一、实验性癫痫鼠脑组织环核苷酸及ATP酶的测定(论文文献综述)
费文婷[1](2019)在《外来中药玛咖甘温健脾药性及其物质基础和作用机制研究》文中研究说明1研究背景玛咖作为南美地区传统的的植物药具有“南美人参”的称号,由于其独特的生物活性在全球普遍应用。我国自古就有吸纳外来优秀民族医药的传统,对外来药物秉持着开放的态度。从20世纪90年代末开始,玛咖被引入中国,在云南、西藏等高海拔地区大量种植,并且结合中医药特色与中药配伍被广泛应用。截止2018年,经国家食品药品监督管理局批准的以玛咖为主要原料,与中药配伍的产品就高达29个,配伍的中药种类以补益药居多,但是由于玛咖没有明确的中药药性使这种配伍应用缺乏中医药理论支撑,玛咖中药药性的提出与研究是玛咖在我国应用亟需解决的关键问题。导师的研究团队在对玛咖进行充分的文献研究和理论探讨的基础上,提出玛咖的中药药性:微温,味甘、辛,归肾、肝、脾经,具有补肾益精,强筋壮骨,疏肝健脾之效,为本课题的研究奠定了理论基础。据传统医学记载和对现代研究文献分析,玛咖的应用以影响生殖系统以及强身健体为特色。目前众多学者对玛咖增强性功能作用的研究较多,玛咖“补肾”功效深入人心,但考虑到玛咖在原产地的应用背景,且国内市场上玛咖与中药配伍的实际应用仍以缓解体力疲劳和增强免疫力为主。中医认为,疲劳和免疫低下状态多与脾虚证相关,因此,本课题主要针对玛咖“性温味甘归脾经”药性及“甘温健脾”功效进行研究。2实验目的(1)运用中医药学最新研究成果,在建立脾虚证动物模型的基础上,通过“以证测性,性效相关”验证玛咖“性温味甘归脾经”药性及“甘温健脾”功效。(2)通过比较玛咖原粉及其水提取物、醇提取物的药性偏性,筛选、追踪玛咖“甘温健脾”主要活性成分,探讨功效物质基础。(3)基于玛咖“甘温健脾”功效,揭示玛咖多糖促进机体能量代谢及免疫调控的作用机制,揭示“性效相关”的科学内涵。3实验方法(1)建立复合因素造模法(饮食失节、劳倦伤脾双因素)脾虚证动物模型,考察玛咖原粉对脾虚证小鼠物质、能量代谢的影响,验证玛咖“性温味甘归脾经”药性及“甘温健脾”功效。(2)建立理化因素损伤法(环磷酰胺诱导)脾虚证动物模型,考察玛咖对脾虚证小鼠能量代谢及免疫调节的影响,验证玛咖“性温味甘归脾经”药性及“甘温健脾”功效。(3)选取环磷酰胺诱导法建立的脾虚证小鼠模型,通过考察比较玛咖原粉、玛咖水提物和醇提物对脾虚证模型小鼠的影响,追踪玛咖“甘温健脾”的主要活性成分。(4)从玛咖水提物中进一步提取、精制玛咖多糖。研究玛咖多糖对脾虚证小鼠能量代谢的影响,检测脾虚小鼠肝脏组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶以及线粒体F0F1-ATP酶含量,RT-qPCR法检测参与能量代谢三羧酸循环的关键酶NADH、SDH及VDAC的基因表达水平,Western Blot法测VDAC蛋白表达水平,明确玛咖多糖促进脾虚小鼠能量代谢的作用机制。(5)研究玛咖多糖对脾虚证小鼠免疫调控的影响,运用流式细胞仪测脾虚小鼠外周血淋巴细胞周期、细胞亚群,酶免法测血清免疫细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、TNF-β含量,RT-qPCR法检测特异性转录因子T-bet、GATA-3基因表达,MTT法脾脏淋巴细胞增殖情况,TUNEL荧光染色法观察脾脏细胞凋亡情况,Western Blot法及免疫荧光法测脾脏细胞凋亡因子Caspase-3、BAX、Bcl-2蛋白表达水平,明确玛咖多糖对脾虚小鼠免疫调控的作用机制。4实验结果(1)玛咖原粉能够缓解由饮食失节、劳倦伤脾双因素法建立的脾虚证小鼠的体力疲劳,增加力竭游泳时间,降低小鼠冷区停留比例,升高cAMP/cGMP 比值,促进MG、LG储存,抑制代谢产物LA、FFA、CREA、UREA的生成,促进能量代谢酶LDH、CK及肝脏 F0F1-ATP 酶、Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性。(2)玛咖原粉能够缓解由环磷酰胺诱导法建立的脾虚症状,升高小鼠温度趋向性的冷区停留比例,升高cAMP/cGMP比值,对免疫器官的萎缩有拮抗作用,升高WBC计数,上调IL-2、IFN-γ表达水平,增强能量代谢Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。(3)进一步比较同等剂量的玛咖原粉、及其水提物和醇提物作用于环磷酰胺诱导的脾虚小鼠模型,玛咖原粉、水提物和醇提物均能增加脾虚小鼠体重,组间无差异。玛咖水提物组对小鼠的温度趋向性影响的速度最快、幅度最大,玛咖水提物>玛咖原粉>玛咖醇提物。玛咖水提物升高cAMP/cGMP比值效果优于原粉、优于醇提物。玛咖水提物对免疫器官的保护作用、升高白细胞作用最佳,对小鼠肝脏能量代谢酶活性影响最大。(4)玛咖多糖作用于脾虚小鼠能够缓解其脾虚症状,增加体重、延长力竭游泳时间,增加小鼠温度趋向性的冷区停留比例,升高脾虚小鼠血清cAMP/cGMP比值,增加机体能量代谢酶酶Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶两种离子泵的含量,增强F0F1-ATP酶活性,促进ATP的合成,升高脾虚小鼠肝脏组织中的NADH和SDH的基因表达,增强VDAC的活性,促进三大营养物质分解生成丙酮酸进入线粒体,进而发生氧化磷酸化反应生成ATP储存能量。(5)玛咖多糖抑制脾虚小鼠免疫器官的萎缩,增加外周血白细胞计数,其作用机制为:让停留于G0/G1期的淋巴细胞进入S期和G2/M期,增加CD4+T淋巴细胞的比例;升高IFN-y,TNF-β,IL-2含量,同时降低IL-4含量;升高转录因子T-bet基因的表达水平、降低GATA-3基因表达水平,使Th0细胞向Th1细胞转化,同时抑制Th2细胞的活化,机体Th1/Th2细胞亚群恢复平衡;抑制脾脏淋巴细胞凋亡,降低促凋亡因子BAX、Caspase-3蛋白表达水平,升高凋亡抑制因子Bcl-2蛋白表达水平,从而起到免疫调节作用。5结论(1)本研究通过观察玛咖对两种脾虚证小鼠的温度趋向性、环核苷酸水平以及物质能量代谢相关指标的影响,“以证测性”验证了玛咖药性“微温”;玛咖增加小鼠体重、增强体力、抑制免疫器官萎缩,体现了甘味药的补益作用,玛咖“味甘”;通过促进脾虚小鼠能量代谢和免疫调节从而实现“味甘补脾”、“温阳健脾”功效,玛咖“归脾经”,具有“甘温健脾”功效。(2)玛咖水提物对脾虚小鼠的寒热趋向变化及免疫调节作用最明显,效果优于醇提物和原粉,玛咖水提物“甘温健脾”药物性能最为突出。通过进一步筛选追踪,确定玛咖多糖是玛咖“甘温健脾”的物质基础。(3)玛咖多糖影响肝脏细胞线粒体三羧酸循环关键酶NADH、SDH和VDAC基因表达水平及酶活性,从而促进机体能量代谢;玛咖多糖通过促进机体失衡的Th1/Th2细胞亚群恢复平衡,降低脾脏组织中促凋亡因子BAX、Caspase-3蛋白表达水平,升高抑制凋亡抑制因子Bcl-2蛋白表达水平,介导免疫细胞的凋亡,对机体起到免疫调节作用。6研究意义(1)本研究从整体、组织、细胞、分子不同层次探讨了玛咖多糖影响能量代谢、调控免疫的作用机制。从现代科学角度分析药性及功效指标关联性,进而揭示了玛咖“甘温健脾”的“性效相关”内涵。(2)本研究确立了玛咖多糖为“甘温健脾”的物质基础,有助于玛咖在今后的临床应用中建立标准、控制质量以及指导与中药的配伍应用。(3)本研究为外来药物“中药化”的药性实验研究提供了新的研究思路与方法,有助于填补外来药物“中药化”的空白,推动了外来中药的理论与实践的创新性研究。为深入揭示中药药性理论科学内涵,充分利用天然药用资源、拓展中药新资源具有重要意义。
卢璐[2](2019)在《丙戊酸干预发挥神经保护作用的实验研究》文中研究说明目的丙戊酸(Valproic Acid,VPA)作为一种经典的抗癫痫药物被广泛应用于临床,它同时还具有抑制细胞凋亡、减轻炎性反应、保护及营养神经元、减少胶质细胞增生等神经保护作用。脑型疟(Cerebral Malaria,CM)是恶性疟疾最严重的并发症,是疟疾患者死亡的主要原因,CM幸存患者有严重的神经系统后遗症。近年来,抗疟治疗取得了一定成效,但仍面临许多挑战,其中最重要的挑战之一是疟原虫对抗疟药物的抗性增加,因此,寻找降低其死亡率,防止CM发生及减轻CM患者的神经系统后遗症等新的治疗手段尤为重要。但VPA对脑型疟的作用尚不清楚。因此,本课题旨在探讨VPA对CM的神经保护作用。方法1.腹腔注射1×104伯氏疟原虫感染的红细胞到C57BL/6小鼠,建立实验性小鼠脑型疟模型,感染6天后,通过心脏取血后离心备用;2.体外培养C57BL/6胎鼠(E13.5天)神经干细胞,3天半量换液,6天后进行传代,培养第三代时,将其种植于多聚赖氨酸包被的24孔板中,3天后,加脑型疟小鼠血清和正常小鼠血清处理神经干细胞,同时加入1mM VPA,分化培基培养5天后,β-Ⅲ-tubulin与GFAP细胞免疫荧光染色、实时荧光定量PCR(β-Ⅲ-tubulin、GFAP)观察神经干细胞向神经元和星形胶质细胞分化的影响;3.体外原代培养C57BL/6小鼠海马神经元,3天半量换液,7天后加脑型疟小鼠血清和正常小鼠血清处理神经元,同时加入1mM VPA,培养3天后,光镜拍照,DCFH-DA检测活性氧水平,CytoTox96?非放射性细胞毒性检测试剂盒检测乳酸脱氢酶(Lactic Dehydrogenase,LDH)释放量,Tunel细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡细胞,观察VPA对加有脑型疟小鼠血清的海马神经元的作用;4.腹腔注射1×104伯氏疟原虫感染的红细胞到C57BL/6小鼠,建立实验室小鼠脑型疟模型,感染第2天起腹腔注射VPA 300mg/kg,连续注射5天;计算生存率、快速鼠昏迷和行为量表(Rapid Murine Coma and Behavior Scale,RMCBS)进行评分;苏木素-伊红染色观察感染红细胞滞留及出血情况;取脑组织进行伊文斯蓝染色,比较血脑屏障的破坏程度;取脑组织提取RNA,比较IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的水平;5.腹腔注射1×104伯氏疟原虫感染的红细胞到C57BL/6小鼠,建立实验室小鼠脑型疟模型,感染第2天起腹腔注射VPA 300mg/kg,连续注射5天;取脑组织提取RNA,比较脑源性神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)、神经胶质细胞源性的神经营养因子(Glial cell line-DerivedNeurotrophic Factor,GDNF)、神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)等水平,并立即取脑组织进行膜片钳实验,观察VPA对海马区神经元膜电位的影响。结果1.成功体外提取培养胎鼠神经干细胞,细胞免疫荧光染色结果显示加脑型疟小鼠血清后β-Ⅲ-tubulin阳性比例降低,同时加入VPA后β-Ⅲ-tubulin阳性比例升高;加脑型疟小鼠血清后GFAP阳性比例升高,同时加入VPA后GFAP阳性比例降低。荧光实时定量PCR与免疫荧光染色抑制,显示加脑型疟小鼠血清后β-Ⅲ-tubulin含量降低,同时加入VPA后β-Ⅲ-tubulin含量升高;加脑型疟小鼠血清后GFAP含量升高,同时加入VPA后GFAP含量降低;2.成功体外培养海马神经元,结合光镜结果、活性氧含量、LDH释放率及Tunel染色结果可观察到:加入脑型疟小鼠血清后,光镜下海马神经元漂浮细胞增加,活性氧含量增加,LDH释放增加,Tunel凋亡细胞增加,而同时加入VPA后,海马神经元漂浮细胞降低,活性氧含量减少,LDH释放减少,Tunel凋亡细胞减少;3.成功建立实验性脑型疟模型,腹腔注射VPA后小鼠生存时间延长,快速鼠昏迷和行为学评分降低,同时H&E染色显示VPA治疗后感染红细胞滞留及出血减少;伊文斯蓝染色结果显示VPA治疗后小鼠血脑屏障破坏减轻;脑组织中IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-α量均下调,IL-10量上调;4.成功建立实验性脑型疟模型,腹腔注射VPA后,脑组织中BDNF、GDNF量上调,NGF量无变化,膜片钳实验结果显示VPA处理后小鼠海马神经元突触后膜电位得到提高。结论1.通过免疫荧光染色及荧光实时定量可观察到:脑型疟小鼠血清抑制胎鼠来源神经干细胞向神经元方向分化,而VPA能在一定程度上挽救其抑制作用,使神经干细胞向神经元方向分化的比例升高;脑型疟小鼠血清促进其向星形胶质细胞分化,而VPA能在一定程度上使神经干细胞向星形胶质细胞分化的比例降低;2.脑型疟小鼠血清引起胎鼠来源神经元凋亡,而VPA能在一定程度上保护脑型疟小鼠血清引起的神经元凋亡;3.VPA腹腔注射能提高实验性脑型疟小鼠生存率,改善神经系统症状,减轻脑部炎症及感染红细胞滞留的情况,并减轻血脑屏障的破坏;4.VPA腹腔注射能提高实验性脑型疟能提高小鼠海马神经元突触后膜电位,对脑型疟小鼠发挥一定的神经保护作用。
乔丽君[3](2019)在《肾阳虚体质动物模型的构建及其线粒体能量代谢研究》文中认为目的:通过先后天病因病机复合造模法,构建肾阳虚体质动物模型。宏观行为学表征和微观分子生物学指标初步论证肾阳虚体质动物模型构建成功,并通过线粒体相关酶学指标与线粒体重测序法,研究肾阳虚体质与线粒体能量代谢低下的关联。方法:1.亲本筛选:SD大鼠雌性130只,雄性90只,通过寒热板示差法筛选亲代阳虚怕冷大鼠,寒热板得分大于300s,纳入亲代组,交配选育。2.造模方法:阳虚孕鼠低温环境、恐伤肾、盐黄柏灌胃复合造模,正常组孕鼠生理盐水灌胃。造模时间:捡到阴栓后,孕鼠开始造模、正常组正常喂养,直到仔鼠出生为止。3.造模后评价:观察子代鼠初生体重、数量。随机选取雌鼠8只、雄鼠8只、正常组8只,观察一般情况、体重、肛温等,进行旷场实验,观察大鼠扎堆时间、粪便粒数等;ELISA方法检测cAMP、cGMP含量。4.线粒体酶学检测:成模后随机从模型组和正常组选取雄鼠8只,采用ELISA方法检测,线粒体ATP酶、Complex I、ComplexⅢ、ComplexⅤ、Na+K+-ATPase含量。5.线粒体重测序检测:随机选取母鼠、模型组、正常组雌鼠各3只,运用DNA重测序技术进行线粒体全基因组测序。结果:1.亲本筛选结果:雌鼠85只,雄鼠41只。2.初生子鼠体重、数量模型组初生幼鼠体重明显低于正常组(P=0.000<0.01),正常组23只,模型组65只(死亡1只)。3.模型评价(1)宏观行为学结果1一般情况:正常组大鼠精神状态良好、活动正常、反应敏捷、目光有神、毛色光亮。模型组大鼠精神状态尚可、反应较迟钝、喜静、舌色偏暗,毛色晦暗、凌乱。2体重和肛温:模型组大鼠体重明显高于正常组(P=0.000<0.01),模型组大鼠的肛温低于正常组(P=0.002<0.05);3模型组较正常组大鼠饮水量降低(P=0.000<0.01);4模型组大鼠大便粒数较正常组大鼠大便粒数少(P=0.02<0.05);5扎堆时间:模型组与正常组雌性大鼠扎堆时间相比,模型组扎堆时间较长(P=0.01<0.05);模型组雄性大鼠的小便量较正常组雄性大鼠的小便量明显增多(P=0.000<0.01)。(2)微观生物学指标与正常组比较:模型组大鼠血清cAMP水平有升高趋势(P=0.177>0.05);血清cGMP水平显着升高(P=0.00<0.01);cAMP/cGMP比值显着性降低(P=0.032<0.01)。4.线粒体能量代谢相关酶学检测结果:模型组ComplexⅠ、Na+K+-ATPase明显低于正常组;正常组ComplexⅢ低于模型组。5.线粒体DNA重测序结果SNV结果显示:与参考碱基相比存在99个突变位点,其中错义突变21个,沉默突变72个,其余6个软件未给出突变类型。分别与基因:mt-Rnr1、Trnw、mt-Co1、mt-Co2、mt-Atp6、mt-Nd4相关。结论:1.基于先(恐伤孕鼠)后(寒冷环境)天复合造模法可成功构建肾阳虚体质大鼠模型。2.肾阳虚体质大鼠模型存在线粒体相关酶水平的改变,这与肾阳虚体质人群临床表现畏寒怕冷相一致,初步论证肾阳虚体质存在线粒体能量代谢功能的改变。3.肾阳虚体质动物模型线粒体突变位点的筛查,在一定程度上论证了肾阳虚体质与线粒体位点突变有关,提示肾阳虚体质可能存在与线粒体遗传相关的改变。
黄丽丽[4](2016)在《模拟微重力效应鼠脑中P-gp表达及其相互作用蛋白研究》文中认为近年来我国载人航天事业发展迅速,载人航天飞行实践次数逐渐增加,极大地推动了航天医学的发展。失重是航天员飞行过程中无法摆脱的不利因素,可以引起机体广泛的生理变化,如体液头向分布、血容量变化等,这些改变或可引起神经系统损伤或药物在机体内的药物动力学变化。P-gp(Permeability glycoprotein,P-gp)是位于细胞膜上的药物外排蛋白,其广泛表达于药物处置相关器官和血脑屏障,可维持脑内环境稳定,与药物的吸收、分布、代谢、排泄密切相关。本研究采用Morey-Holton大鼠尾悬吊模型,以不同模拟微重力周期鼠脑中P-gp为主要研究对象进行了以下三方面的研究。1)3、7、14、21 d模拟微重力对鼠脑P-gp表达及MDR1基因水平的影响结果表明模拟微重力3 d大鼠脑组织P-gp表达与正常组相比显着增加(p<0.05),表达量增加了36.4%,模拟微重力7 d大鼠脑组织中P-gp表达与地面组相比表达有所增加,增加量为17.9%,但无显着性差异;中长期模拟微重力14、21 d大鼠脑组织中P-gp表达量逐步趋于正常水平,与正常组相比蛋白增加量仅为8.0%(14 d组)和5.45%(21 d组),且无显着性差异。模拟微重力下MDR1基因表达情况与P-gp蛋白表达相似,3、7、14 d组与正常组相比均升高,且3 d具有显着性。随着吊尾时间的延长,吊尾21 d时,MDR1的基因表达又趋于正常水平。可能是短期模拟微重力效应使大鼠脑内产生了急性应激,MDR1基因调控P-gp大量表达或与维持神经系统内环境稳定有关。随着模拟微重力效应时间的延长,大鼠适应微重力状态,应激减弱,P-gp趋于正常水平。2)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CO-IP)结合质谱筛选与P-gp相互作用蛋白采用非标定量IBAQ蛋白质组学技术,对不同模拟微重力周期大鼠脑CO-IP复合物进行差异蛋白质组学分析,共鉴定到4组共有的P-gp相互作用差异蛋白66个。通过PANTHER、DAVID、STRING等生物信息学软件对这66个差异蛋白进行聚类分析,发现大部分蛋白为磷酸酶或磷酸二酯酶,提示磷酸化在调控P-gp通路过程中具有重要意义。在生物过程分析中这66个P-gp相互作用差异蛋白主要富集在药物应答、钾/钙离子转运、糖苷应答、ATP水解偶联转运、cAMP的催化过程等过程;细胞组成主要分布在细胞膜、细胞质溶胶、外泌体、线粒体、蛋白复合物、细胞外囊泡等;分子功能上主要能与钙离子蛋白激酶、ATP、泛素蛋白连接酶、糖蛋白、错误折叠蛋白等结合,具有鸟苷酸激酶、环核苷酸磷酸二酯酶、ATP酶等活性。KEGG通路分析发现这些蛋白主要在cGMP-PKG信号通路、cAMP信号通路、间隙连接、雌激素信号通路、钙信号通路、谷氨酸能突触等通路显着富集。通过生物信息学软件对组学数据的富集归类,得到14个较典型的P-gp相互作用差异蛋白;谷氨酸脱羧酶2、谷氨酰胺合成酶、磷酸二酯酶3A、微管蛋白4a、微管相关蛋白1b、囊泡融合ATP酶、钠/钾ATP酶(Atp1a1/Atp1b1)热休克蛋白(78kDa/60kDa)、ATP-柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、钙调蛋白、三肽基肽酶2,将这14个蛋白进行功能分析并结合STRING相互作用分析软件,探究其可能P-gp调控机制及相关信号通路。分析结果提示与P-gp相互作用的蛋白大致可在这几个信号通路与P-gp相互作用:(1)P-gp主动转运的ATP能量供应(2)P-gp在细胞内的合成、运输和降解(3)cAMP/PKA介导的P-gp磷酸化(4)谷氨酸诱导COX-2级联的P-gp表达。3)Western-blot验证P-gp相互作用蛋白P-gp是一种能量依赖型药物外排蛋白,通过蛋白质组学数据分析,发现Atp1b1与P-gp存在显着相互作用,或与P-gp主动转运能量供应有关。采用Western-blot对CO-IP复合物中的Atp1b1进行了验证,与质谱结果一致,提示质谱结果的可靠性。
段永强[5](2014)在《Ca2+/CaM信号通路在大鼠脾虚证躯体泛化效应中的响应及益气健脾中药干预研究》文中研究表明研究背景中医学所论述的“脾”是一个功能性结构单位,从“脾”的生理功能来分析,包括了胃肠、胰腺、肝胆、脾脏甚至大脑等脏器的部分生理功能,是一个多系统、多器官的综合功能单位;而在病机演变上,中医“脾虚证”的发生涉及消化、免疫、内分泌、神经、运动等系统生理功能的紊乱;研究表明益气健脾类单味中药或复方(如人参、党参、黄芪、红芪以及四君子汤、六君子汤、补中益气汤等)对脾虚证具有良好的防治作用。生命系统观以及细胞信号转导理论认为,生命现象(生理活动和病理状态)的发生本质上都是机体内外和不同系统、不同组织细胞之间多种细胞信号传递或相互影响的结果(即整合生理学和整合病理学),这种认识与中医药学的整体观念、五脏一体观等理论内涵相一致。其中Ca2+/CaM信号通路中的关键分子具有多种生物学功能,并且与调节细胞各种酶的活性、调节肌肉收缩和舒张、调节神经系统功能、参与刺激分泌藕联、调节糖代谢、调节前列腺素和胰岛素合成与释放、增强大脑记忆等生理作用密切相关。近年来学界对脾虚证实质的研究体现出从多系统、多脏器、多角度、多层次(细胞、分子和基因水平)研究的趋势。从中医临床证候学的角度来分析,“脾虚”症候要素包括:面色淡白或萎黄,纳呆食少而运化迟滞、腹胀或腹泻、食后胀甚、神疲乏力、少气懒言、肢体倦怠、严重者则形体消瘦、肌肉萎缩、倦怠少动、恶风易感、体虚多病、或肥胖浮肿、舌淡苔白、脉细或沉弱等“体虚”之证,涉及消化、神经、内分泌、免疫、物质代谢、运动等系统生理功能的紊乱或低下,故“脾虚证”证候要素具有躯体泛化的趋势和效应。现代研究证明Ca2+/CaM-CaMⅡ信号转导通路在多种疾病发生、多脏器功能紊乱中具有重要作用,而且基于上述Ca2+/CaM信号通路的生物学功能和脾虚证相关研究可以推测:Ca2+/CaM相关信号通路的生物学功能可能与中医所论述的“脾主运化、主统血、在体合肌肉主四肢、在志为思”等理论内涵具有一定的相关性,但相关探讨尚处于初步研究阶段。研究目的本文基于中医整体观念,以“脾虚证”的临床证候要素和病机演变规律研究为基础,提出“脾虚证躯体泛化效应”的证候模式,并根据Ca2+/CaM相关信号通路生物学功能的认识,建立"Ca2+/CaM细胞信号转导途径在脾虚证躯体泛化效应中的可能作用”工作假说,以期从Ca2+/CaM细胞信号转导途径角度深入研究脾虚证病机内涵、证候基础以及红芪提取物、四君子汤对该信号通路关键分子的干预作用。研究方法采用综合法(苦寒耗气法+游泳力竭法+饥饱失常法)建立脾虚证大鼠模型,并应用红芪提取物和四君子汤反证治疗。通过检测大鼠一般生存状态、每日平均摄食量和每日平均体质增加量、游泳耐力时间、胃残留率和小肠推进率、血清D-木糖含量、小肠组织胃肠激素GAS、MOT、SS、VIP含量等指标评估脾虚证大鼠模型。在成功建立脾虚证大鼠模型的基础上,检测脾虚证发生过程中以及益气健脾中药(红芪提取物、四君子汤)干预后各组大鼠空腹血糖、血清胰岛素水平以及不同脏器(小肠、胰腺、骨骼肌、肝)组织代谢相关酶活性的变化;采用激光共聚焦技术检测各组大鼠小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织游离钙离子([Ca2+]i)浓度;采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测各组大鼠小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织Ca2+/CaM信号通路中CaM、CaMKⅡ基因和CaM、CaMKⅡ、磷酸化CaMKⅡ相关蛋白差异表达变化规律。研究结果1.脾虚组大鼠随着造模时间的延长,逐渐出现怠动少食、被毛稀疏、消瘦拱背、动作迟缓,并伴见每日摄食量减少,体重增加缓慢、排便次数增多、肛周污秽,部分动物出现脱肛等“脾虚”症状,脾虚证宏观证候积分显着升高,而且游泳耐力时间明显下降(P<0.05),胃残留率升高而小肠推进率降低(P<0.05),血清D-木糖含量降低(P<0.05),且以脾虚模型21d组变化显着(P<0.05);2.脾虚7d组大鼠空腹血糖、血清胰岛素水平虽有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05),随着造模时间的延长,脾虚模型14d、21d组大鼠空腹血糖和血清胰岛素水平有明显下降趋势,以脾虚模型21d组变化显着(P<0.05);随着造模时间的延长,脾虚组大鼠小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织Na+-K+-ATPase、 Ca2+-Mg2+-ATPase和SDH活性显着下降(P<0.05),LDH活性显着升高(P<0.05);与空白组比较,脾虚7d组大鼠小肠组织GAS、MOT有降低趋势,SS和VIP含量有升高趋势,但组间差异无统计学意义(P>0.05),模型21d组大鼠小肠组织GAS、MOT显着降低,SS和VIP含量显着升高,组间差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。3.脾虚21d组大鼠小肠组织[Ca2+]i浓度显着升高(P<0.05),但胰腺、骨骼肌和肝组织[Ca2+]i浓度显着降低(P<0.05),同时小肠组织Ca2+/CaM信号通路关键分子CaM、CaMKⅡ基因以及CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ表达上调(P<0.05),而胰腺、骨骼肌和肝组织CaM、CaMKⅡ基因以及CaM、CaMKⅡ, p-CaMKⅡ表达下调(P<0.05)。4.红芪提取物、四君子汤能够明显改善脾虚大鼠一般生存状态,提高游泳耐力时间和血清D-木糖含量,降低胃残留率,提高小肠推进率(P<0.05),升高小肠胃肠激素GAS、MOT水平,降低SS、VIP水平(P<0.05),且以四君子汤作用显着。5.红芪提取物、四君子汤能够明显提高脾虚大鼠空腹血糖、血清胰岛素水平(P<0.05),提高小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase和SDH活性(P<0.05),降低LDH活性(P<0.05),并以四君子汤作用显着。6.红芪提取物、四君子汤能够明显降低小肠组织[Ca2+]i浓度(P<0.05),升高胰腺、骨骼肌和肝组织[Ca2+]i浓度;同时红芪提取物、四君子汤均能下调小肠组织CaM、CaMKⅡ基因以及CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白表达(P<0.05),上调胰腺、骨骼肌和肝组织CaM、CaMKⅡ基因以及CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白表达(P<0.05),且以四君子汤作用显着。研究结论1.采用苦寒破气法、游泳力竭法和饥饱失常法能够成功复建较为理想的脾虚证动物模型,表现为脾虚大鼠一般生存状况较正常大鼠差,随着造模时间的延长,模型大鼠逐渐出现平均每日摄食量减少,体重增长缓慢、肛温降低且游泳耐力时间下降,脾虚证宏观证候积分显着升高;脾虚证大鼠胃残留率升高而小肠推进率减低,血清D-木糖、空腹血糖、血清胰岛素水平下降;胃肠激素GAS、MOT、SS、VIP分泌紊乱,且造模时间以21d为宜。2.脾虚证大鼠空腹血糖、血清胰岛素水平下降,存在糖代谢功能低下;小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase和SDH活性显着下降,LDH活性显着升高,提示脾虚证大鼠小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织细胞能量代谢紊乱。3. Ca2+/CaM-CaMKⅡ信号通路在脾虚证病程中存在表达差异,在小肠组织以高表达为主:[Ca2+]i浓度升高,CaM、CaMKⅡ基因和CaM、CaMKⅡ, p-CaMKⅡ蛋白表达上调;而在胰腺、骨骼肌、肝脏组织中[Ca2+]i浓度降低,CaM、CaMKⅡ基因和CaM、CaMKⅡ, p-CaMKⅡ蛋白以低表达为主。4.脾虚证躯体泛化效应的发生涉及机体糖代谢平衡紊乱,而且伴有小肠、胰腺和骨骼肌能量代谢紊乱,Ca2+/CaM-CaMKⅡ信号通路关键分子在脾虚大鼠不同组织中存在差异表达。5.红芪提取物、四君子汤均能改善脾虚大鼠一般生存状态,延长游泳耐力时间,调节胃肠激素GAS、MOT、SS、VIP分泌和胃肠转运功能;提高脾虚大鼠空腹血糖、血清胰岛素水平及小肠、胰腺、骨骼肌、肝组织能量代谢相关酶活性,调节小肠、胰腺、骨骼肌、肝组织CaM、CaMKⅡ基因和CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白正常表达,且以四君子汤作用显着,说明中医药理论指导下的中药复方四君子汤较单味药红芪提取物的干预作用更具有优势。
邵江娟[6](2013)在《牡蛎配伍葛根药效物质基础研究》文中进行了进一步梳理牡蛎为牡蛎科动物长牡蛎(Ostrea gigas Thunberg)、大连湾牡蛎(Ostrea talienwhanensis Crosse)或近江牡蛎(Ostrea rivuLaris GouLd的贝壳,是历版《中国药典》收载的中医临床常用药,味咸,微寒。归肝、胆、肾经。生牡蛎重镇安神,潜阳补阴,软坚散结。牡蛎壳含碳酸钙90%以上,有机基质由不同大分子组成,主要为蛋白质和多糖。目前对于牡蛎主要药理作用研究包括牡蛎镇静、抑制自发活动及安眠作用。目前国内外对于牡蛎药效仅是整体研究,特别是有机质成分及其药理作用,尚未见报道。牡蛎临床配伍常用葛根进行降血压治疗,而葛根主要药效物质成分明确、药理作用及机制成熟,本课题就选取牡蛎配伍葛根研究其药效物质基础。课题对于贝壳类海洋药的开发利用以及中药科学化发展有重要意义。本文对牡蛎基本化学成分进行了分析,对无机质成分采用X射线衍射的方法建立了药材指纹图谱,对有机质成分通过离子交换层析、反向C8柱层析的方法进行分离,得到寡肽类成分。对牡蛎药效物质基础分部位进行了镇静药理作用考察。接着对牡蛎配伍葛根药效物质基础进行了研究,包括配伍前后理化性质的变化、葛根对牡蛎钙的溶出作用、牡蛎对葛根药效物质的溶出作用等。对牡蛎配伍葛根药理作用及机制进行了探讨,包括镇静作用和降血压作用。最后建立液质联用的方法对牡蛎配伍葛根前后葛根素在大鼠体内的药代动力学进行了研究,并采用光谱学和分子对接手段对葛根素与药物代谢酶和转运蛋白的体外相互作用进行了探讨。第一部分是文献研究。查阅国内外相关文献,对牡蛎的研究概况、葛根的研究概况、中药复方配伍药效物质基础研究进展进行了综述,为本课题的研究提供思路和方法。第二部分对牡蛎化学成分进行了研究。采用差热分析、红外光谱和X射线衍射的方法建立指纹图谱分析了无机质组成,主成分是碳酸钙(CaCO3),升高温度会逐步分解变成氧化钙(CaO),牡蛎药材XRD指纹图谱具有较好的专属性;对牡蛎壳有机质进行研究,采用双缩脲法进行了总肽的定性和定量分析,表明为寡肽,总肽含量为38.02%,采用苯酚-硫酸法分析了总糖含量,进行了有机质的氨基酸组成分析;通过离子交换层析对有机质进行了初步分离提纯,并通过质谱分析进行了分子量分布范围分析,表明分子量在1000以下;进一步进行了反向C8柱层析得到寡肽,采用液质联用分析了纯度,最后对纯化的寡肽进行了抗氧化性研究,表明具有很好的抗氧化性能,清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、超氧阴离子自由基的能力呈现量效关系。第三部分对牡蛎的镇静药理作用进行了研究。本部分考察了牡蛎、CaCO3以及牡蛎有机质对戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间的影响,探讨了其镇静的物质基础。结果表明,牡蛎单剂量给药不显示镇静作用,而连续给药则显示出明显的镇静作用,并呈现量效关系。提示牡蛎的镇静作用具有叠加性,作用途径和机制与安定不同。CaCO3化学药品呈现生牡蛎一样的镇静作用,而牡蛎有机质部分协同戊巴比妥钠的睡眠作用与其他牡蛎制备液相比为弱,提示牡蛎的镇静作用与CaCO3主要相关。进一步采用western blot方法检测单胺类兴奋性神经递质5-羟色胺受体(5-HTR)和氨基酸类抑制性神经递质Y-氨基丁酸受体(GABAR)的表达情况。结果表明,CaCO3组、生牡蛎混悬液组、生牡蛎有机质组及水不溶性组的小鼠脑组织中5-HTR的表达均不同程度地下调,而GABAR的表达均不同程度地上调,提示生牡蛎不同制备液及CaCO3化学药品的镇静作用与对神经中枢的兴奋性神经递质转导的抑制与对抑制性神经递质转导的增强有关。第四部分研究了牡蛎配伍葛根的药效物质基础。首先研究了牡蛎配伍葛根对水提液电导率、盐度、黏度、浊度、pH的影响,结果表明配伍后随着牡蛎比例增大,水提液电导率、盐度、黏度和浊度均减小,同时pH增大。理化参数中浊度和黏度的变化显示,牡蛎与葛根配伍可使得其不溶性成分大量溶解对促进药物的吸收大有益处。电导率与盐度的变化显示,葛根中的黄酮类化合物等可能是与牡蛎溶出的Ca离子形成络合物的形式发挥作用。然后研究了葛根对牡蛎Ca的溶出作用,随着药对中葛根比例增大,Ca含量增大,即葛根促进了牡蛎Ca的溶出;同时发现,以化学药品CaCO3替代牡蛎,在相同比例条件下,Ca含量会下降,说明牡蛎不可用化学药品CaCO3替代。水提液中可溶性Ca是以多种形态共存的复杂平衡体系,大多以离子态和无机态形式存在,也有少量的有机结合态。最后研究了牡蛎对葛根药效物质溶出的影响,结果表明牡蛎对葛根主要药效成分葛根素和葛根总黄酮的溶出有明显的作用。另外,相同条件下以CaCO3代替牡蛎,对葛根素和葛根总黄酮的溶出效果比牡蛎弱,说明说明牡蛎不可用化学药品CaCO3替代。第五部分对牡蛎配伍葛根的药理作用进行了研究。首先是镇静作用,考察了牡蛎、葛根、牡蛎与葛根配伍不同剂量对戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间的影响,结果表明配伍组比牡蛎组镇静作用加强,且配伍高剂量组作用更明显。进一步以western blot方法检测脑组织中5-HT受体和GABA受体的表达情况,结果显示,牡蛎组、葛根组及二者配伍组均可不同程度地降低小鼠脑内5-HTR的表达并升高GABAR的表达,提示牡蛎配伍葛根能够更为明显地调控小鼠脑内神经递质受体的表达,从而产生配伍增效的作用。然后是降血压作用,以自发性高血压大鼠为模型,研究了牡蛎、葛根、牡蛎与葛根配伍不同剂量对模型动物血压、血清Ca、血管平滑肌胞内Ca、一氧化氮、内皮素、心钠素、肾素、血管紧张素Ⅱ、醛固酮、血液流变学等指标以及左心室的影响,结果表明两药及其配伍对这些指标均有调控作用,这些作用与其抗高血压作用密切相关。第六部分对牡蛎配伍葛根后葛根素在大鼠体内的药代动力学进行了研究,建立了液质联用的方法,采用电喷雾离子源,检测方式为负离子,多离子反应监测模式,以芦丁作为内标,通过DAS 2.0软件进行药代动力学数据处理,得到了牡蛎配伍前后葛根素的药时曲线。结果表明,配伍后药时曲线下面积大,峰浓度高,说明在牡蛎的协同作用下,葛根素吸收进入大鼠血液循环的相对数量大,吸收速度快;灌胃药对水提液后表观分布容积大,说明在牡蛎的协同作用下,葛根素更多地分布在组织中,与组织或蛋白有特殊的亲和力;灌胃药对水提液后半衰期大,平均滞留时间长,说明在牡蛎的协同作用下,葛根素消除较慢。牡蛎对于葛根药效成分的代谢影响较大,有助于葛根素的吸收和分布,第七部分研究了葛根素与药物代谢酶(细胞色素P450)和转运蛋白(人血清白蛋白)的体外相互作用,并研究了 Ca离子的影响。采用荧光光谱、紫外光谱、圆二色谱分析方法研究了葛根素与细胞色素CYP1A2和CYP2D6的相互作用,同时采用Autodock软件进行了分子对接研究,结果表明葛根素对CYP1A2和CYP2D6的猝灭机制均为静态猝灭,主要结合作用力为疏水作用力和氢键,葛根素能使CYPs的构象发生变化,Ca离子能够使葛根素与CYPs的结合能力更强;采用荧光光谱、紫外光谱、核磁共振的分析方法研究了葛根素与人血清白蛋白(HSA)的相互作用。结果表明葛根素对HSA的猝灭机制为静态猝灭,主要结合作用力为疏水作用力和氢键,葛根素能使HSA的构象发生变化,Ca离子能够使葛根素与HSA的结合能力更强。这些研究结果与上一章药代动力学的结果彼此相互印证,相辅相成。综上所述,牡蛎药效物质基础以CaCO3为主,但是化学药品CaCO3不能够完全代替牡蛎的作用,牡蛎配伍葛根对药效物质的溶出有促进作用,配伍后镇静和降血压药理作用均增强,本课题对贝壳类中药与植物药配伍增效的化学与药理机制研究作出了探索。
杨旭杰[7](2012)在《基于统计方法模型分析的中药复方专利保护研究》文中研究说明专利制度以创造财富为杠杆,寻求着恰当的利益支点,试图一端有效地激发人们创造的热情,另一端把个人的知识财富转化为无尽的社会财富,以高效优质地推动人类物质文明和精神文明的巨大进步。中药复方专利保护是在护卫本土中药资源、促进中药走向世界的进程中应运而生的制度。十多年来,中药复方专利保护制度以其特有的法律保护、科学审查、全面公开、国际交流之特性,在保护和鼓励中药复方研发、促进创新成果的推广应用、推动中医药基础理论和科研进展、建立开放的中医药知识市场、加速中药产业化进程、促进医药经济繁荣、拓展中医药国际交流、引进和利用国外先进技术等诸多领域发挥了无可替代的作用。中药复方专利保护的研究引发了业内学者的高度重视,只是其研究尚属于方兴未艾阶段,系统的定性研究及统计学模型分析还未出现。本课题以跨学科的知识准备和广泛的文献收集作为基础,采用理论研究与实证分析相结合、纵向比较和横向对比相参照的研究方法,结合简单统计与高阶统计,建立统计模型的指标评价体系,旨在深入剖析中药复方专利发展进程中的影响因子及优化方案。在上述研究路线指引下,研究内容涵盖中药复方研发与专利保护的融合、中药复方专利发展进程、区域进展、专利权人分布、中药复方功效与专利获取的关系、中药复方专利质量提升与社会收益的联系、专利维持之影响因素、特定防治领域的专利特点、有效专利用药规律等方面;通过对以上内容科学的统计分析,得出了精确可信的研究结果与结论:中药复方专利保护对于实现社会收益、推进深入研发、促成中药产业化、提升中药国际地位等诸多领域影响深远,虽然在近二十年的时间里经历了三次飞跃,但是区域发展不平衡,职务发明比例偏低,与迅猛发展的中药复方研发无可同日而语;中药复方专利的发展与国家专利法规的健全及专利战略的强化、中医药科研投入的增加和创新水平的提高、世界医药市场的需求加大及中医药国际认可度的提升等因素密切相关,同时,中药复方专利的发展状况与其防治领域具有相关性,如心脑血管中药复方专利的发展强于整体发展态势,对其组方用药规律的研究有助于本领域新的研发与专利获取;长期以来我们以专利的数量来衡量其发展水平存在一定的局限性,而专利的质量是体现其价值的重要指征,提升中药复方专利的质量须从多方面着手;严格复方专利审查是提升其质量的重要环节,严格规制中药复方专利“三性”对于维护民众身心健康、推动中药科技进步、提升中药的国际地位意义重大,同时也是增加社会整体收益、节约社会成本、促进中药新药的创新研发与保护处于良性循环的重要保证。结合研究过程、结果及结论,本论文分别从宏观、中观、微观三个层面给出应对措施:国家可将中药复方研发与专利保护作为建设创新型国家及实施国家知识产权战略的重要组成部分,构建主从协调的中药复方专利战略体系及全方位、多层次的中药复方专利保护规划,同时将中药复方专利指标作为该领域科研立项的重要标尺,促成中药复方研发与专利保护的高效运营机制;行业协会应充分发挥有益补充,协助政府推进新药研发与保护;国家知识产权局要在提升中药复方专利质量领域展现其重要作用;中药企业合理发挥其在中药复方专利保护体系中的主力地位,正确分析并利用中药复方专利信息、实行高效的专利管理制度、合理运用专利策略、制定适宜的专利战略;中医药院校及科研院所通过优选中医药组方作为研发对象,强化科研人员专利意识的培养,成立职责明确的科研成果专利管理机构,促进成果转化,提高专利利用率,促成优质高效的产学研联盟等多方途径发挥其智囊团优势,全面提升中药复方专利质量。本研究首次将聚类分析、回归分析、频数分析等多种统计学方法运用于中药复方专利研究之中,从时间、空间、专利功效、专利权人、专利内涵等多个视角系统剖析了中药复方专利发展的规律性及内在机理;运用西方社会收益理论及经济学模型探讨中药复方专利的“三性”及其价值评价,实现了中药复方研发、专利保护与社会价值实现三者的有机衔接;结合统计学原理与中药复方专利特点,构建了用以评价中药复方专利运行效绩之相对客观、科学的指标体系,结果更具全面性、系统性、客观性,可操作性较强;结合多年的临床实践对照本研究中有关中药复方专利功效聚类分析结果,以心脑血管中药复方专利为例,全面系统地研究了心脑血管中药复方专利的年度发展、专利权人分布、维持有效的影响因素以及有效专利的组方遣药规律,为该领域中不同实力的机构及个人展开新药研发及专利保护提供了针对性较强的指引和参照;采用系统分析与功能分析法,详细论述了中药复方专利质量在整体系统中的权重与价值,在一定程度上纠正了中药复方专利领域对于专利申请量、授权量的重视程度高于专利质量之现状。所有这些全面体现出本研究的创新性,如果研究成果能够在中药复方专利发展进程中发挥助推作用,也即实现了该科研立题的初衷。
付敏[8](2009)在《胡椒碱/五味子甲素对海马神经元网络抑制作用研究》文中研究指明癫痫是神经内科最常见的疾病之一。由于癫痫的长期反复发作,严重影响了患者的生活质量和社会工作能力,对个人及社会都造成很大的危害。然而目前临床使用的抗癫痫药物只能使70-80%左右的患者病情得到控制,20-30%的患者会发展为难治性癫痫。并且药物也往往只是对痫性发作的抑制,不能防止癫痫灶的形成,不能影响癫痫病进程。同时,大量长期服药还伴随有各种毒副作用对身体的伤害,因此对新的抗癫痫药物的研制具有重要的现实意义。中药治疗癫痫具有悠久的历史并有显着的疗效,但是由于中药的成分复杂,具体药理学机制的实验证据缺乏,阻碍了它的国际化和标准化。本论文选取了两种传统中药(胡椒和五味子)的主要有效成分(胡椒碱和五味子甲素、乙素),结合钙成像和膜片钳技术,以体外培养的海马神经元网络为实验模型,深入研究了它们对神经元网络兴奋性的调节作用,并分析其可能的机制,得到以下结论:1.一定浓度的胡椒碱和五味子甲素、乙素能够有效抑制体外培养的海马神经元网络自发同步钙振荡,并且都呈浓度依赖关系;2.胡椒碱对海马神经元电压激活的钠离子、钾离子、钙离子通道电流没有抑制作用,但对谷氨酸兴奋毒性造成的神经元凋亡有一定的保护作用;五味子甲素对海马神经元电压激活钠离子和钙离子通道电流有显着抑制作用,但不影响电压激活钾离子通道电流;3.胡椒碱能够有效抑制海马神经元的自发放电和sEPSC频率,但是对KA、NMDA和Na2ATP引起的突触后电流没有抑制作用;五味子甲素对海马神经元sEPSC的频率没有影响,但是抑制了sIPSC的频率;4.五味子甲素与乙素在低于各自有效浓度时的混合物即可有效抑制海马神经元网络的钙振荡频率,并且以不同比例混合,抑制能力不同;5.胡椒碱和五味子甲素在低于各自有效浓度时的混合物对钙振荡频率有轻微的加快作用。以高浓度混合时,不同比例的混合物对钙振荡频率的抑制率不同。
周旋[9](2009)在《枸杞多糖粗提物抗衰老作用及其与信号传导系统Ca2+-CaM的相关性研究》文中研究表明目的:研究枸杞多糖粗提物抗衰老作用及其与信号传导系统Ca2+-CaM的相关性。方法:利用D-半乳糖诱导小鼠,建立衰老模型,研究枸杞多糖的抗衰老作用。于给药15周、30周时以小鼠学习记忆行为、抗疲劳能力、组织超微结构及血液学、酶学、CaM等生理生化指标变化对枸杞多糖抗衰老作用进行药效学评价,探讨其抗衰老机制并分析其与Ca2+-CaM信号传导系统的相关性。采用Phenyl-Sepharose层析法从牛脑中分离纯化CaM,PDE法检测其活性;通过SDS-PAGE、PAGE检测其分子量并观察CaM有无Ca2+结合时的电泳行为;应用紫外扫描光谱对CaM进行鉴定。以交联剂碳二亚胺制备CaM偶联抗原并免疫动物,建立间接Elisa法检测免疫动物抗血清效价,以定量测定衰老模型对照组及枸杞多糖组动物的CaM含量,研究其与抗衰老作用的相关性。结果:在枸杞多糖粗提物抗衰老实验中,连续给药15周、30周时,小鼠机体退行性变化有明显的改善;给药组动物在Morris水迷宫、跳台、避暗实验中,到达目标时间缩短,逃避潜伏期延长,错误次数减少、学习记忆能力明显增强;跑步耐力实验中抗疲劳能力增强;胸腺、脾脏指数退行性变化减轻;血流速度加快;血糖浓度有所降低;相关组织和血清中MAO-B、AchE、iNOS、MDA水平降低; SOD、GSH-Px、CAT、ATPase、NO、TNOS活力显着提高;肝肾组织细胞退行性形态学变化较衰老模型对照组减轻。经Phenyl-Sepharose层析法纯化的CaM对PDE有明显的激活作用,电泳结果显示为均一条带,分子量约为17.3kDa,在SDS-PAGE中,结合Ca2+的CaM比未结合Ca2+时迁移率快;而在PAGE中,结合Ca2+的CaM迁移率低于未结合Ca2+;紫外光谱扫描显示在251、260、267、272和283 nm处有5个特征性吸收峰。以CaM偶联抗原免疫动物6周后,琼脂扩散实验有明显的抗原-抗体沉淀线,经ELISA法检测,免疫动物血清效价为1:800,枸杞多糖组小鼠脑组织CaM水平升高。结论:小鼠抗衰老实验结果表明,枸杞多糖能够增强机体的学习记忆能力、抗疲劳能力和免疫力,并能有效清除机体自由基、提高抗氧化酶活力,保护肝、肾等脏器,从生理生化学等方面对机体起到保护作用,具有明显的抗衰老作用。用Phenyl-Sepharose纯化CaM和用碳二亚胺法制备CaM偶联抗原方法简便易行,间接ELISA法可用于定量检测CaM。衰老小鼠脑组织CaM水平下降,可能与细胞内转运Ca2+的ATP酶活力下降有关,因此间接地导致脑组织神经递质水平下降,从而影响学习记忆能力。
王佩[10](2008)在《实验性癫痫大鼠认知功能障碍的机制探讨及尼莫地平的影响》文中研究表明癫痫是由于脑部兴奋性过高的某些神经元突然异常放电引起的脑功能异常,是一种常见的慢性临床综合征。临床发现30%~40%的癫痫患者除癫痫发作症状外,常伴有记忆力减退、注意力分散等认知功能受损的表现,严重影响了患者的生活质量。癫痫与认知功能损害的关系已被人们广泛重视,并已成为现代癫痫病学研究的热点之一,但癫痫后认知功能损害的机制还不清楚。目前认为,突触是神经元之间结构和功能的接触点,是神经信息传递的关键部位,突触结构和功能的完整对于保证神经元获得信息并顺利进行信息传递、加工和贮存是非常重要的。突触可塑性是指突触在一定条件下通过改变形态而调整功能的能力,在神经系统的发育、成熟及学习记忆等生理过程中起重要作用。突触可塑性变化主要表现在突触囊泡数密度(synaptic vesicles density, SVD)、突触间隙的宽度(the width of synaptic cleft, WSC)及突触后膜致密物(postsynaptic density, PSD)的厚度等方面的变化。突触可塑性和海马的长时程增强(long-term potentiation,LTP)密切相关,LTP反映突触水平的信息存储过程,是学习记忆的分子基础。突触素(synaptophysin, SYN, P38)作为突触囊泡的特异性标志蛋白,其密度和分布可间接反映体内突触的数量和分布情况,与突触重建及认知过程密切相关。突触后致密物95(postsynaptic density 95, PSD-95)串集N-甲基-D-门冬氨酸(N-methy1 -D-aspartate, NMDA)受体,而此受体是诱发LTP的必要条件。LTP的形成是突触前后机制共同作用的结果。P38反映了突触前膜递质的释放,PSD-95反映了突触后膜受体的有效性。钙作为神经信号传递的重要信使,参与了学习记忆的神经机制,神经细胞内钙离子浓度(intracellular concentration of calcium, [Ca2+]i)的微小变化就可以引起一系列生理乃至病理性改变。Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα(calcium/calmodulin-dependent protein kinase IIα, CaMK IIα)是海马内含量最高的一种蛋白,也是PSD的主要成分,其自动磷酸化与LTP的维持(<3小时)密切相关,更长时间的LTP的维持需要一系列基因的表达和新蛋白质的合成,而环磷腺苷反应单元结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)是细胞内的转录转导因子,调节基因的转录和蛋白质的合成,是短时记忆向长时记忆转化的关键。癫痫作为高频刺激(high frequency stimulation, HFS),可以引起谷氨酸大量释放,钙离子内流,诱导兴奋性氨基酸毒性作用及钙超载,频繁HPS是否引起学习记忆能力下降,钙信号如何沿Ca2+-CaMK II-CREB传递,同时,调节谷氨酸释放的突触前膜囊泡(P38)及固定谷氨酸受体的突触后膜成分PSD-95如何变化,突触超微结构发生了什么改变,所有这些我们并不清楚,而这些可能为研究癫痫后认知功能障碍的机制找到一些新的突破点。尼莫地平(nimodipine, NMD)是选择性作用于脑血管和神经元的双氢吡啶类钙通道阻滞剂,除具有扩张脑血管,增加脑供血等作用外,还可以阻断钙通道,减轻钙超载,保护神经元。近年的研究表明,尼莫地平可以改善多种原因导致的学习记忆障碍,但该药对癫痫后认知功能障碍的实验研究尚未见相关报道。有鉴于此,本文通过对突触可塑性及钙信号转导的研究,探讨癫痫后认知功能障碍的可能发生机制,并观察尼莫地平的脑保护作用。第一部分慢性癫痫大鼠模型的制备、行为学测定及尼莫地平的影响目的:建立戊四氮点燃慢性癫痫大鼠模型,观察其学习记忆能力的变化及尼莫地平的影响。方法:选用健康雄性SD大鼠,经两次Y-迷宫筛选合格后随机分四组。NC(normal control)组大鼠(35只)每日腹腔注射生理盐水3.5 ml/kg,共44 d。PTZ组(40只)每日腹腔注射1% PTZ 35 mg/kg,连续44 d,自给药第31天起,每日PTZ注射前15 min腹腔注射生理盐水3.5 ml/kg,共14 d。NMD1组(40只)及NMD2组(40只)每日腹腔注射1% PTZ 35 mg/kg,连续44 d,自给药第31天起,每日PTZ注射前15 min分别腹腔注射NMD 1.25 mg/kg、2.5 mg/kg ,共14 d。造模成功后描记脑电图(electroencephalogram, EEG)变化,并采用Morris水迷宫和Y-迷宫实验,进行大鼠学习和记忆成绩的测试。结果:大鼠在注射PTZ后第6~10天起开始出现凝视、点头、反复洗脸动作、面部及头部抽搐等,以后发作症状逐日加重,于给药第18~24天出现全身肌阵挛、双前肢抬起,最终发生全身强直-阵挛性发作,达到RacineⅣ~Ⅴ级的点燃标准,以后每天均有Ⅳ~Ⅴ级发作。第30天时PTZ组大鼠35只完全点燃,NMD1组34只完全点燃,NMD2组35只完全点燃。第31~44天,PTZ组大鼠每天仍有Ⅳ~Ⅴ级癫痫发作,NMD1和NMD2组大鼠癫痫发作程度减轻。NC组大鼠自始至终无癫痫发作表现。EEG表现:NC组大鼠EEG以α、β波为主,背景正常,无异常放电现象。PTZ组大鼠EEG表现为在基础波背景下,阵发性出现大量高幅尖波、棘波、棘慢复合波,持续1~2 s。NMD1组和NMD2组大鼠EEG表现为痫性放电受到抑制,在基础波背景下可见散在少量棘波或尖波,波幅降低。Morris水迷宫实验中定位航行实验结果:每日逃避潜伏期取其平均值进行比较。第1天,四组大鼠的逃避潜伏期比较无统计学意义(P>0.05);第2天,与NC组的逃避潜伏期(15.14±4.69)s比较,PTZ组逃避潜伏期(27.36±6.13)s明显延长( P<0.05);NMD1组和NMD2组的逃避潜伏期(21.66±5.21)s及(19.76±5.81)s较PTZ组缩短( P<0.05),但与NC组比较明显延长(P<0.05);NMD1组和NMD2组的逃避潜伏期比较无统计学意义。第3天,PTZ组大鼠的逃避潜伏期(7.71±1.30)s与NC组(4.46±1.11)s比较有显着性差异(P<0.01);NMD1组和NMD2组的逃避潜伏期(5.94±1.19)s及(5.69±1.03)s仍短于PTZ组( P<0.05),但长于NC组( P<0.05);NMD1组和NMD2组的逃避潜伏期比较无统计学意义(P>0.05)。空间探索试验结果:PTZ组大鼠120 s内穿越平台区域的次数(5.73±2.14)明显低于NC组(9.25±2.18)( P<0.01);NMD1、NMD2组大鼠120 s内穿越平台区域的次数(8.58±2.12)及(7.51±2.05)与PTZ组比较明显增多(P<0.01),但与NC组比较无统计学意义(P>0.05);NMD1组和NMD2组大鼠120 s内穿越平台区域的次数二者比较无统计学意义(P>0.05)。在平台象限的游泳时间四组比较无显着性差异(P>0.05)。Y迷宫检测结果:PTZ组大鼠的错误反应次数(error number, EN)(12.75±2.50)与NC组(6.25±3.10)比较明显增多(P<0.05);NMD1组和NMD2组的错误反应次数(8.75±2.22)和(8.00±3.16)与PTZ组比较又明显减少(P<0.05),但NMD1组和NMD2组与NC组比较无显着性差异(P>0.05);NMD1组和NMD2组比较也无显着性差异(P>0.05)。全天总反应时间四组比较无统计学意义(P>0.05)。结论:本实验建立的戊四氮点燃癫痫大鼠模型类似人类慢性癫痫发作,且具备学习和记忆能力缺损,是研究癫痫后认知功能障碍比较理想的动物模型,尼莫地平可以部分改善慢性癫痫大鼠的学习记忆功能缺损。第二部分慢性癫痫大鼠海马突触后致密物95与突触素表达的变化及尼莫地平的影响目的:观察戊四氮点燃慢性癫痫大鼠海马P38及PSD-95表达的变化及尼莫地平的影响,探讨P38及PSD-95在癫痫后认知功能障碍中的作用与意义。方法:每组大鼠各取8只,10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,取含海马脑段,石蜡包埋,冠状切片,采用SP法行PSD-95及P38免疫组化染色,测定免疫反应产物吸光度。每组大鼠各取8只,迅速分离海马,Trizol提取总RNA,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测定大鼠海马PSD-95 mRNA表达的变化。结果:PSD-95免疫组化图像分析结果显示:与NC组大鼠海马CA1区PSD-95免疫反应产物吸光度(0.7108±0.0584)比较,PTZ组大鼠海马CA1区PSD-95免疫反应产物吸光度(0.6525±0.0648)明显减少(P<0.05);与PTZ组比较,NMD1组海马CA1区PSD-95免疫反应产物吸光度(0.6921±0.0620)和NMD2组海马CA1区PSD-95免疫反应产物吸光度(0.7033±0.0659)均明显增加(P<0.05);NMD1组、NMD2组及NC组PSD-95免疫反应产物吸光度无明显差异(P>0.05)。P38免疫组化图像分析结果显示:与NC组大鼠海马CA1区P38免疫反应产物吸光度(0.6033±0.0444)比较,PTZ组大鼠P38免疫反应产物吸光度(0.4475±0.0505)明显减少(P<0.05);与PTZ组比较,NMD1组和NMD2组P38免疫反应产物吸光度(0.5819±0.0367)和(0.5723±0.0528)均明显增加(P<0.05)。NMD1、NMD2组及NC组P38免疫反应产物吸光度三组比较无明显统计学差异(P>0.05)。各组大鼠海马PSD-95 mRNA的表达水平以PSD-95 mRNA/β-actin mRNA表示。结果显示:与NC组PSD-95 mRNA表达水平(0.607±0.051)比较,PTZ组PSD-95 mRNA表达水平(0.325±0.030)明显降低(P<0.05);与PTZ组比较,NMD1和NMD2组PSD-95 mRNA表达水平(0.512±0.035)及(0.575±0.041)明显增高(P<0.05);NMD1、NMD2组及NC组PSD-95 mRNA表达水平三组比较无明显统计学差异(P>0.05)。结论:PTZ点燃癫痫大鼠海马组织P38、PSD-95及PSD-95 mRNA表达水平均降低,并且与大鼠学习和记忆成绩下降相一致,提示P38及PSD-95可能参与了癫痫后认知功能障碍的发病机制;尼莫地平可以提高癫痫大鼠海马组织P38蛋白、PSD-95蛋白及mRNA表达水平,进而促进癫痫大鼠学习和记忆能力改善。第三部分慢性癫痫大鼠海马神经元和突触超微结构的变化及尼莫地平的影响目的:观察戊四氮点燃慢性癫痫大鼠海马CA1区神经元形态结构和突触超微结构(SVD、PSD、WSC)的变化及尼莫地平的干预作用,探讨突触可塑性与癫痫后认知功能障碍的关系。方法:每组大鼠各取3只,10%水合氯醛麻醉,4 %多聚甲醛(含2.5 %戊二醛)灌注固定,利用透射电子显微镜观察各组大鼠海马CA1区神经元形态结构和突触超微结构(SVD、PSD、WSC)的变化。结果:NC组海马神经元形态完整,结构清晰,细胞器丰富,有髓神经髓鞘完整。PTZ组海马神经元减少,细胞核肿胀,核膜模糊不清,核内异染色质减少分散,胞核疏松、透明,出现核固缩现象。细胞器明显减少,线粒体空泡化或均质化。粗面内质网板层离散,核糖体脱颗粒。神经毡水肿变形,有些轴突、树突扩张、融合。可见髓鞘层裂。NMD1组及NMD2组海马神经元和神经毡水肿减轻,核膜尚完整,核形态基本正常,染色质均匀分布,胞质中细胞器尚丰富,形态基本正常。NC组海马CA1区神经毡内Gray I型突触丰富,突触前、后膜清晰,囊泡密集,PSD较厚,均匀致密。PTZ组突触数量减少,突触前、后膜模糊不清,突触间隙增大,PSD变薄,不均匀,突触囊泡减少。NMD1组和NMD2组突触数量较多,突触前后膜结构较清晰,PSD尚均匀,突触囊泡数量较多。PTZ组大鼠海马CA1区PSD为(31.37±1.94)nm,与NC组(49.86±3.38)nm比较有显着性差异(P<0.05);与PTZ组比较,NMD1组大鼠海马CA1区PSD(45.69±2.70)nm和NMD2组(48.20±2.15)nm明显增高(P<0.05);NMD1、NMD2组及NC组大鼠海马CA1区PSD三组比较无明显统计学差异(P>0.05)。与NC组大鼠海马CA1区WSC(14.62±1.19)nm比较,PTZ组WSC(22.34±1.84)nm显着增大(P<0.05);与PTZ组比较,NMD1组大鼠海马CA1区WSC(16.37±1.72)nm和NMD2组WSC(15.02±1.63)nm明显减小(P<0.05);NMD1组、NMD2组及NC组大鼠海马CA1区WSC三组比较无明显统计学差异(P>0.05)。与NC组大鼠海马CA1区SVD(3362.61±102.08)个/um2比较,PTZ组SVD(1078.36±111.03)个/um2明显减少(P<0.05);与PTZ组比较,NMD1组大鼠海马CA1区SVD(2932.01±142.95)个/um2和NMD2组SVD(3155.50±137.49)个/um2明显增高(P<0.05);NMD1、NMD2组及NC组三组大鼠海马CA1区SVD比较无明显统计学差异(P>0.05)。结论:癫痫大鼠海马CA1区存在神经元与突触超微结构异常,尼莫地平可以改善神经元及突触超微结构的病理学变化,这些与癫痫大鼠学习和记忆能力的变化相平行,说明突触可塑性与癫痫后认知功能障碍之间存在密切关系。第四部分慢性癫痫大鼠海马[Ca2+]i和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα的变化及尼莫地平的影响目的:观察戊四氮点燃慢性癫痫大鼠海马[Ca2+]i及CaMK IIα, P-CaMK IIα蛋白、CaMK IIαmRNA表达的变化及尼莫地平的干预作用,探讨钙信号转导与癫痫后认知功能障碍的关系。方法:每组大鼠各取6只,10%水合氯醛麻醉,迅速取海马,制备海马组织混悬液,负载Fluo-3/AM,采用流式细胞分析技术测定各组大鼠海马细胞[Ca2+]i变化; RT-PCR方法检测CaMK IIαmRNA表达的变化。每组大鼠各取8只,10%水合氯醛麻醉,迅速取海马,提取海马总蛋白及膜蛋白,Western blot方法检测海马CaMK IIα, P-CaMK IIα蛋白表达的变化。结果:与NC组[Ca2+]i(1.26±0.21)比较,PTZ组海马[Ca2+]i(1.94±0.33)明显升高(P<0.05);与PTZ组[Ca2+]i比较,NMD1组[Ca2+]i(1.35±0.28)和NMD2组[Ca2+]i(1.32±0.26)明显降低(P<0.05);NMD1、NMD2组和NC组海马[Ca2+]i之间无明显差异(P>0.05)。各组大鼠海马CaMK IIα蛋白表达水平以CaMK IIα/β-actin表示。结果显示:与NC组CaMK IIα表达水平(1.030±0.133)比较,PTZ组CaMK IIα表达水平(0.700±0.061)显着降低(P<0.05);与PTZ组比较,NMD1组和NMD2组CaMK IIα表达水平(1.000±0.130)、(0.981±0.071)显着升高(P<0.05);NC组和NMD1、NMD2组大鼠海马CaMK IIα表达水平之间无明显差异(P>0.05)。各组大鼠海马P-CaMK IIα蛋白表达水平以P-CaMK IIα/β-actin表示。结果显示:与NC组P-CaMK IIα表达水平(0.693±0.035)比较,PTZ组P-CaMK IIα表达水平(0.250±0.036)显着降低(P<0.05);与PTZ组比较,NMD1组和NMD2组P-CaMK IIα表达水平(0.679±0.058)、(0.665±0.043)显着升高(P<0.05);NC组、NMD1和NMD2组P-CaMK IIα表达水平无显着性差异(P>0.05)。大鼠海马CaMK IIαmRNA表达水平以CaMK IIαmRNA/β-actin mRNA表示。结果显示,与NC组CaMK IIαmRNA表达水平(1.217±0.074)比较,PTZ组CaMK IIαmRNA表达水平(0.758±0.050)明显降低(P<0.05);与PTZ组比较,NMD1组和NMD2组CaMK IIαmRNA表达水平(1.149±0.083)、(1.300±0.071)明显增高(P<0.05);NMD1、NMD2组及NC组大鼠CaMK IIαmRNA表达水平无明显统计学差异(P>0.05)。结论:戊四氮点燃慢性癫痫大鼠海马内存在钙超载及P-CaMK IIα,CaMK IIα蛋白及CaMK IIαmRNA表达水平降低,导致钙信号转导异常,可能参与了癫痫后认知功能障碍的发病机制;尼莫地平可以调节海马[Ca2+]i水平,增强P-CaMK IIα,CaMK IIα蛋白及CaMK IIαmRNA表达水平,与它提高癫痫大鼠学习记忆成绩相一致,提示尼莫地平具有改善认知功能的药理学作用。第五部分慢性癫痫大鼠海马CREB表达水平的变化及尼莫地平的影响目的:观察戊四氮点燃慢性癫痫大鼠海马P-CREB蛋白及CREB mRNA表达的变化及尼莫地平的干预作用,探讨核转录因子CREB表达与癫痫后认知功能障碍的关系。方法:Western blot方法检测海马P-CREB(Ser133)蛋白表达的变化, RT-PCR方法检测CREB mRNA表达的变化。结果:各组大鼠海马P-CREB(Ser133)表达水平以P-CREB/β-actin表示。结果显示:与NC组P-CREB表达水平(0.643±0.054)比较,PTZ组大鼠海马P-CREB表达水平(0.275±0.041)显着降低(P<0.05);与PTZ组比较,NMD1组和NMD2组P-CREB表达水平(0.602±0.045)、(0.621±0.071)显着升高(P<0.05);NC组及NMD1、NMD2组大鼠海马P-CREB蛋白表达水平比较无显着性差异(P>0.05)。各组大鼠海马CREB mRNA表达水平以CREB mRNA/β-actin mRNA表示。结果显示,与NC组CREB mRNA表达水平(0.605±0.071)比较,PTZ组CREB mRNA表达水平(0.319±0.037)明显降低(P<0.05);与PTZ组比较,NMD1组和NMD2组CREB mRNA表达水平(0.560±0.058)、(0.582±0.083)明显增高(P<0.05);NMD1、NMD2组及NC组大鼠海马CREB mRNA表达水平之间无明显统计学差异(P>0.05)。结论:慢性癫痫大鼠海马CREB蛋白磷酸化水平及转录水平下调,尼莫地平可以提高CREB蛋白及转录水平,这与其学习和记忆成绩变化相一致,提示核转录因子CREB可能参与了癫痫后认知功能障碍的发病机制。
二、实验性癫痫鼠脑组织环核苷酸及ATP酶的测定(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、实验性癫痫鼠脑组织环核苷酸及ATP酶的测定(论文提纲范文)
(1)外来中药玛咖甘温健脾药性及其物质基础和作用机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
符号说明 |
第一部分 文献综述 |
综述一 玛咖的国内外研究现状及外来中药药性研究进展 |
参考文献 |
综述二“甘温健脾”中药与能量代谢、免疫调控作用关系研究进展 |
参考文献 |
前言 |
第二部分 实验部分 |
实验一 玛咖对饮食失节、劳倦伤脾所致脾虚证小鼠的影响 |
实验二 玛咖对环磷酰胺诱导法脾虚证小鼠的影响 |
实验三 基于脾虚证小鼠模型对玛咖原粉、水提物及醇提物甘温健脾药性的比较实验研究 |
实验四 玛咖多糖对脾虚证小鼠能量代谢的影响 |
实验五 玛咖多糖对脾虚证小鼠免疫调节的影响 |
结语 |
参考文献 |
致谢 |
在校期间主要研究成果 |
个人简历 |
(2)丙戊酸干预发挥神经保护作用的实验研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
缩略语/符号说明 |
前言 |
研究现状、成果 |
研究目的、方法 |
一、原代培养神经干细胞及海马神经元 |
1.1 对象和方法 |
1.1.1 实验对象 |
1.1.2 主要试剂配制 |
1.1.3 孕13.5天C57BL/6小鼠的获取 |
1.1.4 胎鼠神经干细胞的分离、培养与纯化 |
1.1.5 胎鼠神经干细胞的冻存与复苏 |
1.1.6 胎鼠神经干细胞的分化培养 |
1.1.7 胎鼠神经干细胞的鉴定 |
1.1.8 孕17天C57BL/6小鼠的获取 |
1.1.9 胎鼠海马神经元的分离、培养与纯化 |
1.1.10 胎鼠海马神经元的鉴定 |
1.1.11 统计学分析 |
1.2 结果 |
1.2.1 胎鼠大脑组织的分离 |
1.2.2 成功分离培养胎鼠神经干细胞 |
1.2.3 成功分离培养胎鼠海马神经元 |
1.3 讨论 |
1.4 小结 |
二、VPA对脑型疟来源血清的体外研究 |
2.1 对象和方法 |
2.1.1 实验对象 |
2.1.2 主要试剂配制 |
2.1.3 伯氏疟原虫的复苏及感染 |
2.1.4 小鼠外周血虫血率的监测 |
2.1.5 伯氏疟原虫的冻存 |
2.1.6 伯氏疟原虫的计数 |
2.1.7 C57BL/6小鼠脑型疟模型的建立 |
2.1.8 C57BL/6小鼠脑型疟血清的获取 |
2.1.9 VPA对加有脑型疟小鼠血清的神经干细胞的作用 |
2.1.10 VPA对加有脑型疟小鼠血清的神经元的作用 |
2.1.11 统计学分析 |
2.2 结果 |
2.2.1 VPA对加有脑型疟小鼠血清的神经干细胞的作用 |
2.2.2 VPA对加有脑型疟小鼠血清的海马神经元的作用 |
2.3 讨论 |
2.4 小结 |
三、VPA对实验性脑型疟小鼠的作用 |
3.1 对象和方法 |
3.1.1 实验对象 |
3.1.2 主要试剂配制 |
3.1.3 C57BL/6小鼠脑型疟模型的建立 |
3.1.4 实验分组 |
3.1.5 小鼠生存率的计算 |
3.1.6 体重测定、快速昏迷和行为量表评分 |
3.1.7 苏木素-伊红组织染色 |
3.1.8 血脑屏障通透性(Blood Brain Barrier,BBB)的检测 |
3.1.9 脑组织中炎症因子及神经营养因子的检测 |
3.1.10 海马神经元膜电位变化 |
3.1.11 统计学分析 |
3.2 结果 |
3.2.1 本研究时间轴图 |
3.2.2 小鼠生存率的变化 |
3.2.3 体重、RMCBS评分变化 |
3.2.4 脑组织中细胞滞留、出血及炎症因子的水平 |
3.2.5 BBB通透性测定 |
3.2.6 脑组织中神经营养因子的变化 |
3.2.7 海马区神经元膜电位的变化 |
3.3 讨论 |
3.4 小结 |
全文结论 |
论文创新点 |
参考文献 |
发表论文和参加科研情况说明 |
附录 |
综述 脑型疟的研究进展 |
综述参考文献 |
致谢 |
个人简历 |
(3)肾阳虚体质动物模型的构建及其线粒体能量代谢研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
缩略词对照表 |
引言 |
第一章 肾阳虚体质动物模型的构建 |
1.中医体质动物模型研究概况 |
1.1 中医证候动物模型研究现状 |
1.2 中医体质动物模型研究概况 |
1.3 肾阳虚证动物模型研究现状 |
1.4 肾阳虚体质动物模型构建思路 |
2.肾阳虚体质动物模型的构建 |
2.1 实验材料 |
2.2 实验方法 |
3.肾阳虚体质动物模型的评价 |
3.1 实验材料 |
3.2 实验仪器 |
3.3 实验方法 |
3.4 数据处理与分析 |
3.5 肾阳虚动物模型结果评价 |
4.讨论 |
4.1 宏观行为学评价 |
4.2 生物学指标评价 |
第二章 肾阳虚与线粒体能量代谢异常性疾病的酶学研究 |
1.线粒体能量代谢相关酶异常与肾阳虚证关联 |
1.1 线粒体与机体产能的关联机制 |
1.2 肾阳虚与线粒体酶能量代谢异常性疾病的相关研究进展 |
2.肾阳虚体质动物模型线粒体相关酶检测 |
2.1 材料 |
2.2 实验仪器 |
2.3 方法 |
2.4 结果 |
3.讨论 |
第三章 线粒体DNA与肾阳虚体质能量代谢低下的关联研究 |
1.肾阳虚与线粒体DNA突变相关研究进展 |
1.1 线粒体DNA(mtDNA)突变导致的能量代谢异常性疾病与肾阳虚相关 |
1.2 肾阳虚与相关线粒体DNA突变位点的研究 |
2.基因重测序技术筛选肾阳虚体质模型SNP位点 |
2.1 材料与方法 |
2.2 数据分析 |
2.3 结果分析 |
3.讨论 |
结论 |
问题及展望 |
致谢 |
参考文献 |
附件一:文献综述 |
参考文献 |
附件二:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
(4)模拟微重力效应鼠脑中P-gp表达及其相互作用蛋白研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第1章 绪论 |
1.1 微重力的生物效应研究 |
1.1.1 载人航天与微重力 |
1.1.2 微重力对神经系统的影响 |
1.1.3 微重力对药物动力学过程的影响 |
1.2 P-糖蛋白 |
1.2.1 P-gp的结构 |
1.2.2 P-gp与血脑屏障 |
1.2.3 与P-gp表达相关通路 |
1.3 蛋白质组学在空间环境研究中的应用 |
1.4 本课题的立题依据 |
1.4.1 本课题的研究目的 |
1.4.2 本课题的研究内容 |
第2章 实验部分 |
2.1 实验仪器 |
2.2 实验材料 |
2.2.1 实验动物 |
2.2.2 实验试剂 |
2.3 模拟微重力对大鼠脑组织P-gp表达的影响 |
2.3.1 动物模型的建立 |
2.3.2 动物处置 |
2.3.3 蛋白提取和蛋白浓度测定 |
2.3.4 Western-blot检测蛋白含量变化 |
2.4 模拟微重力对大鼠脑组织MDR1 基因水平的影响 |
2.4.1 总RNA提取及浓度测定 |
2.4.2 Real-Time PCR检测MDR1 基因表达水平变化 |
2.5 免疫共沉淀联合质谱筛选大鼠脑组织P-gp相互作用蛋白 |
2.5.1 样品收集 |
2.5.2 蛋白提取和浓度测定 |
2.5.3 P-gp抗体免疫共沉淀模拟微重力大鼠脑组织总蛋白 |
2.5.4 P-gp免疫共沉淀复合物的SDS-PAGE分离 |
2.5.5 P-gp免疫共沉淀复合物的Western-blot检测 |
2.5.6 P-gp免疫共沉淀复合物的考马斯亮蓝检测 |
2.5.7 P-gp免疫共沉淀复合物的质谱分析 |
2.5.8 数据分析 |
2.5.9 与P-gp相互作用蛋白Atp1b1的Western-blot验证 |
第3章 结果与讨论 |
3.1 模拟微重力对大鼠脑组织P-gp蛋白表达的影响 |
3.2 模拟微重力对大鼠脑组织MDR1 基因水平影响 |
3.3 免疫共沉淀联合质谱筛选脑内P-gp相互作用蛋白 |
3.3.1 免疫共沉淀复合物中P-gp蛋白的表达检测 |
3.3.2 SDS-PAGE电泳分离P-gp免疫共沉淀复合物 |
3.3.3 模拟微重力大鼠脑内P-gp相关蛋白组学研究 |
3.3.4 Western-blot 法验证 P-gp 相互作用蛋白 Atp1b1 |
第4章 结论 |
参考文献 |
攻读学位期间发表论文与研究成果清单 |
致谢 |
(5)Ca2+/CaM信号通路在大鼠脾虚证躯体泛化效应中的响应及益气健脾中药干预研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
第一章 绪论 |
1.1 前言 |
1.2 脾的生理功能及脾虚证研究进展 |
1.2.1 脾的生理功能 |
1.2.2 脾虚证的理论源流 |
1.2.3 脾虚证本质研究 |
1.3 脾虚证动物模型研究进展 |
1.3.1 应用苦寒伤中法复建脾虚证动物模型 |
1.3.2 应用破气耗气法复建脾虚证动物模型 |
1.3.3 应用饮食伤脾法复建脾虚证动物模型 |
1.3.4 应用劳倦伤脾法复建脾虚证动物模型 |
1.3.5 应用复合因素法复建脾虚证动物模型 |
参考文献 |
第二章 “脾虚证躯体泛化效应”证候模式及工作假说的建立 |
2.1 前言 |
2.2 基于理论与临床的“脾虚证躯体泛化效应”证候模式的建立 |
2.2.1 “脾虚证躯体泛化效应”的文献理论 |
2.2.2 “脾虚证躯体泛化效应”的临床研究 |
2.3 “脾虚证躯体泛化效应”证候模式内涵探讨 |
2.3.1 中医脾虚证与消化系统功能紊乱的关系 |
2.3.2 中医脾虚证与免疫系统功能紊乱的关系 |
2.3.3 中医脾虚证与神经系统功能紊乱的关系 |
2.3.4 中医脾虚证与内分泌系统功能紊乱的关系 |
2.3.5 中医脾虚证与能量代谢功能紊乱的关系 |
2.3.6 中医脾虚证与运动功能紊乱的关系 |
2.4 “脾虚证躯体泛化效应”证候模式的研究思路 |
2.4.1 基于系统观和整体观研究“脾虚证躯体泛化效应”的思路 |
2.4.2 基于Ca~(2+)/CaM信号通路研究“脾虚证躯体泛化效应”的工作假说及可行性分析 |
2.5 深化脾虚证本质研究的意义 |
2.5.1 基于脾虚证研究拓展临床应用范围 |
2.5.2 基于脾虚证实质丰富症状学、疾病学和预防医学研究内涵 |
2.6 本论文的立题依据、研究目的和内容 |
2.6.1 立题依据 |
2.6.2 研究目的 |
2.6.3 研究内容 |
参考文献 |
论文实验技术路线图 |
第三章 脾虚证大鼠不同组织代谢相关酶活性、Ca~(2+)/CaM-CaMKⅡ信号通路的变化 |
3.1 前言 |
3.2 材料、仪器与动物 |
3.2.1 材料与试剂 |
3.2.2 实验仪器 |
3.2.3 实验动物 |
3.3 方法 |
3.3.1 药物制备 |
3.3.2 脾虚证大鼠模型制备 |
3.3.3 分组与给药 |
3.3.4 大鼠一般生存状况观察、宏观证候评估及每日体重增加量、肛温测定 |
3.3.5 大鼠胃排空率和小肠推进率测定 |
3.3.6 大鼠血清D-木糖含量测定 |
3.3.7 大鼠小肠组织GAS、MOT、SS和VIP含量测定 |
3.3.8 大鼠空腹血糖测定 |
3.3.9 大鼠血清胰岛素测定 |
3.3.10 大鼠小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织Na~+-K~+-ATPase、Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase活性测定 |
3.3.11 大鼠小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织SDH、LDH活性测定 |
3.3.12 激光共聚焦测定各组大鼠小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织i浓度 |
3.3.13 实时荧光定量PCR测定各组大鼠小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织CaM、CaMKⅡ基因表达 |
3.3.14 蛋白免疫印迹法测定各组大鼠小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白表达 |
3.3.15 统计学处理 |
3.4 结果 |
3.4.1 脾虚各组大鼠一般生存状况 |
3.4.2 脾虚各组大鼠每日体重增加量和游泳耐力时间比较 |
3.4.3 脾虚各组大鼠肛温和宏观证候积分比较 |
3.4.4 脾虚各组大鼠每日摄食量和血清D-木糖含量比较 |
3.4.5 脾虚各组大鼠胃残留率和小肠推进率比较 |
3.4.6 脾虚各组大鼠空腹血糖和血清胰岛素含量比较 |
3.4.7 脾虚各组大鼠小肠组织GAS和MOT含量比较 |
3.4.8 脾虚各组大鼠小肠组织SS和VIP含量比较 |
3.4.9 脾虚各组大鼠小肠组织Na~+-K~+-ATPase和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase活性比较 |
3.4.10 脾虚各组大鼠小肠组织SDH、LDH活性比较 |
3.4.11 脾虚各组大鼠胰腺组织Na~+-K~+-ATPase和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase活性比较 |
3.4.12 脾虚各组大鼠胰腺组织SDH和LDH活性比较 |
3.4.13 脾虚各组大鼠骨骼肌组织Na~+-K~+-ATPase和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase活性比较 |
3.4.14 脾虚各组大鼠骨骼肌组织SDH、LDH活性比较 |
3.4.15 脾虚各组大鼠肝组织Na~+-K~+-ATPase、Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase活性比较 |
3.4.16 脾虚各组大鼠肝脏组织SDH、LDH活性比较 |
3.4.17 脾虚各组大鼠小肠、胰腺组织[Ca~(2+)]i浓度比较 |
3.4.18 脾虚各组大鼠骨骼肌、肝组织[Ca~(2+)]i浓度比较 |
3.4.19 脾虚各组大鼠小肠组织CaM、CaMKⅡ基因表达量比较 |
3.4.20 脾虚各组大鼠胰腺组织CaM、CaMKⅡ基因表达量比较 |
3.4.21 脾虚各组大鼠骨骼肌组织CaM、CaMKⅡ基因表达量比较 |
3.4.22 脾虚各组大鼠肝组织CaM、CaMKⅡ基因表达量比较 |
3.4.23 脾虚各组大鼠小肠组织CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表达比较 |
3.4.24 脾虚各组大鼠胰腺组织CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表达比较 |
3.4.25 脾虚各组大鼠骨骼肌组织CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表达比较 |
3.4.26 脾虚各组大鼠肝组织CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表达比较 |
3.5 讨论 |
3.6 结论 |
参考文献 |
第四章 益气健脾中药对脾虚证大鼠不同组织代谢相关酶活性、Ca~(2+)/CaM-CaMKⅡ信号通路的影响 |
4.1 前言 |
4.2 材料、仪器与动物 |
4.2.1 材料与试剂 |
4.2.2 实验仪器 |
4.2.3 实验动物 |
4.3 方法 |
4.3.1 药物制备 |
4.3.2 脾虚证大鼠模型制备 |
4.3.3 分组与给药 |
4.3.4 大鼠一般生存状况、宏观证候评分及每日体重增加量、肛温测定 |
4.3.5 大鼠胃排空率和小肠推进率测定 |
4.3.6 大鼠血清D-木糖含量测定 |
4.3.7 大鼠小肠组织胃肠激素GAS、MOT、SS和VIP含量测定 |
4.3.8 大鼠空腹血糖含量测定 |
4.3.9 大鼠血清胰岛素测定 |
4.3.10 大鼠小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织Na~+-K~+-ATPase、Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase活性测定 |
4.3.11 大鼠小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织SDH、LDH活性测定 |
4.3.12 激光共聚焦测定各组大鼠小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织[Ca~(2+)]i浓度 |
4.3.13 实时荧光定量PCR测定各组大鼠小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织CaM、CaMKⅡ基因表达 |
4.3.14 蛋白免疫印迹法测定各组大鼠小肠、胰腺、骨骼肌和肝组织CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白表达 |
4.3.13 统计学处理 |
4.4 结果 |
4.4.1 各组大鼠一般生存状况 |
4.4.2 各组大鼠每日体重增加量和游泳耐力时间比较 |
4.4.3 各组大鼠肛温和宏观证候积分比较 |
4.4.4 各组大鼠每日摄食量和血清D-木糖含量比较 |
4.4.5 各组大鼠胃残留率和小肠推进率比较 |
4.4.6 各组大鼠空腹血糖和血清胰岛素含量比较 |
4.4.7 各组大鼠小肠组织GAS和MOT含量比较 |
4.4.8 各组大鼠小肠组织SS和VIP含量比较 |
4.4.9 各组大鼠小肠组织Na~+-K~+-ATPase和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase活性比较 |
4.4.10 各组大鼠小肠组织SDH和LDH活性比较 |
4.4.11 各组大鼠胰腺组织Na~+-K~+-ATPase和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase活性比较 |
4.4.12 各组大鼠胰腺组织SDH和LDH活性比较 |
4.4.13 各组大鼠骨骼肌组织Na~+-K~+-ATPase和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase活性比较 |
4.4.14 各组大鼠骨骼肌组织SDH和LDH活性比较 |
4.4.15 各组大鼠肝组织Na~+-K~+-ATPase和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase活性比较 |
4.4.16 各组大鼠肝脏组织SDH和LDH活性比较 |
4.4.17 各组大鼠小肠、胰腺组织[Ca~(2+)]i浓度比较 |
4.4.18 各组大鼠骨骼肌、肝组织[Ca~(2+)]i浓度比较 |
4.4.19 各组大鼠小肠组织CaM、CaMKⅡ基因表达量比较 |
4.4.20 各组大鼠胰腺组织CaM、CaMKⅡ基因表达量比较 |
4.4.21 各组大鼠骨骼肌组织CaM、CaMKⅡ基因表达量比较 |
4.4.22 各组大鼠肝脏组织CaM、CaMKⅡ基因表达量比较 |
4.4.23 各组大鼠小肠组织CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表达比较 |
4.4.24 各组大鼠胰腺组织CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表达比较 |
4.4.25 各组大鼠骨骼肌组织CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表达比较 |
4.4.26 各组大鼠肝组织CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表达比较 |
4.5 讨论 |
4.6 结论 |
参考文献 |
本论文的创新点 |
全文结论 |
研究展望 |
英语缩略词表 |
在学期间的研究成果 |
致谢 |
(6)牡蛎配伍葛根药效物质基础研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
缩略语表 |
绪言 |
1 研究背景 |
2 研究目标 |
3 研究方案 |
4 研究意义 |
第一章 文献研究 |
第一节 牡蛎的研究概况 |
1 牡蛎主要化学成分 |
2 牡蛎主要药理作用 |
3 临床应用 |
第二节 葛根的研究概况 |
1 葛根主要化学成分 |
2 葛根主要药理作用 |
第三节 中药复方配伍药效物质基础研究进展 |
1 复方配伍药效物质基础研究的基本思路 |
2 复方配伍药效物质基础研究进展 |
参考文献 |
第二章 牡蛎化学成分研究 |
第一节 牡蛎药材指纹图谱分析 |
1 仪器与材料 |
2 实验方法 |
3 结果与讨论 |
第二节 牡蛎有机质的分离纯化研究 |
1 仪器与材料 |
2 实验方法 |
3 结果与讨论 |
参考文献 |
第三章 牡蛎镇静药理作用研究 |
1 仪器与材料 |
2 实验方法 |
3 实验结果 |
4 结论 |
第四章 牡蛎配伍葛根药效物质相互作用研究 |
第一节 牡蛎葛根配伍理化性质研究 |
1 仪器与材料 |
2 实验方法 |
3 结果与讨论 |
第二节 葛根对牡蛎钙元素形态的影响研究 |
1 仪器与材料 |
2 实验方法 |
3 结果与讨论 |
第三节 牡蛎对葛根主要药效物质溶出作用研究 |
1 仪器与材料 |
2 实验方法 |
3 结果与讨论 |
参考文献 |
第五章 牡蛎配伍葛根药理作用研究 |
第一节 镇静药理作用研究 |
1 仪器与材料 |
2 实验方法 |
3 结果与讨论 |
第二节 对自发性高血压大鼠降血压药理作用研究 |
1 仪器与材料 |
2 实验方法 |
3 实验结果 |
4 讨论 |
参考文献 |
第六章 牡蛎配伍葛根对葛根素在大鼠体内药代动力学的影响研究 |
1 仪器与材料 |
2 实验方法 |
3 结果与讨论 |
参考文献 |
第七章 牡蛎钙对葛根素与药物代谢酶和转运蛋白的相互作用影响研究 |
第一节 钙离子对葛根素与细胞色素P450体外相互作用的影响研究 |
1 仪器与材料 |
2 实验方法 |
3 实验结果 |
4 讨论 |
第二节 钙离子对葛根素与人血清白蛋白(HSA)体外相互作用的影响研究 |
1 仪器与材料 |
2 实验方法 |
3 实验结果 |
4 讨论 |
参考文献 |
总结与展望 |
1 论文小结 |
2 创新点 |
3 展望 |
攻读博士期间取得的学术成果 |
致谢 |
作者简介 |
(7)基于统计方法模型分析的中药复方专利保护研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
1 研究背景 |
2 立题依据 |
2.1 中药复方研发在中医药体系中的地位 |
2.2 中药复方专利保护的意义 |
2.3 中药复方专利保护现状 |
2.4 中药复方专利文献的作用 |
2.5 中药复方专利文献研究的现状及本研究的确立 |
3 研究目标及意义 |
3.1 研究目标 |
3.2 研究意义 |
4 研究内容 |
4.1 中药复方专利重要性研究 |
4.2 中药复方专利的发展进程研究 |
4.3 中药复方专利的区域研究 |
4.4 中药复方专利的功效研究 |
4.5 中药复方专利的专利权人研究 |
4.6 中药复方专利维持有效的影响因素研究 |
4.7 中药复方专利的价值研究 |
4.8 中药复方专利组成研究 |
5 研究方法 |
5.1 跨学科的知识准备和广泛的文献收集 |
5.2 理论研究与实证分析相结合的方法 |
5.3 纵向比较和横向对比相结合的研究方法 |
5.4 统计模型的指标评价和相关性分析相结合的研究方法 |
5.5 简单统计与高阶统计相结合的研究方法 |
6 研究路线 |
第一章 中药复方的研发进展 |
1.1 中药复方的有效成分及其相关研究 |
1.2 中药复方的有效部位及其相关研究 |
1.3 中药复方血清药理学和血清药物化学研究 |
1.4 中药复方的药代动力学研究 |
1.5 以中医理论为指导的中药复方研究 |
参考文献 |
第二章 中药复方专利保护的重要性研究 |
2.1 中药复方专利保护现状 |
2.2 中药复方专利保护是新一轮研发深入开展的助推剂 |
2.3 中药复方专利保护为中药自主发展铺平道路,促成中药产业化 |
2.4 中药复方专利保护是催生商标、增强企业实力的法宝 |
2.5 中药复方科研成果及时获取专利是维护社会利益实现、增加社会收益的手段 |
2.6 中药复方科研创新与专利保护的相互促进是提升中药国际地位、维护国家利益的源泉 |
2.7 中药复方研发与专利保护的同步前进是维护发展中国家与欠发达国家民众健康的保障 |
参考文献 |
第三章 基于聚类分析的中药复方专利发展进程研究 |
3.1 信息源与研究系统工具 |
3.1.1 数据源的选取 |
3.1.2 系统工具的选择 |
3.2 研究过程与方法 |
3.2.1 聚类变量与聚类成员的确定 |
3.2.2 数据清洗 |
3.2.3 生成样本空间 |
3.2.4 计算相似性测度 |
3.2.5 选择聚类方法进行聚类分析 |
3.3 聚类分析结果及其解释 |
3.4 研究结论 |
3.4.1 国家专利法制的健全与专利战略的强化是中药复方专利发展的领航 |
3.4.2 中医药科研投入的加大与创新水平的增高是中药复方专利保护前进的动力支撑 |
3.4.3 中药复方专利的增长与经济贸易的发展息息相关 |
3.4.4 世界药品市场需求与中医药国际认可度的提升促进中药复方专利数量的激增 |
3.4.5 中药复方科研成果的专利转化将成为今后中药领域的重大课题 |
参考文献 |
第四章 基于聚类分析的中药复方专利区域发展研究 |
4.1 信息源与研究系统工具 |
4.1.1 数据源的选取 |
4.1.2 系统工具的选择 |
4.2 研究过程与方法 |
4.2.1 聚类变量与聚类成员的确定 |
4.2.2 数据清洗 |
4.2.3 生成样本空间 |
4.2.4 计算相似性测度 |
4.2.5 选择聚类方法进行聚类分析 |
4.3 研究结果 |
4.3.1 31个区域依专利及科研论文数量不同聚为四类 |
4.3.2 中药复方科研及专利保护发展较好的区域集中于华北、华东及中部地区 |
4.3.3 东北三省及中南地区及华北、华东的部分区域中药复方研发及专利保护有待提高 |
4.3.4 西部地区中药复方研发与专利保护水平较低 |
4.4 研究结论与建议 |
4.4.1 充分发挥第一、第三类区域中药复方研发与专利优势,铸就中医药产业核心竞争力 |
4.4.2 发挥优势。规避不足,因地制宜地推动第二类区域的中药复方创新与专利保护 |
4.4.3 展开区域联合,发挥各自优势,共同推进以中药复方专利为筹码的中药产业化、现代化、国际化进程 |
4.5 结语 |
参考文献 |
第五章 基于聚类分析的中药复方职务发明专利现状及增长路径研究 |
5.1 信息源与研究系统工具 |
5.1.1 数据源的选取 |
5.1.2 系统工具的选择 |
5.2 研究过程与方法 |
5.2.1 聚类变量与聚类成员的确定 |
5.2.2 数据清洗 |
5.2.3 生成样本空间 |
5.2.4 计算相似性测度 |
5.2.5 选择聚类方法进行聚类分析 |
5.3 研究结果 |
5.3.1 中药复方职务发明专利比重不足 |
5.3.2 中医药院校对于科研成果专利保护的认知不够 |
5.3.3 中药企业专利意识有待提高 |
5.4 研究结论及相关建议 |
5.4.1 中药企业将中药复方专利作为企业资产,适时制定专利战略 |
5.4.2 高校将专利资源作为智力资产,以此提升科研创新力度 |
5.4.3 优质高效的中药复方产学研联盟协调新药研发与专利保护,实现联盟成员的共荣 |
5.5 结语 |
参考文献 |
第六章 基于聚类分析的中药复方专利授权状况之功效归类研究 |
6.1 信息源与研究系统工具 |
6.1.1 数据源的选取 |
6.1.2 系统工具的选择 |
6.2 研究过程与方法 |
6.2.1 研究数据检索 |
6.2.2 数据清洗 |
6.2.3 聚类变量与聚类成员的确定 |
6.2.4 生成样本空间 |
6.2.5 计算相似性测度 |
6.2.6 选择聚类方法进行聚类分析 |
6.3 聚类结果 |
6.4 研究结果讨论 |
6.5 研究结论 |
6.5.1 确定优先发展的专利保护领域,加强深度研发 |
6.5.2 选定中医药优势治疗领域,加快授权速度 |
6.5.3 瞄准快速授权区域,促进专利集群形成 |
6.5.4 充分利用中药复方专利信息,提升创新能力 |
6.6 结语 |
参考文献 |
第七章 基于聚类分析的心脑血管中药复方专利年度发展状况研究 |
7.1 信息源与研究系统工具 |
7.1.1 数据源的选取 |
7.1.2 系统工具的选择 |
7.2 研究过程与方法 |
7.2.1 聚类变量与聚类成员的确定 |
7.2.2 数据清洗 |
7.2.3 生成样本空间 |
7.2.4 计算相似性测度 |
7.2.5 选择聚类方法进行聚类分析 |
7.3 聚类分析结果的解释 |
7.4 聚类结果讨论 |
7.4.1 心脑血管中药复方专利保护经历了三个阶段,发展速度相对较快 |
7.4.2 专利制度的完善是心脑血管中药复方专利发展的强力保障 |
7.4.3 国家对于心脑血管及中医药领域的重视与投入是心脑血管中药复方专利保护的巨大动力 |
7.4.4 心脑血管中药复方科研成果的积聚为其专利保护提供智力支撑 |
7.4.5 心脑血管中药复方专利发展方向明确,前景广阔 |
7.5 结语 |
参考文献 |
第八章 基于聚类分析的心脑血管中药复方专利权人分布状况研究 |
8.1 信息源与研究系统工具 |
8.1.1 数据源的选取 |
8.1.2 系统工具的选择 |
8.2 研究过程与方法 |
8.2.1 聚类变量与聚类成员的确定 |
8.2.2 数据清洗 |
8.2.3 生成样本空间 |
8.2.4 计算相似性测度 |
8.2.5 选择聚类方法进行聚类分析 |
8.3 聚类分析结果及其解释 |
8.4 研究结论 |
8.4.1 心脑血管中药复方专利集中于少数优势企业 |
8.4.2 心脑血管中药复方科研成果的专利转化仍是有待突破的重要课题 |
8.4.3 科研成果获取专利进而合理运营是中药企业在市场竞争中优势获得的先导 |
8.4.4 中药复方科研创新与专利保护协调发展的新药研发集群是心脑血管药品竞争中获胜的主体 |
8.5 结语 |
参考文献 |
第九章 基于回归分析的心脑血管中药复方有效专利影响因素研究 |
9.1 资料与方法 |
9.1.1 研究原理与过程 |
9.1.2 信息源与系统工具 |
9.1.3 数据库的生成 |
9.2 研究结果 |
9.3 结果讨论 |
9.3.1 心脑血管中药复方有效专利匮乏的成因及其消极影响 |
9.3.2 有效专利的维持对于专利价值实现的积极作用 |
9.3.3 专利许可对于心脑血管中药复方专利维持的重要作用 |
9.3.4 专利质量与专利维持时间密切相关 |
9.3.5 心脑血管中药复方专利内容体现其质量进而影响其维持时间 |
9.4 结语 |
参考文献 |
第十章 基于频数分析的中药复方有效专利防治心血管疾病用药规律研究 |
10.1 资料与方法 |
10.1.1 中药复方专利来源 |
10.1.2 专利文献选择标准 |
10.1.3 方法 |
10.2 研究结果 |
10.3 研究结论与讨论 |
10.3.1 祖国医学对心血管疾病的认识 |
10.3.2 心血管中药复方有效专利中的高频中药是临床防治心血管疾病疗效甚佳的药物 |
10.3.3 心血管中药复方有效专利用药集中于活血化瘀、补气功效的中药群组 |
10.3.4 心血管中药复方有效专利以心论治为主,兼以调理肝、脾、肺 |
10.3.5 药对组合体现出中药配伍的重要作用以及古方在防治心血管疾病过程中的巨大疗效 |
10.3.6 有效专利用药规律的研究为心血管新药研发及专利保护提供有力指导 |
10.4 结语 |
参考文献 |
第十一章 基于频数分析的中药复方有效专利防治脑病用药规律研究 |
11.1 资料与方法 |
11.1.1 中药复方专利来源 |
11.1.2 专利文献选择标准 |
11.1.3 研究方法 |
11.2 研究结果 |
11.3 结论与讨论 |
11.3.1 祖国医学对脑的认识 |
11.3.2 有效专利的高频中药是临床防治脑病的常用药物 |
11.3.3 活血化瘀为有效专利的主要治则 |
11.3.4 有效专利防治脑病以肝、心论治为主,调理脾、肺、肾次之 |
11.3.5 药对联合及经古方的合理加减利于复方专利的维持 |
11.3.6 研究展望 |
11.4 结语 |
参考文献 |
第十二章 基于社会收益及西方经济学理论模型的中药复方专利“三性”的价值研究 |
12.1 严格中药组合物“三性”的审查,增加社会整体收益 |
12.1.1 增加社会知识存量,平衡社会整体利益 |
12.1.2 具备“三性”的中药组合物研发成果专利保护可避免生产无效率 |
12.1.3 严格“三性”审查,推动研发站的更高 |
12.2 社会收益视角中的中药组合物专利“三性”评价 |
12.2.1 中药组合物专利的实用性评价 |
12.2.2 中药组合物的新颖性评价 |
12.2.3 非显而易见性 |
12.3 严格规制中药组合物专利的“三性”同时强化获准专利的保护,构建社会整体利益的平衡机制 |
12.3.1 中药组合物“三性”的规制应与专利权人的成本获得构建平衡 |
12.3.2 中药组合物专利“三性”的规制及其保护的社会影响 |
12.4 结语 |
参考文献 |
结论与展望 |
1 结论 |
2 创新点总结 |
3 研究展望与发展建议 |
3.1 宏观层面 |
3.1.1 中药复方专利指标作为该领域科研立项的重要标尺 |
3.1.2 将中药复方研发与专利保护作为建设创新型国家及实施国家知识产权战略的重要组成部分,促成高效运营机制 |
3.1.3 构建主从协调的中药复方专利战略体系 |
3.1.4 设立全方位、多层次的中药复方专利保护规划 |
3.1.5 汲取国际药品规则,积极参与相应的国际规则制定 |
3.2 中观层面 |
3.2.1 行业协会充分发挥有益补充,协助政府推进新药研发与保护 |
3.2.2 国家知识产权局要在提升中药复方专利质量领域发挥其重要的价值 |
3.2.2.1 提高专利审查效率,增强复方专利质量 |
3.2.2.2 制定符合中药复方特点、国际认可、切实可行的中药复方专利分类体系 |
3.2.2.3 引导中药复方优秀成果及时获取国际专利 |
3.3 微观层面 |
3.3.1 中药企业应发挥其在中药复方专利保护体系中的主力作用 |
3.3.1.1 合理分析并利用中药复方专利信息 |
3.3.1.2 实行高效的专利管理制度 |
3.3.1.3 合理运用专利策略 |
3.3.1.4 制定适宜的专利战略 |
3.3.2 中医药院校及科研院所充分发挥智囊团优势,全面提升中药复方专利质量 |
3.3.2.1 优选中医药优势组方为研发对象 |
3.3.2.2 注重科研人员专利意识的培养 |
3.3.2.3 成立职责明确的科研成果专利管理机构 |
3.3.2.4 设立专项基金,促进专利申报 |
3.3.2.5 促进成果转化,提高专利利用率 |
3.3.2.6 促成优质高效的产学研联盟,孵化高质量中药复方专利 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历 |
(8)胡椒碱/五味子甲素对海马神经元网络抑制作用研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第1章 引言 |
1.1 癫痫症简介 |
1.2 癫痫分类 |
1.3 癫痫症的发病机理 |
1.3.1 癫痫症发生的神经生物学机制 |
1.3.2 癫痫灶的形成 |
1.3.3 痫性电活动的产生、扩散和终止 |
1.4 痫性发作对大脑正常功能的影响 |
1.5 抗癫痫药物的主要靶点 |
1.5.1 电压激活钠离子、钾离子通道 |
1.5.2 电压激活钙离子通道 |
1.5.3 伽玛氨基丁酸(GABA)能系统 |
1.5.4 谷氨酸受体 |
1.6 中药治疗癫痫症简介 |
1.7 本文研究目的 |
1.7.1 目前使用的抗癫痫药物的局限性 |
1.7.2 中药单体抗痫作用研究 |
1.7.3 胡椒碱药理作用介绍 |
1.7.4 五味子药理作用介绍 |
1.8 实验模型介绍 |
1.8.1 神经元网络的同步活动 |
1.8.2 原代培养海马神经元网络 |
第2章 胡椒碱抑制原代培养海马神经元网络自发同步钙振荡 |
2.1 材料和试剂 |
2.1.1 实验动物 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 主要仪器 |
2.1.4 溶液配制 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 原代海马神经元的培养 |
2.2.2 钙成像 |
2.2.3 全细胞膜片钳记录 |
2.2.4 谷氨酸损伤模型 |
2.2.5 细胞凋亡检测 |
2.2.6 细胞活性检测 |
2.2.7 数据统计和分析 |
2.3 实验结果 |
2.3.1 胡椒碱有效抑制海马神经元网络自发同步钙振荡 |
2.3.2 胡椒碱对钙振荡的抑制呈浓度依赖 |
2.3.3 胡椒碱不影响海马神经元电压门控钠离子、钾离子、钙离子通道电流 |
2.3.4 胡椒碱对原代培养海马神经元自发放电频率的抑制 |
2.3.5 胡椒碱抑制海马神经元sEPSC 但不影响sIPSC |
2.3.6 胡椒碱对谷氨酸兴奋毒性的保护作用 |
2.4 讨论 |
第3章 五味子甲素抑制原代培养海马神经元网络自发同步钙振荡 |
3.1 材料和试剂 |
3.1.1 实验动物 |
3.1.2 主要试剂 |
3.2 实验方法 |
3.3 实验结果 |
3.3.1 五味子甲素对海马神经元网络自发同步钙振荡的抑制作用 |
3.3.2 五味子甲素对钙振荡的抑制呈浓度依赖 |
3.3.3 五味子甲素抑制电压门控钠离子通道电流但不影响电压门控钾离子通道电流 |
3.3.4 五味子甲素抑制高电压激活的钙离子通道电流 |
3.3.5 五味子甲素抑制自发抑制性突触后电流sIPSC,不影响自发兴奋性突触后电流sEPSC |
3.4 讨论 |
第4章 中药单体不同配伍对海马神经元网络自发同步钙振荡的抑制作用 |
4.1 材料和试剂 |
4.1.1 实验动物 |
4.1.2 主要试剂 |
4.2 实验方法 |
4.3 实验结果 |
4.3.1 五味子乙素对海马神经元网络自发同步钙振荡的抑制作用 |
4.3.2 五味子乙素对钙振荡的抑制呈浓度依赖 |
4.3.3 不同比例五味子甲素和乙素配伍对钙振荡的抑制作用 |
4.3.4 不同比例胡椒碱和五味子甲素配伍对钙振荡的抑制作用 |
4.4 讨论 |
第5章 Capsazepine 抑制原代培养海马神经元线粒体快速转运 |
5.1 材料和试剂 |
5.2 实验方法 |
5.2.1 原代海马神经元培养 |
5.2.2 线粒体成像和定量 |
5.2.3 胞内钙离子成像 |
5.2.4 细胞活性检测 |
5.3 实验结果 |
5.3.1 CZP 急性抑制海马神经元的快速线粒体转运 |
5.3.2 CZP 对胞内钙浓度没有影响 |
5.3.3 CZP 短时程作用不诱导细胞死亡 |
5.4 讨论 |
5.5 结论 |
第6章 结论与展望 |
6.1 结论 |
6.2 展望 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
(9)枸杞多糖粗提物抗衰老作用及其与信号传导系统Ca2+-CaM的相关性研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一章 绪论 |
1 衰老机制研究进展 |
1.1 自由基学说 |
1.2 免疫功能退化学说 |
1.3 代谢循环学说 |
1.4 线粒体 DNA(mtDNA)损伤学说 |
1.5 细胞程序性死亡学说 |
1.6 端粒缩短学说 |
1.7 其他学说 |
2 钙调素(CaM)研究进展 |
2.1 引言 |
2.2 CaM 的性质、分子结构 |
2.3 CaM 的生物学功能 |
3 Ca~(2+)-CaM 与衰老的相关性 |
3.1 Ca~(2+)稳态与机体健康 |
3.2 CaM 与Ca~(2+)稳态 |
3.3 CaM 与衰老 |
4 本论文研究的目的和内容 |
4.1 研究目的 |
4.2 研究内容 |
第二章 新疆枸杞多糖抗衰老作用研究及其行为学指标的影响 |
1 材料 |
1.1 实验材料 |
1.2 药品及试剂 |
1.3 主要仪器 |
2 实验方法 |
2.1 枸杞多糖的提取及其饮液的配制 |
2.2 实验动物分组及给药 |
2.3 小鼠的体征行为学观察 |
2.4 Morris 水迷宫实验 |
2.5 小鼠跳台实验 |
2.6 小鼠避暗实验 |
2.7 小鼠抗疲劳实验 |
2.8 实验数据统计分析 |
3 结果与分析 |
3.1 实验动物不同时间段内体重及饮水量变化 |
3.2 实验动物体征 |
3.3 小鼠 Morris 水迷宫实验结果 |
3.4 小鼠跳台实验结果 |
3.5 小鼠避暗实验结果 |
3.6 小鼠抗疲劳跑步实验结果 |
4 讨论 |
第三章 新疆枸杞多糖抗衰老作用的生化学指标及组织形态学的观察 |
1 材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 主要试剂 |
1.3 主要仪器 |
2 实验方法 |
2.1 组织匀浆及血液分离 |
2.2 小鼠免疫器官的脏器系数的测定 |
2.3 小鼠血流速度测定 |
2.4 小鼠血糖的测定 |
2.5 小鼠脏器及血清中酶学及生理生化学指标的检测 |
2.6 小鼠肝、肾组织的电镜观察 |
2.7 实验数据统计分析 |
3 结果与分析 |
3.1 小鼠免疫器官脏器系数 |
3.2 小鼠微循环血流速度变化 |
3.3 小鼠血糖水平变化 |
3.4 小鼠脏器及血清中 MAO 活性变化 |
3.5 小鼠脏器及血清中SOD 活性变化 |
3.6 小鼠脏器及血清中 MDA 含量变化 |
3.7 小鼠脏器中ATPase 活性变化 |
3.8 小鼠脏器及血清中NOS 活性变化 |
3.9 小鼠脏器及血清中 NO 含量变化 |
3.10 小鼠脏器及血清中GSH-Px 活性变化 |
3.11 小鼠脏器及血清中 CAT 活性变化 |
3.12 小鼠脏器及血清中 AchE 活性变化 |
3.13 小鼠肝肾细胞病理学变化 |
4 讨论 |
4.1 免疫系统 |
4.2 循环系统 |
4.3 神经系统 |
4.4 防御自由基系统 |
4.5 衰老机体ATPase 变化 |
4.6 衰老机体组织形态学变化 |
第四章 牛脑 CaM 的分离纯化 |
1 材料 |
1.1 实验材料 |
1.2 主要试剂 |
1.3 主要仪器 |
2 方法 |
2.1 CaM 粗提物的制备 |
2.2 CaM 的Phenyl-Sepharose CL-48 柱层析纯化 |
2.3 CaM 的活性鉴定(PDE 法) |
2.4 牛脑CaM SDS-PAGE、PAGE 电泳行为及分子量的鉴定 |
2.5 牛脑 CaM 的扫描光谱分析 |
2.6 蛋白质含量的测定 |
3 结果与分析 |
3.1 牛脑 CaM Phenyl-Sepharose 层析 |
3.2 牛脑 CaM 酶活性鉴定 |
3.3 牛脑CaM SDS-PAGE、PAGE 电泳鉴定 |
3.4 牛脑 CaM 紫外扫描光谱 |
4 讨论 |
第五章 牛脑钙调素(CaM)免疫原的制备、检测及组织中 CaM 含量与枸杞多糖抗衰老作用的相关性 |
1 材料 |
1.1 实验样品 |
1.2 主要试剂 |
1.3 主要仪器 |
2 实验方法 |
2.1 CaM 抗原偶联及动物的免疫 |
2.2 双向免疫琼脂扩散实验 |
2.3 CaM 血清抗体效价检测 |
2.4 血清-CaM 标准曲线的绘制 |
2.5 小鼠脏器钙调素(CaM)的测定 |
3 结果与分析 |
3.1 双向免疫琼脂扩散实验结果 |
3.2 血清CaM 抗体效价 |
3.3 血清-CaM 标准曲线 |
3.4 小鼠主要脏器中CaM 含量变化 |
4 讨论 |
4.1 CaM 偶联抗原的制备 |
4.2 衰老机体Ca~(2+)-CaM 变化 |
第六章 结论 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
(10)实验性癫痫大鼠认知功能障碍的机制探讨及尼莫地平的影响(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
英文缩写 |
研究论文实验性癫痫大鼠认知功能障碍的机制探讨及尼莫地平的影响 |
引言 |
第一部分 慢性癫痫大鼠模型的制备、行为学测定及尼莫地平的影响 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
附图 |
附表 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第二部分 慢性癫痫大鼠海马突触后致密物95 与突触素表达的变化及尼莫地平的影响 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
附图 |
附表 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第三部分 慢性癫痫大鼠海马神经元和突触超微结构的变化及尼莫地平的影响 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
附图 |
附表 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第四部分 慢性癫痫大鼠海马[Ca~(2+)]i 和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα的变化及尼莫地平的影响 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
附图 |
附表 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第五部分 慢性癫痫大鼠海马CREB 表达水平的变化及尼莫地平的影响 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
附图 |
附表 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
结论 |
综述一 |
综述二 |
致谢 |
个人简历 |
四、实验性癫痫鼠脑组织环核苷酸及ATP酶的测定(论文参考文献)
- [1]外来中药玛咖甘温健脾药性及其物质基础和作用机制研究[D]. 费文婷. 北京中医药大学, 2019(04)
- [2]丙戊酸干预发挥神经保护作用的实验研究[D]. 卢璐. 天津医科大学, 2019
- [3]肾阳虚体质动物模型的构建及其线粒体能量代谢研究[D]. 乔丽君. 成都中医药大学, 2019(04)
- [4]模拟微重力效应鼠脑中P-gp表达及其相互作用蛋白研究[D]. 黄丽丽. 北京理工大学, 2016(03)
- [5]Ca2+/CaM信号通路在大鼠脾虚证躯体泛化效应中的响应及益气健脾中药干预研究[D]. 段永强. 兰州大学, 2014(10)
- [6]牡蛎配伍葛根药效物质基础研究[D]. 邵江娟. 南京中医药大学, 2013(04)
- [7]基于统计方法模型分析的中药复方专利保护研究[D]. 杨旭杰. 北京中医药大学, 2012(08)
- [8]胡椒碱/五味子甲素对海马神经元网络抑制作用研究[D]. 付敏. 清华大学, 2009(05)
- [9]枸杞多糖粗提物抗衰老作用及其与信号传导系统Ca2+-CaM的相关性研究[D]. 周旋. 新疆农业大学, 2009(11)
- [10]实验性癫痫大鼠认知功能障碍的机制探讨及尼莫地平的影响[D]. 王佩. 河北医科大学, 2008(01)