一、在固体培养基中培养阴道毛滴虫的研究（论文文献综述）
王晓平[1]（2020）在《细菌性阴道炎优势菌筛选及灭活疫苗的制备》文中认为目的本实验通过分离并鉴定引起阴道感染的病原菌,筛选出细菌性阴道炎的优势菌;在此基础上制备细菌性阴道炎灭活疫苗,为细菌性阴道炎的主动免疫预防提供实验依据。方法选取2018年10月至2019年3月就诊于华北理工大学附属医院及唐山妇幼保健院妇科门诊且临床初步诊断为细菌性阴道炎患者187例为研究对象,年龄平均为（35.01±9.96）岁。排除月经期、性生活、阴道冲洗、用药等影响因素。用无菌棉拭子采集两管阴道分泌物,30min内送检。1样本进行常规镜检和阴道五联检测试剂盒联合检测,根据其联合检测结果筛选出细菌性阴道炎标本,同时排除滴虫、霉菌等其他类型的阴道感染。2细菌培养及鉴定将符合要求的阳性标本进行细菌接种培养,挑取可疑菌落进行革兰染色镜检并分纯培养,根据生化反应采用全自动细菌鉴定仪进行初步鉴定;选择相应引物应用q RT-PCR进一步基因鉴定。3绘制频数分布直方图根据q RT-PCR结果,绘制直方图描述细菌性阴道炎病原菌频数分布,根据病原菌频数分布,筛选细菌性阴道炎的优势菌。4灭活疫苗制备将筛选的制备灭活疫苗的种子菌复苏并进行纯检,采用细菌平板计数,绘制细菌生长曲线。根据设定的不同甲醛浓度、不同时间对细菌的灭活效果研究,探讨最适甲醛灭活浓度及灭活时间。将灭活纯检后的种子菌等体积混合制备成联合疫苗,并进行理化性状及无菌性检验。结果1 187例临床初步诊断为细菌性阴道炎的标本中,经常规镜检和阴道炎五联检试剂盒联合检测,符合要求的标本共168例。2标本接种培养后,经全自动细菌鉴定仪生化反应鉴定出144例菌株,其中凝固酶阴性葡萄球菌45株,在细菌性阴道炎中的分离率为31.2%;大肠埃希菌38株,分离率26.3%;肺炎克雷伯菌27株,分离率18.8%;肠球菌14株,分离率9.7%;B群链球菌8株,分离率5.6%;阴沟肠杆菌7株,分离率4.9%;加德纳菌3株,分离率2.0%;棒状杆菌2株,分离率1.5%。PCR基因鉴定结果:凝固酶阴性葡萄球菌44株,在细菌性阴道炎中的分离率为30.5%;大肠埃希菌38株,分离率为26.4%;肺炎克雷伯菌26株,分离率为18.1%;肠球菌12株,分离率为8.3%;B群链球菌6株,分离率为4.1%;阴沟肠杆菌7株,分离率为4.9%;加德纳菌1株,分离率为0.7%;棒状杆菌2株,分离率为1.4%。3根据q RT-PCR鉴定结果绘制频数分布图,根据其频数分布情况,筛选出凝固酶阴性葡萄球菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为引起细菌性阴道炎的优势菌,将这三种菌作为制备灭活疫苗的候选种子菌。4根据细菌生长曲线,凝固酶阴性葡萄球菌的菌液浓度在12h时达高峰,大肠埃希菌在10h达到高峰,肺炎克雷伯在18h达高峰,此时均为细菌处于稳定期的种子菌。37℃条件下,甲醛浓度为0.3%,灭活36h时对这3种菌的灭活效果最佳,对甲醛灭活后制备的联合疫苗进行接种培养后无细菌生长且稳定性良好。结论1引起细菌性阴道炎的主要病原菌为凝固酶阴性葡萄球菌,大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌,因此这三种细菌可作为制备细菌性阴道炎灭活疫苗的候选种子菌。2凝固酶阴性葡萄球菌在培养12h、大肠埃希菌10h、肺炎克雷伯菌18h时收获细菌最佳。37℃条件下甲醛灭活的最佳条件组合为:浓度0.3%,灭活时间36h,制备的灭活疫苗接种培养后无细菌生长且稳定性良好。图6幅;表9个;参92篇。
徐佳[2]（2020）在《旋毛虫天冬氨酸蛋白酶生物学特性鉴定及其在虫体侵入宿主肠上皮细胞中作用的研究》文中研究指明旋毛虫病是一种食源性人兽共患寄生虫病,在全球范围内广泛分布,对公共卫生安全造成巨大威胁。研究旋毛虫侵入相关蛋白与宿主互作机制,对于筛选抗旋毛虫药物和研制疫苗具有重要指导意义。天冬氨酸蛋白酶（aspartic proteases,ASPs）是多种寄生性蠕虫的毒力因子,在虫体侵入宿主、发育、免疫逃避中具有重要的作用。然而,ASPs在旋毛虫侵入宿主过程中所发挥的功能尚不明确。本研究选取了旋毛虫中两种具有天冬氨酸蛋白酶结构域的虫体蛋白（TsASP1和TsASP2）,克隆表达获得重组蛋白rTsASP1和rTsASP2;分析了 2种旋毛虫蛋白的生物学特性及酶活性;将rTsASP1和rTsASP2分别免疫小鼠,分析2种蛋白抗旋毛虫感染的免疫保护作用;应用RNAi技术研究2种蛋白在旋毛虫侵入宿主小肠上皮细胞（intestinal epithelial cells,IECs）中的功能。本研究结果有助于阐明旋毛虫ASPs的生物学特性及在虫体侵入宿主IECs中的作用,可为研制相应的抗旋毛虫疫苗及药物提供理论基础。材料与方法1.寄生虫、实验动物、细胞系旋毛虫（ISS534）在本实验室经小鼠传代保存;BALB/c小鼠购自河南省实验动物中心;小鼠IECs从胎鼠中分离获得;小鼠成肌细胞（C2C12）系本实验室保存。所有动物实验经郑州大学实验动物伦理委员会同意。2.TsASP1和TsASP2的基因克隆、原核表达和特性分析根据旋毛虫的全基因组信息选定两种天冬氨酸蛋白酶（TsASP1和TsASP2）,通过软件及在线工具对两个蛋白进行生物信息学分析。应用RT-PCR从旋毛虫肌幼虫中扩增出TsASP1/TsASP2基因,借助不同表达载体（pQE-80L和pMAL-c2x）原核表达并纯化获得带有His标签和MBP标签的重组蛋白,利用含His标签的重组蛋白免疫小鼠后获得多克隆血清。通过RT-PCR、Real-time PCR、Western-blot及免疫荧光对TsASP1和TsASP2在旋毛虫不同发育时期的基因转录、蛋白表达水平及定位情况进行分析。3.rTsASP1和rTsASP2的酶活鉴定及免疫保护作用分析以血红蛋白及特异性荧光肽段为底物,检测rTsASP1及rTsASP2的蛋白水解活性。通过SDS-PAGE进一步分析具有蛋白水解活性的rTsASP2对其他天然蛋白（血清白蛋白、IgG、IgM、纤维蛋白原及胶原IV）的水解情况;分析rTsASP2抗血清和pepstatin A对rTsASP2水解活性的抑制情况;分析rTsASP2水解特异性底物的酶动力学及其在不同温度、pH及抑制剂环境下的酶催化特征。将rTsASP1及rTsASP2经皮下免疫小鼠,并设置PBS、MBP及佐剂对照组。应用ELISA对免疫后小鼠血清抗体（IgG、IgG1、IgG2a）、肠道IgA、脾脏和肠系膜淋巴结（MLN）细胞的细胞因子IFN-γ和IL-4进行检测。在免疫程序结束后对小鼠进行旋毛虫攻击感染,感染后6天和35天分别计算成虫和肌幼虫虫荷及雌虫生殖力,分析免疫后小鼠产生的免疫保护类型及免疫保护效率。4.RNAi沉默TsASP1和TsASP2方法的建立设计特异性TsASP1 siRNA、TsASP2 siRNA、Control siRNA,经电穿孔导入旋毛虫肌幼虫体内。通过显微镜观察带有荧光标记的siRNA导入虫体的情况。通过对RNAi作用后各组虫体中TsASP1和TsASP2的基因转录及蛋白表达水平的检测,分析RNAi基因沉默效果。以TsASP1 siRNA及TsASP2 siRNA互为对照,确定RNAi作用的靶特异性,建立RNAi沉默TsASP1和TsASP2的方法。5.RNAi沉默TsASP1和TsASP2基因的虫体对入侵IECs的影响通过Far-western blot、ELISA、激光共聚焦分析rTsASP1和rTsASP2与IECs间的相互结合作用;分析RNAi作用后虫体中TsASP1和TsASP2与IECs间结合效率的变化情况。建立体外虫体侵入IECs单层细胞模型,分析两种蛋白及相应抗血清对虫体侵入IECs的影响;检测RNAi作用后虫体对IECs单层细胞的侵入效率和损伤的变化情况,确定两种蛋白在虫体侵入IECs中的功能。将不同siRNA及PBS处理过的虫体经口感染小鼠:对各组小鼠的十二指肠切片进行PAS和HE染色,观察虫体侵入宿主后引起肠道病理变化;对回收的6 d成虫和35 d肌幼虫虫荷及6 d雌成虫生殖力进行分析;对不同虫期的虫体长度进行观察并测量;通过扫描电镜观察6 d成虫虫体表面形态。分析RNAi对虫体发育的影响及TsASP1和TsASP2在虫体侵入宿主过程中发挥的功能。6.统计学分析应用SPSS19.0软件对实验数据进行处理,采用的方法主要有单因素方差分析、卡方检验、线性回归等。P<0.05即为数据统计学差异。结果1.TsASP1和TsASP2的基因克隆、原核表达及鉴定生物信息学分析表明,TsASP1和TsASP2都有信号肽、无跨膜区,属于天冬氨酸蛋白酶超家族,且具有双叶型的肽链折叠结构。TsASP2具有天冬氨酸蛋白酶经典活性位点序列Asp-Thr（Ser）-Gly,位于双叶活化中心,而TsASP1的活性位点与经典序列有一些不同。通过克隆及表达成功获得重组蛋白。rTsASP1的分子量为43 kDa（His标签）、86 kDa（MBP 标签）;rTsASP2 的分子量为 42.9 kDa（His 标签）、85.9 kDa（MBP 标签）,与预测一致。TsASP1和TsASP2基因在肌幼虫（ML）、感染性幼虫（IIL）、成虫（AW）和新生幼虫（NBL）阶段均有转录,其中IIL时期转录水平最高,NBL时期转录水平最低。两种蛋白在ML、IIL、AW及ML的排泄分泌抗原（ES）中被相应抗血清所识别,但在NBL中不能被识别。免疫荧光结果表明:TsASP1主要位于虫体的肌肉细胞、杆状体、雌成虫子宫内胚胎周围;TsASP2主要位于ML和IIL虫体的肌肉细胞、中肠和后肠、雌成虫子宫内胚胎周围。2.TsASP1和TsASP2的酶活性分析及免疫保护作用蛋白水解活性检测表明,rTsASP 1不能水解血红蛋白（Hemoglobin,Hb）,rTsASP2能在酸性条件下水解人、鼠和牛Hb,但不水解鸡Hb。rTsASP2水解小鼠Hb的最佳pH值为2.5,水解人和牛Hb最佳pH值为4.5,且水解鼠Hb的效率高于人和牛Hb。rTsASP2亦能水解胶原IV和人IgM。以特异性肽段为底物,测得rTsASP2在pH 2.0至6.0间均有活性,在pH 3.0、温度37℃时相对酶活最高。Pepstatin A可显着抑制rTsASP2酶活。此外,Cu2+、Fe2+可抑制酶活,Mg2+则对酶活有增强作用。通过米氏方程确定 rTsASP2 酶反应动力学:Vmax＝16.68±0.3465 nM/min,Km＝2.254±0.1878 nM。将rTsASP1和rTsASP2分别免疫小鼠:血清中特异性IgG水平显着增高,IgG1的表达水平高于IgG2a;肠道中总IgA及特异性IgA水平增高,表明蛋白免疫后诱导宿主产生了肠道粘膜免疫;脾脏和MLN细胞产生的IFN-γ和IL-4水平均升高,表明宿主产生了 Th1/Th2混合型免疫作用。免疫后对小鼠攻击感染300条旋毛虫:TsASP1和TsASP2免疫组的6 d成虫虫荷减虫率分别为49.79%（P<0.05）和54.18%（P<0.05）;TsASP1和TsASP2免疫组的35 d肌幼虫虫荷减虫率分别为50.55%（P<0.05）和54.59%（P<0.05）,表明免疫小鼠后对旋毛虫感染产生了免疫保护作用。3.RNAi沉默TsASP1和TsASP2方法的成功建立荧光显微镜观察结果表明,siRNA成功被导入虫体。不同siRNA或PBS处理组的虫体在培养1 d或7d后死亡率无显着差异（P<0.05）,表明电转siRNA对虫体死亡率无影响。TsASP1或TsASP2 siRNA处理虫体1d后,即产生有效沉默效果,在第5 d效果最为显着:TsASP1转录水平和蛋白表达水平分别降低66.52%（P<0.05）、63.60%（P<0.05）;TsASP2转录水平和蛋白表达水平分别降低58.69%（P<0.05）、64.86%（P<0.05）。Control siRNA处理对TsASP1和TsASP2的基因转录及蛋白表达无明显影响。特异性分析显示TsASP1 siRNA及TsASP2 siRNA具有靶特异性。以上结果表明本研究通过RNAi对TsASP1及TsASP2沉默成功。4.RNAi沉默TsASP1和TsASP2对虫体发育及侵入IECs的影响分析TsASP1 siRNA处理组的虫体天冬氨酸蛋白酶活性为对照组的93.1%（P>0.05）;TsASP2 siRNA处理组为对照组的43.3%（P<0.05）。该结果证明TsASP2对虫体天冬氨酸蛋白酶活性有贡献,而TsASP1无天冬氨酸蛋白酶活性。rTsASP1和rTsASP2都能够结合IECs蛋白,且具有剂量依赖性。两种蛋白与IECs结合位置存在差异:rTsASP1结合在IECs的细胞质中;rTsASP2结合在IECs的细胞膜及部分胞质中。同时,两种蛋白免疫血清可以检测到虫体可溶蛋白中天然TsASP1和TsASP2与IECs存在结合,但经RNAi沉默后,这种结合能力显着降低。体外侵入实验显示:rTsASP1与rTsASP2均可促进虫体侵入IECs单层细胞;对应的免疫血清可抑制虫体侵入IECs细胞单层。RNAi作用后,虫体对IECs的侵入率显着降低:其中TsASP1 siRNA组侵入率降低29.45%（P<0.05）;TsASP2 siRNA组侵入率降低35.22%（P<0.05）。分析体外侵入实验后IECs细胞单层损伤情况,TsASP1 siRNA和TsASP2 siRNA处理组细胞损伤数量分别降低42.92%（P<0.05）和66.24%（P<0.05）。上述结果揭示两种蛋白在虫体侵入IECs单层细胞中发挥重要功能。Control siRNA组小鼠肠道切片呈现小肠上皮细胞水肿、结构损伤、杯状细胞增多等病理变化,而TsASP1和TsASP2基因沉默组病理变化不明显,且6 d成虫、35 d肌幼虫虫荷及NBL产出量较对照组均显着下降;TsASP1 siRNA组的雌成虫和雄虫长度分别减少16.37%（P<0.05）和11.92%（P<0.05）;TsASP2 siRNA组的雌成虫和雄虫长度分别减少20.46%（P<0.05）和24.65%（P<0.05）。扫描电镜显示Control siRNA组的6 d成虫表皮较为光滑,TsASP1和TsASP2基因沉默组的6 d成虫表皮出现一定的皱褶。以上结果表明这两种蛋白在虫体侵入宿主及虫体发育过程中发挥重要功能。结论1.通过原核表达系统成功获得重组蛋白rTsASP1和rTsASP2。TsASP1和TsASP2在旋毛虫不同发育虫期均有转录,在IIL时期转录水平最高,NBL时期转录水平最低且未检测到这2种蛋白的表达。前者主要定位于虫体切片的肌细胞、杆状体、雌虫子宫内胚胎周围,而后者主要定位于肌细胞、中肠和后肠、雌虫子宫内胚胎周围。2.rTsASP2具有天冬氨酸蛋白酶活性,rTsASP1无酶活性。两种蛋白免疫小鼠后均可诱导Th1/Th2混合型免疫反应和抗旋毛虫感染的免疫保护作用,其中rTsASP2产生的免疫保护效果相对更好。3.TsASP1和TsASP2均能结合IECs并促进虫体侵入IECs;RNAi沉默后,虫体中TsASP1和TsASP2表达量显着降低,虫体对宿主IECs的侵入和虫体发育受到抑制。4.TsASP1和TsASP2均是旋毛虫侵入宿主相关蛋白,且两种蛋白均可作为抗旋毛虫疫苗的候选抗原分子。
姜鹏[3]（2020）在《旋毛虫烯醇酶激活宿主纤溶系统促进幼虫侵入肠黏膜机制的研究》文中指出旋毛虫（Trichinella spiralis）是重要的食源性寄生线虫,其成虫寄生于宿主小肠黏膜内。幼虫能否侵入宿主肠黏膜,是旋毛虫感染宿主与致病的关键;然而,幼虫侵入肠黏膜的机制仍不清楚。形态学研究发现,侵入期幼虫的口孔并无齿（矛）状结构,因而,幼虫侵入肠黏膜并非单纯机械力作用,极可能是幼虫的蛋白酶介导了侵入过程。烯醇酶（enolase）是糖酵解过程的关键酶,也是一个多功能蛋白,在纤溶系统激活、肌肉再生、细胞应激、癌细胞转移及感染等过程中发挥重要功能。研究表明,烯醇酶参与了病原生物感染宿主的过程并发挥了重要作用。我们的前期研究发现,幼虫在与宿主小肠上皮细胞（IECs）共孵育后,旋毛虫烯醇酶基因（Ts-eno）的相对转录水平显着升高,旋毛虫烯醇酶（Ts ENO）的表达量明显增加;此外,在旋毛虫肠道感染性幼虫（IIL）的表面蛋白中也鉴定出了高丰度的Ts ENO;提示,Ts ENO参与了幼虫侵入宿主肠黏膜的过程,但尚不清楚Ts ENO在幼虫侵入过程中发挥作用的具体方式和分子机制。截至目前,已在多种病原体（细菌、原虫、蠕虫和昆虫）侵入宿主的过程中观察到烯醇酶结合宿主纤溶酶原（PLG）,促进纤溶系统激活,加速病原体入侵的现象。纤溶系统不仅在血管内发挥作用,在组织液中也广泛分布。生理状态下,由于纤溶酶原激活物（PAs）与纤溶抑制物（PAI-1和α2-AP）相互制约,机体内纤溶系统维持凝血与纤溶之间的动态平衡,避免出现纤溶亢进（出血倾向）或血栓形成。研究提示,烯醇酶在感染过程中可作为PLG的受体,打破纤溶系统的动态平衡,促进纤溶系统激活,利用纤溶酶（PLM）靶向降解细胞外基质（ECM）的作用,协助幼虫侵入,但分子机制尚不明确。Ts ENO能否作为宿主PLG的受体?能否结合宿主组织液中的PLG并与之发生相互作用?Ts ENO打破平衡态纤溶系统、促进纤溶系统激活的分子机制是什么?Ts ENO是否具有促进幼虫侵入宿主的功能?是本研究关注的科学问题。本研究应用生物信息学技术,深入分析了Ts ENO的分子生物学特征,构建了Ts ENO的3D分子模型,并与已解析晶体结构的人PLG分子进行对接,明确了Ts ENO结合宿主PLG并发生相互作用的方式和分子机制;在对Ts ENO进行系统的生物信息学研究基础上,体外表达、纯化出重组的Ts ENO（r Ts ENO）和定点突变的重组Ts ENO（M-r Ts ENO）,分别制备对应的抗血清;分析了Ts-eno在旋毛虫不同发育期的转录表达水平及Ts ENO的虫体组织定位;对r Ts ENO与宿主肠黏膜、PLG的结合能力进行了鉴定;分析r Ts ENO的酶活性,通过竞争性结合实验和PLG激活试验,验证了Ts ENO与PLG相互作用的分子机制;通过旋毛虫体外侵入细胞模型、动物试验和RNA干扰技术（RNAi）,从多个层次和不同角度,正、反向反复验证了Ts ENO通过激活宿主纤溶系统协助幼虫入侵肠黏膜的科学假设。材料与方法1.旋毛虫种株、实验动物、表达质粒、菌株及细胞旋毛虫河南猪源分离株（T.spiralis,T1）,昆明小鼠保种传代。实验动物为SPF级、雌性6周龄BALB/c小鼠,购自河南省实验动物中心。表达载体p QE-80L及大肠杆菌BL21均为本实验室-80℃冷冻保存。细胞为本实验室分离、原代培养的胎鼠小肠上皮细胞（IECs）。2.Ts ENO的分子生物学特征及与PLG结合能力的分析和实验验证应用生物信息学技术,对Ts ENO（XP＿003371233）的分子生物学特征进行了系统分析;应用Signal P预测信号肽,使用I-TASSER构建Ts ENO的3D分子模型,采用SAVES及Super Pose评估和验证Ts ENO 3D分子模型质量,采用ZDOCK将Ts ENO与PLG（PDB ID:4DUR）进行分子对接,VMD、Lig Plot+（DIMPLOT）及PDBe PISA分析对接结果;明确结合关键位点后,使用I-TASSER构建定点突变的M-Ts ENO分子模型,对比分析关键位点突变产生的影响。将重组p QE-80L/Ts ENO、p QE-80L/M-Ts ENO转化入感受态大肠杆菌BL21（DE3）进行原核表达;Far-Western blot和ELISA检测r Ts ENO、M-r Ts ENO与PLG的结合情况;应用?-ACA,采用竞争性结合试验验证关键位点突变对结合的影响。3.Ts ENO促进纤溶系统激活的分子机制及实验验证应用VMD、Lig Plot+（DIMPLOT）及PDBe PISA分别分析Ts ENO、M-Ts ENO与决定PLG活性的关键色氨酸残基（Trp761）之间的相互作用;计算色氨酸残基（Trp761）在与Ts ENO、M-Ts ENO结合前后相互作用面积（2）、相互作用残基的溶液可及表面积(AASA)、溶剂化能（ΔiG）、氢键、二硫键及疏水相互作用的变化,测量并比较Trp761与其相互作用残基间的距离;测定纯化复性后r Ts ENO、M-r Ts ENO的酶比活力;应用PLG激活试验,观察r Ts ENO、M-r Ts ENO结合并激活PLG产生纤溶酶（PLM）的情况,观察PAs存在与否对r Ts ENO、M-r Ts ENO激活PLG产生PLM的影响,验证Ts ENO通过与PLG的活性决定残基（Trp761）发生相互作用促进纤溶系统激活的分子机制。4.Ts ENO在旋毛虫侵入宿主过程中的作用研究Real-time PCR分析Ts-eno在旋毛虫各期的转录水平,IFA检测Ts ENO在虫体的定位;Far-Western blot检测肌幼虫（ML）排泄分泌抗原（ES）与PLG的结合;IFA检测r Ts ENO与小鼠肠黏膜组织特异性结合;应用旋毛虫幼虫-IECs体外侵入模型,观察不同浓度r Ts ENO、不同稀释度的抗r Ts ENO血清对旋毛虫幼虫体外侵入IECs单层的促进及抑制作用;设计、合成特异性靶向Ts-eno的小干扰RNA（si RNA）,使用电穿孔法导入旋毛虫幼虫体内,应用Western blot检测si RNA对Ts ENO表达水平的抑制情况,通过RNAi反向验证Ts ENO在幼虫侵入过程中的功能;应用r Ts ENO免疫60只BABL/c小鼠后,将旋毛虫肌幼虫以300条/鼠的剂量感染BALB/c小鼠,分别于感染后第5 d和42 d,收集肠道成虫和肌幼虫,统计回收虫数、减虫率、肌肉虫荷（LPG）和生殖力指数（RCI）,分析r Ts ENO免疫小鼠后对幼虫侵入的影响,验证Ts ENO在幼虫侵入肠黏膜过程中的功能。5.统计学分析应用IBM SPSS 21.0统计分析软件包对结果数据进行统计学描述、假设检验及图表绘制,检验水准设定为α=0.05。结果1.Ts ENO的分子生物学特征及其与PLG结合的关键位点确定切除信号肽的Ts ENO长473 aa,约51.95 k Da;Ts ENO与常见寄生虫烯醇酶的序列一致性为62.09%～98.91%,具有烯醇酶家族特征性MOTIF,结构域、金属结合位点、激活位点和底物结合口袋呈现高度保守特征。Verify 3D发现Ts ENO分子模型82.24%残基的3D-1D评分≥0.2,ERRAT计算出Ts ENO的全局质量因子为90.753,拉氏图显示Ts ENO在允许区域内分布的残基占比为98.8%。Super Pose三维结构多重比对结果表明,Ts ENO的结构与5种已解析晶体结构的寄生虫相关烯醇酶（3QTP、1OEP、4G7F、3OTR和5WRO）高度一致;在碳骨架和全分子的均方根偏差（RMSD）最大仅分别为2.03和2.18。Ts ENO和PLG具有结构互补性,赖氨酸残基（Lys90、289、291和300）在结合时发挥关键作用,其中Lys90与PLG的Ser383形成氢键。Ts ENO与M-Ts ENO在碳骨架和全分子间的RMSD仅分别为2.63和3.30,但将M-Ts ENO与PLG对接时,M-Ts ENO出现在相互作用面上的赖氨酸残基仅有Lys116。Far-Western blot发现,r Ts ENO、M-r Ts ENO均能特异性结合PLG,但相同条件下M-r Ts ENO的识别条带明显弱于r Ts ENO。ELISA表明,与r Ts ENO相比,M-r Ts ENO的PLG结合能力明显下降,下降幅度最高达45.37%。不同浓度的ε-ACA均能与r Ts ENO或M-r Ts ENO竞争性结合PLG,ε-ACA的竞争性抑制作用具有随浓度升高而增强的线性趋势(Fr Ts ENO=3532.392,FM-r Ts ENO=3499.730,P均<0.01);不同浓度ε-ACA对r Ts ENO的竞争性抑制作用显着高于M-r Ts ENO（t=3.411,P<0.05）。浓度为25 mmol/L时,ε-ACA对r Ts ENO、M-r Ts ENO的竞争性抑制率分别为64.25%和33%。2.Ts ENO促进纤溶系统激活机制的分析与验证对Ts ENO-PLG蛋白复合物的分析发现,Ts ENO的Glu303与决定PLG活性的关键残基Trp761间的平均距离为7.28 1.60,二者可以通过疏水相互作用结合在一起,Glu303与Trp761在结合时的埋入面积(ABSA)分别为33.97 2和29.55 2,ΔiG依次为-0.24 kcal/mol和0.47 kcal/mol。Trp761与M-Ts ENO（Glu303Ala）的Lys90、Ser91,以及与M-Ts ENO（Lys90 Ala、Lys289Ala、Lys291Ala和Lys300Ala）的Phe48、Tyr93之间,均存在疏水相互作用;Trp761与Lys90、Ser91之间的距离分别为5.35 0.43和7.27 1.41,与Phe48、Tyr93之间的距离分别为5.57 0.51和6.76 0.84。单因素方差分析表明,Trp761与不同相互作用残基之间距离的差异具有统计学意义（F=10.546,P<0.01）;根据相互作用残基间的空间几何构型,Trp761（PLG）在与Glu303（Ts ENO）相互作用时产生的空间位移最大（7.28）;互作产生的位移在一定程度上减少了Trp761对PLG底物结合口袋（由催化残基His603、Asp646和Ser741组成）的物理阻挡,有利于PLG的激活。Ts ENO催化糖酵解途径中2-PGA PEP反应的活性位点（Glu246、Lys382）在突变前后均未出现在与PLG的相互作用面上。在37℃、p H=7.5的反应条件下,r Ts ENO和M-r Ts ENO催化正向反应（2-PGA?PEP）时的酶比活力分别为36.77 20.22 U/mg和34.63 16.86 U/mg,逆向反应时依次为16.73 10.70 U/mg和17.20 13.82 U/mg;r Ts ENO和M-r Ts ENO催化正向反应时（2-PGA?PEP）的Km值分别为0.78 mmol/L和0.80 mmol/L,最大反应速率Vmax分别为0.42μmol/min/mg和0.40μmol/min/mg。含有Mg2+的缓冲体系可使r Ts ENO和M-r Ts ENO达到最佳酶催化活力,Zn2+、Mn2+、Fe2+和Cu2+的促进作用不及Mg2+,K+、Ni2+、Al3+、Ca2+和Li+对该酶促反应仅有非常微弱的启动作用,而Cr3+则对r Ts ENO和M-r Ts ENO的酶活性具有完全的抑制作用。PLG或t-PA单独与r Ts ENO、M-r Ts ENO、肌幼虫可溶性抗原或ES抗原相互作用时,各组OD405值之间的差异不具有统计学意义(FPLG=1.355,Ft-PA=1.013,P均>0.05);当PLG与t-PA共同存在时,t-PA可以激活PLG并产生PLM,添加不同的蛋白后,各组OD405值之间的统计学差异具有显着性(FPLG+t-PA=344.875,P<0.05);r Ts ENO、M-r Ts ENO、肌幼虫可溶性抗原和ES抗原均明显地促进PLG的激活、增加PLM的产生量（P<0.05）;其中以肌幼虫可溶性抗原的促进作用最强,随后依次为r Ts ENO、M-r Ts ENO和ES。3.Ts ENO在旋毛虫侵入IECs单层及肠黏膜过程中的作用Real-time PCR结果表明,Ts-eno在旋毛虫肌幼虫（ML）、肠道感染性幼虫（IIL）、3 d成虫（3 d AW）、6 d成虫（6 d AW）和新生幼虫（NBL）均转录,以ML期相对转录水平最高（F=7.878,P<0.05）。IFA检测发现,Ts ENO在ML、6 h IIL、24 h IIL、3 d AW、6 d AW和NBL各发育期均表达,主要定位在杆状体、表皮及胚胎中。Far-Western blot证实,ES抗原中包括特异性结合PLG的52 k Da蛋白;IFA结果表明,r Ts ENO可以与小鼠肠黏膜组织特异性结合。体外侵入实验表明,不同浓度r Ts ENO组幼虫侵入数均高于PBS对照(t2=4.564,t4=7.920,t6=24.588,t8=19.100,t10=30.237,P均<0.05),幼虫侵入率具有随r Ts ENO浓度升高而增加的趋势（F=410.744,P<0.01）;抗r Ts ENO血清对幼虫侵入的抑制率最高达51.26%,抑制率具有随血清稀释倍数增加而降低的趋势（F=557.494,P<0.05）。使用si RNA-97干扰幼虫可使Ts ENO的表达量降低53.56%,对幼虫侵入IECs单层造成的抑制率为49.82%。以r Ts ENO免疫BALB/c鼠后,5 d成虫减虫率为31.79%,42 d肌幼虫减虫率为47.15%;r Ts ENO免疫组的LPG及RCI均低于佐剂组和PBS对照组(FLPG=39.375,FRCI=46.533;P均<0.01)。结论1.旋毛虫烯醇酶（Ts ENO）的4个赖氨酸残基（Lys90、289、291和300）在Ts ENO与宿主纤溶酶原（PLG）结合时发挥重要作用。2.Ts ENO 4个赖氨酸残基的定点突变,导致M-r Ts ENO与PLG的结合能力显着降低;在与t-PA共同存在时,r Ts ENO能明显地促进PLG激活。3.重组Ts ENO具有促进幼虫侵入的功能,可诱导产生特异性免疫保护;Ts ENO是旋毛虫侵入宿主肠黏膜时的重要蛋白,可能是研制新型抗旋毛虫疫苗/药物的候选靶标。
赵春艳[4]（2019）在《贾第虫病毒RNA依赖RNA聚合酶互作蛋白的筛选与鉴定》文中进行了进一步梳理十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis）,曾被称为蓝氏贾第虫（Giardia lamblia）,简称贾第虫（Giardia）,作为一种寄生性原虫,主要造成人和动物腹泻等临床症状,在世界范围内分布流行,严重威胁着动物和人类健康,但目前仍缺乏有效的药物或疫苗进行防控,究其原因主要是对贾第虫的致病机制不完全清楚。贾第虫作为一种“模式生物”,因此对贾第虫相关机制的研究显得尤为重要。寄生虫病毒专性寄生于虫体内,研究显示,原虫病毒能够影响原虫本身的致病性和毒力。相关报道表明贾第虫病毒感染后能抑制贾第虫的生长,降低贾第虫的致病性,从而减轻贾第虫病的临床症状,虽然贾第虫病毒的侵入可以改变贾第虫的生长发育特征,但贾第虫和贾第虫病毒之间的作用机制还需要进一步的深入研究。RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）作为dsRNA病毒编码的主要蛋白,研究表明RdRp蛋白在发挥其重要作用时,可与病毒其他成分或者宿主因子发生相互作用,但是关于十二指肠贾第虫病毒RdRp蛋白的相关研究还相对较少。因此,本研究通过构建贾第虫酵母双杂交cDNA文库,筛选RdRp蛋白的相互作用蛋白,并利用GST pull-down、免疫共沉淀、双分子荧光互补和Duolink?PLA技术分别验证RdRp蛋白与互作蛋白间的相互作用。贾第虫酵母双杂交cDNA文库的构建:通过Trizol法提取贾第虫滋养体（WBc2株）RNA,反转录为cDNA,利用SMART技术构建贾第虫酵母双杂交c DNA质粒文库,结果表明构建的文库库容为3.7×106 cfu,随机挑取的60个单克隆菌落中插入片段在400bp2kbp范围内,文库的重组率约为100%。贾第虫病毒RdRp互作蛋白的筛选:利用基因工程技术,将PCR扩增得到的贾第虫病毒RdRp片段与诱饵载体pGBKT7重组构建诱饵质粒pGBKT7-RdRp,并将诱饵载体转化Y2HGold酵母感受态细胞。结果表明该诱饵蛋白在酵母细胞中成功表达,对酵母细胞无明显毒害作用,且无自激活现象。将pGBKT7-RdRp与cDNA文库质粒共转化感受态筛选互作蛋白,初步筛选出与RdRp相互作用的蛋白是伴侣蛋白J,α-半乳糖苷酶试验初步验证了RdRp与伴侣蛋白J存在相互作用。RdRp与伴侣蛋白J相互作用的体外验证:构建原核表达载体pET-32a-RdRp和pGEX-4T-1-伴侣蛋白J,诱导表达并纯化获得重组蛋白,结果显示二者均能可溶性表达蛋白,将表达纯化的重组蛋白RdRp与伴侣蛋白J共孵育,通过GST pull-down技术验证两种蛋白在体外存在相互作用。RdRp与伴侣蛋白J在细胞内相互作用的验证:构建真核表达载体pcDNA-His-RdRp和pcDNA-HA-伴侣蛋白J,共转染HEK-293T细胞,Western blot检测蛋白表达情况。结果显示RdRp与伴侣蛋白J均能在HEK-293T细胞中表达,免疫共沉淀结果表明两种蛋白存在相互作用。将构建的双分子荧光载体pbFos-RdRp和pbJun-伴侣蛋白J共转染到HEK-293T细胞,双分子荧光技术验证RdRp和伴侣蛋白J在HEK-293T细胞中存在相互作用。RdRp与伴侣蛋白J在十二指肠贾第虫内相互作用的验证:制备兔源RdRp蛋白和鼠源伴侣蛋白J蛋白多抗血清,利用Duolink?PLA技术验证RdRp和伴侣蛋白J在贾第虫体内的相互作用,发现红色荧光主要分布在贾第虫的细胞质中,结果表明RdRp和伴侣蛋白J在贾第虫内存在相互作用。伴侣蛋白J功能的初步研究:将浓度为100μM和200μM的抑制剂KNK437分别处理贾第虫滋养体,以降低伴侣蛋白J的基因表达,检测对贾第虫增殖和贾第虫病毒复制的影响。表明伴侣蛋白J表达量下降后可降低贾第虫滋养体的增殖以及贾第虫病毒的拷贝数,初步表明伴侣蛋白J对贾第虫病毒RdRp具有正调节作用。综上所述,通过构建贾第虫酵母双杂交cDNA质粒文库初步筛选出与RdRp存在相互作用的蛋白是伴侣蛋白J,利用GST pull-down、免疫共沉淀和双分子荧光互补技术验证了RdRp和伴侣蛋白J的相互作用,并利用Duolink?PLA技术进一步验证了RdRp和伴侣蛋白J在贾第虫的细胞质中存在相互作用,并初步研究发现其对贾第虫病毒呈正调控作用,这为深入研究贾第虫伴侣蛋白J对贾第虫病毒的作用提供了理论基础。
孟立正,田华洁,黄晓星,王一飞,徐小涛,刘莉[5]（2016）在《小鼠滴虫性阴道炎模型的建立》文中研究表明目的建立小鼠滴虫性阴道炎模型。方法从临床滴虫性阴道炎患者白带样品中分离和纯化阴道毛滴虫株。造模前,小鼠分别给予雌二醇（2.5 mg/kg,接种前第9天至接种前第2天连续给药）和地塞米松（10 mg/kg,接种前第4天至接种后第6天连续给药）预处理,小鼠阴道内接种滴虫株后选取不同时间点观察滴虫感染情况,对滴虫感染后的小鼠阴道组织切片经HE染色观察其病理组织学改变。结果接种阴道毛滴虫后第4、6、8和10天,小鼠滴虫感染率分别为93.2%、100%、89.5%和82.9%。病理组织学观察显示,滴虫性阴道炎小鼠可见阴道壁变厚、水肿以及炎症细胞浸润等病理学变化。结论小鼠经雌二醇和地塞米松预处理后给予阴道毛滴虫接种,可成功建立小鼠滴虫性阴道炎模型。
王文柯[6]（2016）在《阴道毛滴虫RRas基因克隆，表达及鉴定》文中研究说明阴道毛滴虫是一种性传播原生动物寄生虫,致病机制尚不清楚。RRas蛋白已证实在细胞的生长、分化、细胞增殖,细胞骨架、细胞粘着和迁移中发挥重要作用。阴道毛滴虫RRas蛋白与人类有相似的结构域和功能域,是否对阴道毛滴虫致病性有关,需要进一步研究。本研究采用基因工程技术一步克隆并表达了阴道毛滴虫RRas基因。将重组蛋白纯化后,免疫BALB/c小鼠,测其效价,获得重组蛋白免疫血清,应用SDSPAGE和Western blot技术分析该重组蛋白的免疫原性,并为其在阴道毛滴虫组织内定位做准备。利用CCK8试剂盒检测阴道毛滴虫RRas蛋白对人类肿瘤细胞增殖的作用,为探讨阴道毛滴虫RRas蛋白对人类肿瘤的发生发展作用做准备。材料与方法1.阴道毛滴虫虫株、质粒,菌株,实验动物及细胞系阴道毛滴虫（阴道毛滴虫分离株来自郑州大学第三附属医院检验科门诊女性患者）。BALB/c小鼠（雌性、四周龄,河南省实验动物中心）PQE-80L质粒,BL21菌株（由本实验室保存）,所用细胞系为人宫颈癌（HeLa）细胞系（由本实验室保存）食管癌（Eca-109）细胞系（病理教研室保存）。2.阴道毛滴虫RRas基因的一步克隆与表达登陆GenBank查阴道毛滴虫RRas基因的mRNA序列,结合PQE-80L质粒的克隆位点及同源重组序列设计上下游引物。,提取阴道毛滴虫的总RNA,反转录为cDNA,通过PCR反应获得目的基因经PCR产物纯化试剂盒纯化后,将其克隆至线性化后的表达载体PQE-80L,对重组质粒进行测序鉴定,鉴定正确后,将PQE-80L-Tv RRas转入大肠杆菌BL21（DE3）。对重组质粒进行菌落PCR,双酶切及测序鉴定,鉴定后,用合适浓度IPTG诱导阳性BL21,收集菌体沉淀,经一步法细菌活性蛋白提取试剂盒提取蛋白,进行SDS-PAGE,观察否有目的蛋白表达,并对表达产物的可溶性进行分析。3.阴道毛滴虫重组蛋白PQE-80L-TvRRas纯化及鉴定用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,用生工生物活性蛋白提取试剂盒提取蛋白,可溶性鉴定后,目的蛋白用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒亲和层析纯化。进行Western blot分析,鉴定阴道毛滴虫重组AP51蛋白的免疫原性及抗原性。4.阴道毛滴虫重组蛋白对人类肿瘤细胞增殖的作用重组蛋白PQE-80L-TvRRas和人hela细胞及Eca-109细胞共培养一个细胞周期后,用CCK8试剂盒检测其对肿瘤细胞增殖的作用。结果1.通过双酶切及测序鉴定,结果显示PQE-80L-TvRRas重组质粒构建成功.经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（0.5mmol/mlIPTG）诱导表达,SDS-PAGE结果显示在26 kDa处新增加一条带,表明重组蛋白表达成功。所克隆的阴道毛滴虫RRas基因对长度为664bp,编码蛋白含有204个氨基酸,等电点为4.81,蛋白大小约为23.6kd,对该蛋白进行可溶性鉴定发现其以可溶性形式表达。2.Western blot结果表明,抗His标签鼠单克隆抗体能够识别PQE-80L-Tv RRas蛋白,阴道毛滴虫重组蛋白可被阴道毛滴虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠血清识别,而不能被正常BALB/c小鼠血清识别。阴道毛滴虫可溶性蛋白可被阴道毛滴虫重组蛋白免疫BALB/c小鼠血清识别,而不能被正常BALB/c小鼠血清识别。均在约24KD处显示明显条带,表明该蛋白有较好的抗原性及免疫原性。3.CCK8细胞增殖结果证明,阴道毛滴虫重组蛋白对人类肿瘤细胞hela细胞及Eca-109具有促进细胞增殖的作用。结论1.一步克隆并成功表达了阴道毛滴虫RRas基因。2.重组蛋白具有良好的抗原性以及免疫原性。3.阴道毛滴虫RRas重组蛋白与人类肿瘤细胞hela细胞及Eca-109共孵育,与人类RRas蛋白有相同的促进细胞增殖的作用。
姜夕玥[7]（2015）在《鸽毛滴虫粘附蛋白AP65的克隆、鉴定及表面定位》文中进行了进一步梳理鸽源禽毛滴虫,简称鸽毛滴虫,是一种侵害鸽消化道上段的鞭毛原虫,从而引起鸽毛滴虫病,亦称为“鸽癀”。鸽毛滴虫可感染所有品种和月龄的鸽子,其中对幼鸽危害最大。鸽毛滴虫病的特征是在鸽口腔、食道、嗉囊、前胃出现坏死性溃疡,常造成患鸽呼吸道和上消化道梗阻,妨碍正常呼吸和进食,继而引发呼吸困难和饥饿,严重时造成宿主死亡。鸽毛滴虫病是一种全球性疾病,具有高发性和广泛流行性。药物治疗鸽毛滴虫病有副作用,而且易产生抗药虫株。目前,亟需寻找安全有效的治疗方法,而致病机制相关分子的研究就成为未来重要的研究方向,具有重要意义。对粘膜微生物致病菌而言,粘附宿主细胞是至关重要的过程。只有粘附于宿主细胞,才能进行物理损伤、侵袭等一系列致病过程。粘附蛋白AP65是一种重要的滴虫毒力基因,在多种粘附蛋白中有突出的作用。鸽毛滴虫作为一种粘膜寄生虫,粘附作用可能是其重要特性,AP65也可能是其重要粘附蛋白。鸽毛滴虫潜在的表面毒力因子的探究,将为鸽毛滴虫致病机制和基因工程疫苗的研究奠定分子基础,为有效防止鸽毛滴虫病提供理论依据。本试验具体分为以下4部分:1.鸽毛滴虫AP65序列的克隆测序本研究根据已知的阴道毛滴虫AP65三个基因型序列设计引物,克隆获得鸽毛滴虫AP65部分序列,结合5’RACE PCR和3’RACE PCR获取鸽毛滴虫AP65两端未知序列。通过试验和拼接分析获得两个基因型TgAP65-1（1766bp）、TgAP65-2（1759bp）,ORF长1704bp,编码567个AA,上传至GenBank获得序列号KJ721787、KJ721788。2.鸽毛滴虫AP65的序列分析对两个基因型进行序列比对发现,两者核酸同源性为94.22%,AA同源性达95.6%,并且差异主要存在于5’端。同时,对鸽毛滴虫AP65和阴道毛滴虫AP65各基因型的同源性进行了分析,同源性可达90.0%左右,同阴道毛滴虫苹果酸脱氢酶和氢化酶体苹果酸酶高同源（80%）。鸽毛滴虫TgAP65-1、TgAP65-2分别编码一个大小为63057.81Da、63042.74Da的蛋白质,pI分别为8.15、8.48。通过生物信息学软件对氨基酸序列进行分析预测,并结合已知阴道毛滴虫AP65结构功能信息比较,我们发现鸽毛滴虫AP65有短信号肽、无GPI、多个蛋白结合位点、两个苹果酸酶域,分别位于88-278,280-533位置。3.鸽毛滴虫TgAP65-2重组蛋白多克隆抗体的制备构建重组质粒pPIC9.0k-TgAP65-2,并采用氯化锂转染法将重组质粒转入毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达,并用Ni柱纯化。经Western-blot鉴定表达的重组蛋白大小约为65KDa,与理论值相符。将纯化后的重组鸽毛滴虫AP65蛋白三次免疫BALB/c小鼠进行多克隆抗体的制备。通过间接ELISA方法测定抗鸽毛滴虫AP65抗体的效价后,将分离的小鼠血清作为多克隆抗体使用。4.鸽毛滴虫自然表达AP65的鉴定及虫体表面定位裂解虫体进行SDS-PAGE和Western-blot对鸽毛滴虫自然表达的AP65进行鉴定,结果显示AP65为虫体蛋白。通过间接免疫荧光检测试验对虫体自然表达的AP65进行虫体表面定位,荧光显微镜下可见虫体表面及鞭毛上都有荧光,但荧光较弱。
周良佳,连大帅,许锴,伊科拉木,普琼次仁,吴建茹,陈璐斯,杨天,谢彦昕,王蓓[8]（2015）在《现有液体培养法检测解脲脲原体效果的评价》文中认为目的以固体培养基为金标准,对现有液体培养法进行评价,并进一步探讨改良的方法。方法用液体培养基、新型固体培养基及梅里埃培养基平行检测63例临床宫颈分泌物试子,根据灵敏度、特异度、假阳性率、假阴性率等指标对现有液体培养法、梅里埃培养基检测Uu的效果进行评价。结果液体培养法Uu检出率为36.7%,梅里埃培养基Uu检出率为66.7%,新型固体培养基Uu检出率为84.1%。以固体培养基为金标准,液体培养法的灵敏度较低（42.0%）,假阴性率较高（58.0%）,特异度尚可（90.0%）。梅里埃培养基检测Uu的灵敏度（72.9%）明显优于液体培养法（42.0%）。结论有过滤步骤的传统液体培养法的假阴性率过高,考虑改良现有液体培养基,提高检测支原体的真实性和可靠性,建立方便使用且结果真实可靠的检测Uu的方法。
杨森[9]（2014）在《应用噬菌体随机肽库筛选阴道毛滴虫特异性B细胞表位》文中研究指明背景与目的阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis, Donne1837）,是一种主要寄生于人体泌尿生殖道的鞭毛虫,它所引起的阴道毛滴虫病是常见的性传播疾病之一,据WHO统计,全球每年约有1.8亿人感染阴道毛滴虫,同时阴道毛滴虫的广泛流行还增加了HIV病毒和支原体的感染率。目前对于阴道毛滴虫病的快速诊断方法的灵敏度及特异度有限,阴道毛滴虫疫苗的研发工作也相对滞后。本研究运用分子生物学、免疫学和生物信息学的方法技术,运用噬菌体随机7肽库淘选阴道毛滴虫的特异性B细胞表位,并对淘选结果进行免疫原性,敏感性及特异性检测,旨在为阴道毛滴虫病的快速诊断方法及未来疫苗的研发提供理论基础。材料与方法1.将采集到的阴道毛滴虫临床分离株（取自于郑州大学第五附属医院检验科）接种于TYM培养基进行连续培养,达到纯培养后将虫体分别制作为全虫抗原和冻存。2.将全虫抗原经背部皮下多点注射免疫实验用兔（购自于河南省实验动物中心）,每隔2w加强免疫2次,末次免疫后ELISA检测抗体效价,达标后采集、分离并纯化免疫血清,并进一步经Western-Blot和间接免疫荧光检测其免疫原性。3.以纯化后兔抗阴道毛滴虫IgG对噬菌体随机7肽库（购自于美国NEB公司）进行3轮的亲和淘选,ELISA检测淘选结果,并将阳性噬菌体克隆送往生物公司进行测序,将测序结果分别与Genbank上的阴道毛滴虫已知蛋白序列进行比对,并在Protscale在线服务器进行相关生物信息学分析。4.将选取的阳性噬菌体克隆经背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠（购自于河南省实验动物中心）,并同时设立阳性对照、阴性对照及溶剂对照,每隔7d免疫1次,共免疫3次。末次免疫后采集并分离免疫血清,进行ELISA和Western-Blot检测免疫原性,并通过间接免疫荧光试验研究阳性噬菌体展示肽的虫体定位。5.建立阴道毛滴虫小鼠皮下感染模型,每日观察脓肿形成情况及脓液中活虫的数量。以感染血清通过ELISA的方法检测阳性噬菌体克隆的敏感性及特异性。6. ELISA检测阳性噬菌体表位肽免疫小鼠血清中细胞因子IL-4和IFN-y的水平。结果1.阴道毛滴虫在48h左右达到最高生长密度,36～48h为其对数生长期,连续培养3代后即达到纯培养。SDS-PAGE结果表明全虫抗原的蛋白条带分布在10～150kDa之间,其中30-70kDa之间的蛋白条带最为密集。2. ELISA检测的结果显示阴道毛滴虫全虫抗原经免疫实验用兔后可引起较强的免疫反应,产生的抗体滴度大于1：106。Western-Blot发现共有15条的全虫抗原的蛋白成分可被兔免疫血清识别,比小鼠免疫血清多出3条。免疫荧光染色的结果表明虫体可与全虫抗原的兔免疫血清发生免疫反应,呈现红色荧光。3.经过3轮的亲和淘选,共得到14个阳性噬菌体克隆,P1～P14。P1～P14与Genbank上已知的阴道毛滴虫蛋白序列无一级结构的相似性。综合噬菌体ELISA及Protscale在线服务器的生物信息学分析结果,P3、P5和P11的免疫原性相对较强。4. ELISA结果表明P3、P5、P11免疫BALB/c小鼠后都能够引起较强的免疫反应,差异有统计学意义（P<0.05）。Western-Blot的结果显示P11噬菌体克隆的免疫血清可以特异性识别全虫抗原在42kDa左右的蛋白条带。免疫荧光染色结果表明P3和P5免疫血清组的虫体呈现出较弱的绿色荧光,而P11免疫血清组则在虫体的膜部呈现出亮绿荧光。5.皮下接种活虫的小鼠可出现脓肿,在脓液中10d内可检出活虫。ELISA结果表明P3、P5和P11均具有较强的特异性（P<0.05）,P11的敏感性为1μg/ml,P3的敏感性为2μg/ml,P5的敏感性为3μg/ml。6. ELISA结果表明P3、P5和P11免疫完成后1w时小鼠血清中IL-4和IFN-γ的水平均高于M13组和PBS组（P<0.05）,IL-4的升高较为显着,P3、P5和P11这3组之间差异无统计学意义（P>0.05）。结论1.阴道毛滴虫全虫抗原具有良好的免疫原性,其兔免疫血清具有较高的抗体滴度。2.应用噬菌体随机7肽库淘选出14个阴道毛滴虫模拟B细胞表位。其中P3、P5和P11具有良好的免疫原性,并具有较强的特异性及敏感性,提示这些模拟表位在研制特异性诊断试剂方面可能有潜在应用价值。3.P3、P5和P11免疫小鼠后可以使小鼠产生体液免疫及细胞免疫,以体液免疫为主。
朱均昊,章强强[10]（2010）在《男性尿道炎及其相关病原菌实验诊断进展》文中研究说明
二、在固体培养基中培养阴道毛滴虫的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、在固体培养基中培养阴道毛滴虫的研究（论文提纲范文）
（1）细菌性阴道炎优势菌筛选及灭活疫苗的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 细菌性阴道炎优势菌筛选 |
| 1.1 实验材料与仪器 |
| 1.1.1 一般资料 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 标本采集 |
| 1.2.2 分泌物常规镜检及阴道五联检测试剂盒检测 |
| 1.2.3 细菌培养及鉴定 |
| 1.2.4 统计分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 常规镜检及阴道五联检测结果 |
| 1.3.2 细菌菌落特征及镜下革兰染色结果 |
| 1.3.3 细菌生化反应初步鉴定及q RT-PCR鉴定结果 |
| 1.3.4 细菌性阴道炎病原菌频数分布 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 细菌性阴道炎灭活疫苗的制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 必需试剂配制 |
| 2.1.3 菌种的复苏 |
| 2.1.4 细菌菌落计数 |
| 2.1.5 甲醛灭活浓度及时间的选择 |
| 2.1.6 灭活疫苗的制备与保存 |
| 2.1.7 细菌性阴道炎灭活疫苗理化性状及无菌性检验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 细菌复苏结果 |
| 2.2.2 绘制细菌生长曲线 |
| 2.2.3 甲醛灭活浓度和时间筛选结果 |
| 2.2.4 细菌性阴道炎灭活疫苗无菌性检验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第3章 综述 细菌性阴道炎研究现状 |
| 3.1 细菌性阴道炎的流行病学研究 |
| 3.2 细菌性阴道炎的诊断与鉴别诊断 |
| 3.2.1 细菌性阴道炎诊断方法 |
| 3.2.2 细菌性阴道炎鉴别诊断 |
| 3.3 细菌性阴道炎治疗现状 |
| 3.3.1 抗生素治疗 |
| 3.3.2 益生菌制剂 |
| 3.3.3 中医及中西医结合治疗 |
| 3.4 细菌性阴道炎的预防 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（2）旋毛虫天冬氨酸蛋白酶生物学特性鉴定及其在虫体侵入宿主肠上皮细胞中作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 旋毛虫TsASP1和TsASP2的鉴定及免疫保护作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验所用的主要仪器 |
| 1.2 实验购买的主要试剂 |
| 1.3 实验主要的试剂配置 |
| 1.4 生物信息学及序列比对分析 |
| 1.5 实验动物和虫株 |
| 1.6 不同虫期旋毛虫的收集 |
| 1.7 旋毛虫虫体可溶蛋白和ES蛋白的制备 |
| 1.8 TsASP1/TsASP2重组表达质粒构建 |
| 1.9 TsASP1/TsASP2重组质粒的原核表达 |
| 1.10 免疫血清的制备 |
| 1.11 ELISA检测方法 |
| 1.12 TsASP1/TsASP2在不同虫期的转录水平鉴定 |
| 1.13 western blot分析 |
| 1.14 石蜡切片的制备 |
| 1.15 TsASP1/TsASP2在虫体上的定位分析 |
| 1.16 酶活性检测 |
| 1.17 旋毛虫不同虫期天冬氨酸蛋白酶活性分析 |
| 1.18 rTsASP1/rTsASP2免疫保护研究 |
| 1.19 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TsASP1和TsASP2的生物信息学分析 |
| 2.2 重组蛋白的原核表达 |
| 2.3 TsASP1和TsASP2在各虫期的转录和表达水平 |
| 2.4 rTsASP1酶活鉴定 |
| 2.5 rTsASP2酶活鉴定 |
| 2.6 rTsASP1和rTsASP2免疫后产生的体液免疫应答 |
| 2.7 肠液IgA表达水平的检测 |
| 2.8 细胞因子水平的检测 |
| 2.9 rTsASP1和rTsASP2免疫后产生的免疫保护作用分析 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 旋毛虫天冬氨酸蛋白酶基因选择和序列分析 |
| 3.2 重组蛋白的表达和特征分析 |
| 3.3 天冬氨酸蛋白酶活性分析 |
| 3.4 免疫保护 |
| 4 小结 |
| 第二部分 RNAi技术分析TsASP1和TsASP2在旋毛虫侵入宿主小肠细胞中的功能 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1主要的仪器和试剂 |
| 1.2 siRNA的合成 |
| 1.3 电穿孔法导入siRNA |
| 1.4 电穿孔法siRNA引起虫体的死亡率和导入率 |
| 1.5 RNAi沉默效果分析 |
| 1.6 RNAi作用对虫体天冬氨酸蛋白酶活性及虫体蜕皮率的影响 |
| 1.7 TsASP1/TsASP2与小肠上皮细胞的结合及RNAi对其相互结合的影响 |
| 1.8 旋毛虫体外侵入实验及RNAi对虫体侵入IEC的影响 |
| 1.9 RNAi处理虫体感染小鼠后对肠道病理反应的影响 |
| 1.10 RNAi作用对虫体发育、侵入宿主能力和成虫生殖力的影响 |
| 1.11 扫描电镜观察虫体变化 |
| 2 结果 |
| 2.1 siRNA导入旋毛虫虫体及对虫体死亡率的影响 |
| 2.2 RNAi对TsASP1/TsASP2 mRNA转录和蛋白表达的影响 |
| 2.3 RNAi对虫体可溶蛋白酶活性的影响 |
| 2.4 RNAi对蜕皮的影响 |
| 2.5 RNAi对TsASP1/TsASP2与IECs结合的影响 |
| 2.6 RNAi沉默TsASP1/TsASP2对虫体侵入IECs功能的影响 |
| 2.7 不同siRNA处理组虫体感染小鼠后对杯状细胞表达的影响 |
| 2.8 小肠组织HE染色 |
| 2.9 RNAi沉默TsASP1/TsASP2对虫体发育的影响 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 RNAi实验设计 |
| 3.2 RNAi对TsASP1及TsASP2沉默效果分析 |
| 3.3 RNAi沉默TsASP1和TsASP2基因对虫体发育的影响 |
| 3.4 RNAi作用对虫体侵入IECs的影响 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 天冬氨酸蛋白酶在寄生虫中的研究进展 |
| 1 天冬氨酸蛋白酶主要类型 |
| 1.1 胃蛋白酶样天冬氨酸蛋白酶 |
| 1.2 逆转录天冬氨酸蛋白酶 |
| 2 天冬氨酸蛋白酶的结构 |
| 3 天冬氨酸蛋白酶底物肽段 |
| 4 天冬氨酸蛋白酶在寄生虫中的研究 |
| 4.1 秀丽隐杆线虫 |
| 4.2 盘尾丝虫 |
| 4.3 钩虫 |
| 4.4 血吸虫 |
| 4.5 肝吸虫 |
| 4.6 捻转血矛线虫 |
| 4.7 粪类圆线虫 |
| 4.8 斯氏线虫 |
| 4.9 疟原虫 |
| 4.10 弓形虫 |
| 4.11 阴道毛滴虫 |
| 4.12 利什曼原虫 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历、博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）旋毛虫烯醇酶激活宿主纤溶系统促进幼虫侵入肠黏膜机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词(Abbreviations) |
| 前言 |
| 第一部分 旋毛虫烯醇酶的分子生物学特征及其与纤溶酶原的相互作用机制研究 |
| 1 方法 |
| 1.1 TsENO序列信息的获取 |
| 1.2 TsENO的理化性质分析 |
| 1.3 TsENO的疏水性分析 |
| 1.4 TsENO的亚细胞定位分析 |
| 1.5 TsENO的跨膜区分析 |
| 1.6 TsENO的信号肽预测 |
| 1.7 Ts ENO的模体(MOTIF)分析 |
| 1.8 TsENO的结构域分析 |
| 1.9 TsENO的序列保守性分析及进化树构建 |
| 1.10 TsENO的抗原位点预测 |
| 1.11 TsENO的二级结构分析 |
| 1.12 TsENO蛋白结合位点的预测 |
| 1.13 Ts ENO3D分子模型的构建及模型质量评估 |
| 1.14 Ts ENO与 PDB库中已知寄生虫烯醇酶晶体的三维结构比对 |
| 1.15 小鼠PLG与人PLG分子结构的比对与相似性分析 |
| 1.16 Ts ENO与人PLG的分子对接 |
| 1.17 Ts ENO与 PLG的相互作用分析及关键氨基酸位点的确定 |
| 1.18 PLG活性决定位点(Trp761)与Ts ENO的相互作用分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TsENO的序列信息 |
| 2.2 TsENO的理化性质 |
| 2.3 TsENO的疏水性分析结果 |
| 2.4 TsENO的亚细胞定位分析结果 |
| 2.5 跨膜区分析 |
| 2.6 信号肽预测 |
| 2.7 Ts ENO的模体(MOTIF)分析 |
| 2.8 TsENO的结构域分析 |
| 2.9 TsENO的序列保守性分析及进化树构建 |
| 2.10 TsENO抗原位点及空间结构预测 |
| 2.11 TsENO的二级结构分析: |
| 2.12 TsENO蛋白结合位点的预测 |
| 2.13 Ts ENO3D分子模型的构建及模型质量评估 |
| 2.14 Ts ENO与 PDB库中已知寄生虫烯醇酶晶体的三维结构比对 |
| 2.15 小鼠PLG与人PLG分子结构的比对与相似性分析 |
| 2.16 Ts ENO与人PLG的分子对接 |
| 2.17 Ts ENO与 PLG的相互作用分析及关键氨基酸位点的确定 |
| 2.18 PLG的关键氨基酸(Trp761)与Ts ENO的相互作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 TsENO与 PLG相互作用的验证及Ts ENO在旋毛虫侵入时的作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 旋毛虫种株、实验动物、表达质粒、菌株及细胞 |
| 1.5 旋毛虫各期虫体的收集与抗原制备 |
| 1.6 TsENO与 M-TsENO的重组表达、纯化与复性 |
| 1.7 rTsENO的酶活性分析 |
| 1.8 Real-time PCR检测Ts-eno的转录水平 |
| 1.9 IFA检测Ts ENO在虫体表面的表达 |
| 1.10 石蜡切片IFA检测TsENO在虫体内部的组织定位 |
| 1.11 Far-Western blot检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 1.12 ELISA检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 1.13 IFA检测TsENO与小肠上皮组织的特异性结合 |
| 1.14 赖氨酸类似物(?-ACA)竞争性结合试验 |
| 1.15 纤溶酶原激活试验 |
| 1.16 rTsENO及其免疫血清对旋毛虫幼虫侵入肠上皮细胞影响 |
| 1.17 干扰TsENO的表达对IIL侵入IECs的阻断作用 |
| 1.18 rTsENO的免疫保护作用 |
| 1.19 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TsENO与 M-TsENO的重组表达、纯化与复性 |
| 2.2 rTsENO与 M-rTsENO的酶活性分析 |
| 2.3 Real-time PCR检测Ts-eno在旋毛虫不同发育期的转录水平 |
| 2.4 TsENO在旋毛虫不同发育阶段虫体表面的表达情况 |
| 2.5 TsENO在旋毛虫不同发育阶段虫体的表达与定位 |
| 2.6 Far-Western blot检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 2.7 ELISA检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 2.8 IFA检测rTsENO与小肠黏膜组织的特异性结合 |
| 2.9 赖氨酸类似物(?-ACA)竞争性结合试验 |
| 2.10 纤溶酶原激活试验 |
| 2.11 rTsENO及其免疫血清对旋毛虫幼虫侵入肠上皮细胞影响 |
| 2.12 抑制TsENO的表达对IIL侵入IECs的阻断作用 |
| 2.13 rTsENO的免疫保护作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 烯醇酶在寄生虫侵入宿主中的作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（4）贾第虫病毒RNA依赖RNA聚合酶互作蛋白的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 寄生性原虫病毒研究进展 |
| 1 原虫病毒生物学特征 |
| 2 阴道毛滴虫病毒 |
| 3 贾第虫病毒 |
| 4 艾美耳球虫病毒 |
| 5 利什曼原虫病毒 |
| 6 隐孢子虫病毒 |
| 7 阿米巴病毒 |
| 8 巴贝斯虫病毒 |
| 第2章 RNA依赖RNA聚合酶调控蛋白的研究进展 |
| 1 病毒RdRp的调控蛋白 |
| 2 原虫病毒RdRp的调控蛋白 |
| 第3章 蛋白质相互作用技术 |
| 1 酵母双杂交系统 |
| 2 pull down |
| 3 免疫共沉淀 |
| 4 双分子荧光互补技术 |
| 5 Duolink?PLA技术 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 贾第虫酵母双杂交cDNA质粒文库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 贾第虫滋养体培养 |
| 2.2 贾第虫滋养体Total RNA提取 |
| 2.3 短片段去除 |
| 2.4 贾第虫cDNA文库鉴定 |
| 2.5 贾第虫cDNA文库扩增 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第2章 贾第虫病毒RdRp诱饵质粒的构建及互作蛋白的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 pGBKT7-RdRp诱饵质粒的构建 |
| 2.3 Western Blot分析酵母蛋白表达 |
| 2.4 诱饵蛋白自激活及毒性检测 |
| 2.5 阳性克隆筛选及鉴定 |
| 2.6 候选阳性质粒的回返验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第3章 RdRp与伴侣蛋白J相互作用的验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 原核表达载体的构建 |
| 2.2 GST标签融合蛋白的表达和纯化 |
| 2.3 His标签融合蛋白的表达和纯化 |
| 2.4 GST pull-down体外验证RdRp与伴侣蛋白J相互作用 |
| 2.5 免疫共沉淀载体构建 |
| 2.6 重组蛋白在真核细胞中的表达 |
| 2.7 免疫共沉淀验证RdRp与伴侣蛋白J在细胞内的相互作用 |
| 2.8 双分子荧光载体构建 |
| 2.9 双分子荧光互补验证RdRp与伴侣蛋白J在细胞内的相互作用 |
| 2.10 RdRp与伴侣蛋白J在贾第虫内的互作与定位 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第4章 伴侣蛋白J功能的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 抑制剂处理对贾第虫增殖的影响 |
| 2.2 贾第虫病毒衣壳蛋白表达水平检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）小鼠滴虫性阴道炎模型的建立（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 药品和试剂 |
| 1.2 动物 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 方法 |
| 1.4.1 滴虫株的富集、纯化 |
| 1.4.2 形态观察及吖啶橙染色观察 |
| 1.4.3 聚合酶链反应(PCR) 鉴定 |
| 1.4.3.1 滴虫DNA的提取 |
| 1.4.3.2 PCR鉴定 |
| 1.4.4 小鼠滴虫性阴道炎模型建立 |
| 2 结果 |
| 2.1 滴虫株的富集和纯化 |
| 2.2 小鼠滴虫性阴道炎模型的建立 |
| 2.2.1 滴虫感染 |
| 2.3.2 病理组织学检查 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（6）阴道毛滴虫RRas基因克隆，表达及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 阴道毛滴虫及阴道毛滴虫病 |
| 1.2 阴道毛滴虫致病机制 |
| 1.3 研究意义 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 使用仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 质粒和宿主菌 |
| 2.4 阴道毛滴虫虫株，细胞系及实验动物 |
| 3 实验方法及步骤 |
| 3.1 阴道毛滴虫RRas基因的生物学分析 |
| 3.2 引物设计 |
| 3.3 阴道毛滴虫培养 |
| 3.3.1 TYM培养基 |
| 3.3.2 青霉素钠,硫酸链霉素储存液 |
| 3.3.3 培养方法 |
| 3.3.4 阴道毛滴虫保存，复苏 |
| 3.4 阴道毛滴虫总RNA的提取 |
| 3.4.1 实验准备 |
| 3.4.2 阴道毛滴虫Total RNA的提取步骤： |
| 3.4.3 注意事项 |
| 3.5 逆转录获得总c DNA |
| 3.6 PCR扩增目的基因片段 |
| 3.6.1 PCR引物设计 |
| 3.6.2 插入片段PCR扩增 |
| 3.7 PCR产物检测 |
| 3.7.1 1.5％琼脂糖凝胶的制备 |
| 3.7.2 检测方法 |
| 3.8 PCR产物纯化 |
| 3.8.1 PCR产物纯化试剂盒实验准备 |
| 3.8.2 操作步骤 |
| 3.9 质粒提取 |
| 3.9.1 相关试剂的配置方法 |
| 3.9.2 质粒小量制备试剂盒实验准备 |
| 3.9.3 快速操作步骤 |
| 3.10 质粒胶回收 |
| 3.10.1 使用实验准备 |
| 3.10.2 快速操作步骤 |
| 3.11 质粒线性化 |
| 3.12 目的基因与质粒的重组反应 |
| 3.13 BL21感受态制备 |
| 3.14 反应产物转化、涂板 |
| 3.15 质粒阴阳性克隆鉴定 |
| 3.16 重组表达质粒PQE-80L/ Tv RRas双酶切鉴定 |
| 3.17 诱导表达 |
| 3.18 1.0mm SDS-PAGE凝胶制作 |
| 3.18.1 试剂组成 |
| 3.18.2 操作步骤 |
| 3.19 重组蛋白的可溶性鉴定 |
| 3.19.1 一步法细菌活性蛋白提取 |
| 3.19.2 操作步骤 |
| 3.19.3 鉴定步骤 |
| 3.20 可溶性蛋白纯化、复性及保存 |
| 3.20.1 Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒组成 |
| 3.20.2 操作步骤 |
| 3.20.3 透析及保存 |
| 3.21 Western-blot鉴定 |
| 3.21.1 试剂配制 |
| 3.21.2 Western-blot操作步骤 |
| 3.22 动物实验 |
| 3.22.1 ELISA相关试剂配制 |
| 3.22.2 免疫小鼠制备抗血清 |
| 3.23 阴道毛滴虫重组蛋白western-blot分析 |
| 3.24 细胞实验 |
| 3.24.1 细胞培养准备 |
| 3.24.2 实验前准备 |
| 3.24.3 洗手和着装 |
| 3.24.4 细胞复苏 |
| 3.24.5 CCK8实验 |
| 3.25 数据处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 Tv RRas的生物学分析 |
| 4.2 引物设计 |
| 4.3 阴道毛滴虫RRas基因PCR扩增 |
| 4.4 PQE-80L载体质粒线性化结果 |
| 4.5 质粒阴阳性克隆鉴定 |
| 4.6 重组表达质粒PQE-80L/ Tv RRas双酶切鉴定 |
| 4.7 测序结果 |
| 4.8 重组蛋白的可溶性分析 |
| 4.9 重组蛋白的纯化 |
| 4.10 阴道毛滴虫RRas重组蛋白的Western-blot |
| 4.11 细胞实验 |
| 4.11.1 蛋白浓度测定标准曲线 |
| 4.11.2 CCK8实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 阴道毛滴虫RRas一步克隆表达的分析 |
| 5.2 阴道毛滴虫western-blot分析 |
| 5.3 细胞实验分析 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）鸽毛滴虫粘附蛋白AP65的克隆、鉴定及表面定位（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸽毛滴虫的病原学 |
| 1.1.1 病原体 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 发病机理 |
| 1.1.4 病理变化及临床症状 |
| 1.1.5 鸽毛滴虫病诊断与防治 |
| 1.2 滴虫粘附作用及粘附蛋白的研究 |
| 1.2.1 粘附作用 |
| 1.2.2 粘附蛋白 |
| 1.2.3 铁对粘附蛋白的调控 |
| 1.2.4 鸽毛滴虫粘附蛋白的研究进展 |
| 1.3 AP65的研究 |
| 1.3.1 AP65 |
| 1.3.2 AP65作用机制 |
| 1.4 本研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 鸽毛滴虫虫株及试验动物 |
| 2.1.2 实验菌株与载体 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 主要设备及仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 主要试剂配制 |
| 2.2.2 鸽毛滴虫的分离培养 |
| 2.2.3 基因组DNA和总RNA提取 |
| 2.2.4 鸽毛滴虫AP65保守区克隆 |
| 2.2.5 5’RACE PCR和 3’RACE PCR |
| 2.2.6 鸽毛滴虫AP65序列确定 |
| 2.2.7 鸽毛滴虫AP65序列分析 |
| 2.2.8 检测是否存在其他鸽毛滴虫AP65 |
| 2.2.9 重组质粒的构建 |
| 2.2.10 Tg AP65-2 重组蛋白的表达纯化 |
| 2.2.11 Tg AP65-2 重组蛋白免疫制备多克隆抗体 |
| 2.2.12 鸽毛滴虫自然表达的AP65的鉴定 |
| 2.2.13 鸽毛滴虫AP65蛋白的虫体表面定位 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸽毛滴虫AP65基因的克隆鉴定 |
| 3.1.1 保守区克隆 |
| 3.1.2 两端序列克隆 |
| 3.1.3 获得全长序列 |
| 3.2 鸽毛滴虫AP65序列分析 |
| 3.2.1 序列比对 |
| 3.2.2 预测分析 |
| 3.3 其他鸽毛滴虫AP65型的检测 |
| 3.4 多克隆抗体的制备 |
| 3.4.1 真核表达载体的构建 |
| 3.4.2 重组蛋白的表达鉴定 |
| 3.4.3 多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.5 虫体自然表达的AP65蛋白的鉴定 |
| 3.6 虫体表面定位 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 8 致谢 |
| 9 硕士期间论文发表情况 |
（8）现有液体培养法检测解脲脲原体效果的评价（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 2结果 |
| 3讨论 |
（9）应用噬菌体随机肽库筛选阴道毛滴虫特异性B细胞表位（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 英文缩略词 |
| 1 前言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 阴道毛滴虫的基本特性 |
| 1.3 阴道毛滴虫的致病机制 |
| 1.4 阴道毛滴虫病的诊断、治疗及预防 |
| 1.5 B细胞表位的研究方法 |
| 1.6 应用噬菌体随机肽库淘选抗原表位的研究现状 |
| 1.7 本研究的内容、目的和意义 |
| 2 材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 阴道毛滴虫临床分离株及实验动物 |
| 2.4 噬菌体肽库与宿主菌 |
| 2.5 培养基及主要试剂的配制 |
| 3 方法 |
| 3.1 阴道毛滴虫的培养 |
| 3.2 阴道毛滴虫的冻存及全虫抗原的制备 |
| 3.3 阴道毛滴虫兔免疫血清的制作、抗体滴度测定及纯化 |
| 3.4 阴道毛滴虫全虫抗原的免疫原性鉴定 |
| 3.5 随机7肽噬菌体展示库的亲和淘选 |
| 3.6 间接ELISA法检测淘选结果 |
| 3.7 阳性噬菌体克隆的测序 |
| 3.8 阳性噬菌体克隆的生物信息学分析 |
| 3.9 阳性噬菌体克隆小鼠免疫血清的制备 |
| 3.10 阳性噬菌体克隆免疫血清的免疫学鉴定 |
| 3.11 阳性噬菌体展示肽的虫体定位 |
| 3.12 阴道毛滴虫小鼠皮下感染模型的建立 |
| 3.13 阳性噬菌体表位肽的特异性及敏感性检测 |
| 3.14 阳性噬菌体表位肽免疫血清细胞因子检测 |
| 3.15 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 阴道毛滴虫生长曲线 |
| 4.2 间接ELISA法检测阴道毛滴虫兔免疫血清抗体滴度 |
| 4.3 阴道毛滴虫全虫抗原的免疫原性检测 |
| 4.4 亲和淘选结果 |
| 4.5 噬菌体克隆的ELISA鉴定 |
| 4.6 阳性噬菌体克隆展示肽的测序结果 |
| 4.7 阳性噬菌体克隆的生物信息学分析 |
| 4.8 阳性噬菌体克隆免疫血清的免疫学鉴定 |
| 4.9 阳性噬菌体克隆展示肽的虫体定位 |
| 4.10 阴道毛滴虫小鼠皮下感染模型的建立 |
| 4.11 阳性噬菌体表位肽的特异性及敏感性检测 |
| 4.12 阳性噬菌体表位肽免疫血清细胞因子检测结果 |
| 5 讨论 |
| 5.1 阴道毛滴虫的培养、冻存及复苏 |
| 5.2 全虫抗原和噬菌体的免疫方法 |
| 5.3 应用噬菌体随机肽库淘选B细胞抗原表位 |
| 5.4 阴道毛滴虫的动物感染模型 |
| 5.5 阳性噬菌体克隆的免疫学特性初探 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）男性尿道炎及其相关病原菌实验诊断进展（论文提纲范文）
| 一、GU的实验室诊断 |
| 1. 淋病奈瑟菌涂片检查 |
| 2. 淋病奈瑟菌分离培养与鉴定 |
| 3. 免疫学检测方法 |
| 二、衣原体性尿道炎的实验室诊断 |
| 三、支原体性尿道炎的实验室诊断 |
| 1. Uu的实验室诊断 |
| 2. Mh的实验室诊断 |
| 3. Mg的实验室诊断 |
| 四、毛滴虫性尿道炎的实验室诊断 |
| 1. 镜检与培养法 |
| 2. 免疫检测法 |
| 3. 分子生物学方法 |
| 五、男性念珠菌性尿道炎的实验室诊断 |
| 1. 涂片镜检 |
| 2. 分离培养与鉴定 |
| 六、小结 |
四、在固体培养基中培养阴道毛滴虫的研究（论文参考文献）
- [1]细菌性阴道炎优势菌筛选及灭活疫苗的制备[D]. 王晓平. 华北理工大学, 2020(02)
- [2]旋毛虫天冬氨酸蛋白酶生物学特性鉴定及其在虫体侵入宿主肠上皮细胞中作用的研究[D]. 徐佳. 郑州大学, 2020(02)
- [3]旋毛虫烯醇酶激活宿主纤溶系统促进幼虫侵入肠黏膜机制的研究[D]. 姜鹏. 郑州大学, 2020(02)
- [4]贾第虫病毒RNA依赖RNA聚合酶互作蛋白的筛选与鉴定[D]. 赵春艳. 吉林大学, 2019(11)
- [5]小鼠滴虫性阴道炎模型的建立[J]. 孟立正,田华洁,黄晓星,王一飞,徐小涛,刘莉. 世界临床药物, 2016(04)
- [6]阴道毛滴虫RRas基因克隆，表达及鉴定[D]. 王文柯. 郑州大学, 2016(02)
- [7]鸽毛滴虫粘附蛋白AP65的克隆、鉴定及表面定位[D]. 姜夕玥. 山东农业大学, 2015(04)
- [8]现有液体培养法检测解脲脲原体效果的评价[J]. 周良佳,连大帅,许锴,伊科拉木,普琼次仁,吴建茹,陈璐斯,杨天,谢彦昕,王蓓. 中国人兽共患病学报, 2015(01)
- [9]应用噬菌体随机肽库筛选阴道毛滴虫特异性B细胞表位[D]. 杨森. 郑州大学, 2014(12)
- [10]男性尿道炎及其相关病原菌实验诊断进展[J]. 朱均昊,章强强. 检验医学, 2010(02)