族大学, 2021(12)
- [6]MG53与胃泌素缓解急性肾损伤的研究[D]. 刘超. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [7]三氧化二砷抑制肝癌转移及肝癌干细胞的作用与机制研究[D]. 王海洋. 军事科学院, 2020(02)
- [8]基于纳米抗体靶向性泛素化降解技术的Survivin亚细胞功能探究[D]. 刘畅. 华东理工大学, 2020(06)
- [9]奥科呋喃抗骨肉瘤作用及机制的实验研究[D]. 屈倩倩. 昆明医科大学, 2020(02)
- [10]柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究[D]. 武喆. 浙江大学, 2020(01)