一、黄牛体细胞核移植初步研究（论文文献综述）
赵鑫[1]（2019）在《水牛体细胞继代克隆及卵胞质对供体细胞核重编程作用的初步研究》文中提出体细胞核移植（Somatic cell nuclear transfer,SCNT）技术在科研、动物育种、转基因动物生产、医疗等领域具有巨大的作用,但其极低的效率严重限制了这一技术的应用。体细胞继代克隆（Serial SCNT,SSCNT）技术可以通过重复利用受体胞质对供体细胞进行重编程,理论上将有望提高体细胞的重编程效率和克隆胚胎的发育率。因此,本研究对水牛SSCNT及其分子机制进行了初步的研究,具体结果如下:1.探讨了水牛SSCNT胚胎的体外发育情况及其表观遗传修饰状态。使用普通水牛耳部成纤维细胞BFF,由该BFF细胞系制备的转催乳素PRL的转基因细胞BFF-PRL以及使用BFF-PRL作为供体细胞进行核移植获得的克隆水牛耳部成纤维细胞（编号为8811）进行体细胞核移植,发现使用8811细胞作为供体所得的继代克隆胚胎（SSCNT胚胎）囊胚发育率显着高于BFF和BFF-PRL组,且SSCNT囊胚中5mC和组蛋白H3K9me3的水平出现显着下调（P<0.05）。另外,SSCNT囊胚中Dnmtl,HDAC1,HDA4C2的表达水平出现了显着的下调,多能基因Oct4,Sox2和Nanog的表达水平出现了显着的上升（P<0.05）。结果表明,由于DNA甲基化和组蛋白甲基化水平的下降,水牛SSCNT胚胎的发育潜能要高于普通的SCNT胚胎。2.通过比较BFF,BFF-PRL和8811三株供体细胞的生长特性和表观遗传修饰状态,对水牛SSCNT的分子机制进行了初步的探讨。结果发现:三株细胞在形态和生长能力方面无显着差异;而且三株细胞在5mC、组蛋白H3K18乙酰化、H3K9me2/me3表达、印记基因H19和IGF2启动子区的甲基化水平及表达水平上,均无显着差异（P>0.05）。该结果表明,供体细胞表观遗传修饰的起始状态,不是导致牛SSCNT胚胎的发育效率提升的主要原因,推测SSCNT胚胎发育效率的提升与供体细胞和卵胞质充分接触有关。3.探讨了卵胞质提取物处理供体细胞对水牛SCNT效果的影响。分别使用水牛GV期/MII期卵胞质提取物孵育BFF,结果发现GV期卵胞质孵育能显着降低BFF中5mC和H3K9me3的水平（P<0.05;）;且后续SCNT胚胎的囊胚率和囊胚细胞数显着提高（P<0.05）,同时SCNT囊胚中5mC和组蛋白H3K9me3的表达水平显着降低（P<0.05）;此外,SCNT囊胚中Oct4,Sox2和Nanog的表达水平经GV期卵胞质孵育供体后均出现了显着的提升（P<0.05）。该结果表明卵胞质充分孵育供体细胞,能够影响供体细胞的表观遗传修饰状态,提高后续克隆胚胎的发育效率,故推测是卵母细胞胞质中的某些母源因子在这一过程中发挥了关键的作用。4.作为一种关键的母源因子,KDMLA在调控组蛋白甲基化的过程中发挥了关键的作用。故对水牛GV期和MII期卵母细胞中KDM1A的表达模式进行了分析,发现KDM1A在GV期和MII期卵母细胞中均呈现为高表达状态,且GV期的表达水平要高于MII期（<0.05）。随后克隆获得了KDMLA基因编码区片段,并对其进行了生物信息学分析,最后还构建了水牛pcDNA3.1（+）-KDM1A真核表达载体,并对载体的表达效率进行了验证,确定其能够提高BFF中KDM1A的表达水平。5.通过过表达水牛SCNT胚胎中KDMLA的表达水平,探讨了母源因子KDM1A对水牛SCNT胚胎发育的影响。胚胎显微注射结果显示,显微注射KDM1A mRNA能够显着提高各阶段SCNT胚胎中KDM1A的表达水平（P<0.05）;过表达KDM1A,SCNT的8细胞率,桑椹胚率和囊胚率均显着提高（P<0.05）;另外,过表达KDM1A还显着降低了SCNT胚胎中H3K9me3的水平（P<0.05）,提高了 8细胞期SCNT胚胎中合子基因激活相关基因eIF-3a,TRC,SUPT4H1,SNAI1和ZSCAN5B,以及组蛋白甲基化酶相关基因KDM4B,KDM4D的表达水平（P<0.05）。该结果表明,过表达克隆胚胎中的母源因子KDM1A,能够降低组蛋白H3K9me3水平,激活合子基因,从而提高克隆胚胎的发育效率。上述研究结果表明:（1）水牛SSCNT胚胎的发育潜能要高于普通的SCNT胚胎,其原因可能是由于继代克隆供体细胞更易于被受体胞质重编程,而不是供体细胞表观遗传修饰的起始状态;（2）卵胞质孵育使供体细胞得以与卵母细胞胞质充分接触,能促进供体细胞的重编程,进而提高其随后SCNT胚胎的发育率;（3）卵胞质中的母源因子KDMLA在卵胞质中高表达,KDMLA通过发挥其去甲基化和激活合子基因的作用,使组蛋白H3K9me3的水平显着降低,合子基因激活相关基因的表达水平显着提升,进而提高了继代克隆胚胎的发育率。
许洁[2]（2019）在《Rapamycin对水牛成纤维细胞周期同期化以及核移植效率的影响》文中进行了进一步梳理体细胞核移植技术尽管在许多哺乳动物已获得了成功,但克隆效率偏低仍然制约着该技术的应用。供体细胞周期调控是提高核移植效率的重要途径之一,因供体和受体细胞的细胞周期协调与克隆效率关系非常密切。Rapamycin是一种mTOR（mammalian target of rapamycin,mTOR）蛋白特异性抑制剂,能阻断细胞由G1至S期的进程,将细胞周期静止在G1期。因此,本研究探讨了Rapamycin和血清饥饿对BEF细胞周期和体细胞核移植胚胎发育能力的影响,旨在寻找一种合适的供体细胞同期化方法,为提高水牛体细胞克隆效率提供理论和技术依据。首先,比较了不同浓度Rapamycin（0,0.5,1,2,4μM）处理对BEF细胞周期和活力的影响。结果发现,11μM Rapamycin处理组细胞的活力及G0/G1期的比例显着高于对照组和其他试验组（P<0.05）。比较Rapamycin处理BEF不同时间（0、48、72、96 h）对细胞周期的影响结果显示:1μM Rapamycin处理BEF 72 h和96 h细胞G0/G1期比例显着高于其他组（P<0.05）。其次,比较了Rapamycin和血清饥饿法处理对BEF细胞周期的影响。结果发现,Rapamycin同期化效率显着高于血清饥饿法（P<0.05）;qPCR结果显示,Rapamycin和血清饥饿处理均能显着下调CyclinD1、Cyclin基因的表达（P<0.05）,上调p27的表达水平（P<0.05）,但是Rapamycin组p27的表达水平显着高于血清饥饿组（P<0.05）;而且Rapamycin还显着下调了CDK2 的表达（P<0.05）;Western blot结果显示,Rapamycin和血清饥饿都增加了p27蛋白的表达水平（P<0.05）,降低了CyclinDl蛋白表达（P<0.05）,但是Rapamycin也显着抑制了mTOR蛋白的磷酸化水平（P<0.05）。接着,探究了Rapamycin和血清饥饿法处理对BEF生理特征的影响。Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡结果发现:血清饥饿组凋亡水平显着高于Rapamycin组（P<0.05）;qPCR结果显示,Rapamycin显着上调了抑凋亡基因Bcl-2的表达水平（P<0.05）,显着下调了促凋亡基因Casepase3、Casepase9的表达（P<0.05）,而血清饥饿组显着上调了促凋亡基因Bad的表达水平（P<0.05）;细胞活性氧检测发现,与Rapamycin处理组相比,血清饥饿处理显着增加了细胞ROS水平（P<0.05）;对BEF细胞代谢相关基因表达的检测发现,Rapamycin处理组显着上调了代谢相关基因ACADVL、Ass、HMGCL的表达水平（P<0.05）。此外,BEF经Rapamycin处理后细胞具有正常染色体倍数的细胞比例显着高于血清饥饿组（P<0.05）。最后,比较了Rapamycin和血清饥饿处理BEF对其核移植后胚胎发育能力的影响。结果发现,BEF经Rapamycin处理用作供体细胞进行核移植,核移植胚胎的8细胞率和囊胚率显着高于血清饥饿组和对照组（P<0.05）。以上结果表明,（1）适宜浓度（1μM）的Rapamycin处理水牛耳部成纤维细胞一定时间（72 h）能够提高细胞活力和G0/G1期的比例。（2）Rapamycin处理水牛耳部成纤维细胞后G0/G1期的比例显着高于血清饥饿法,这一作用可能是因为Rapamycin通过抑制mTOR磷酸化水平影响了细胞周期相关基因的表达所致。（3）Rapamycin处理水牛耳部成纤维细胞后凋亡水平显着低于血清饥饿组,推测可能和Rapamycin降低细胞ROS水平、调控体内代谢有关。（4）Rapamycin显着提高了核移植胚胎发育能力,这一作用可能与Rapamycin提高BEF G0/G1期比例和细胞活力有关。
康健[3]（2019）在《定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变转基因小鼠及肉牛的研制》文中研究表明肌肉生长抑素（mystatin,MSTN）作为骨骼肌生长发育的负调控因子,其表达能够显着抑制肌肉的生长发育。MSTN基因在哺乳动物进化过程中高度保守,其功能缺失会引起动物体内肌肉过度生长,导致动物出现双肌（double muscle,DBM）表型。自然突变的MSTN基因已经在牛、绵羊、山羊、马、猪、狗、兔等动物中发现,通过基因编辑技术同样在许多物种中实现了MSTN基因的人工诱变。在现代家畜育种中,利用人工核酸酶技术介导MSTN基因突变产生双肌表型,可以提高家畜胴体产肉率。然而,具有“双肌”表型的动物由于体内肌肉异常增加,导致脂肪含量相对减少,直接影响肉的品质。脂肪型脂肪酸结合蛋白（adipose fatty acid-binding protein,FABP4）作为一种脂质蛋白伴侣,对长链脂肪酸具有高亲和力,促进其在细胞内的溶解和转运。研究发现,FABP4基因参与动物体内脂肪沉积,与皮下脂肪含量以及肌内脂肪（intermuscular fat,IMF）含量密切相关。与国外优质肉牛品种相比,我国本土肉牛品种产肉量较低,牛肉品质相对较差。为了解决这一问题,本研究通过基因编辑技术将与IMF沉积有关的FABP4基因定点整合到鲁西黄牛MSTN基因座,同时引入G938A点突变,借助内源性启动子实现FABP4基因在骨骼肌组织中的特异性表达,在提高胴体产肉量的同时增加体内IMF含量。本研究主要内容和结果如下:1.在小鼠MSTN基因终止密码子TGA位点附近筛选得到1个CRISPR/Cas9系统介导的sgRNA打靶位点,并构建相应的同源重组打靶载体,通过原核显微注射技术获得F0代阳性转基因小鼠。对转基因小鼠进行扩繁,通过Junction PCR、Long-range PCR以及Southern blot检测,鉴定出可用于后续表型研究的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的杂合子与纯合子转基因小鼠模型。2.分别取同日龄野生型小鼠、杂合子以及纯合子转基因小鼠进行解剖,全身主要部位肌肉形态对比发现,纯合子转基因小鼠具有明显的双肌表型。对主要脏器以及骨骼肌进行组织学检测,结果显示纯合子转基因小鼠双肌表型是由于肌纤维横截面积增大引起的。对骨骼肌组织中FABP4蛋白与甘油三酯含量进行检测,结果显示FABP4蛋白含量显着增加促进肌肉中甘油三酯的沉积。3.在鲁西黄牛MSTN基因座找到一个能够融合表达外源插入基因的区域,借助CHOPCHOP和Cas-OFFinder在线分析软件对该区域内所有sgRNA靶点进行了潜在脱靶位点统计与分析,初步筛选得到脱靶位点相对较少的4个候选sgRNA靶点。构建相应的CRISPR/Cas9切割载体,并在鲁西黄牛胎儿成纤维细胞中进行切割活性检测与脱靶效应检测,最终确定sgRNA1靶点具有相对较高的切割效率,同时对应的20个潜在脱靶位点中均未发生脱靶效应。4.针对sgRNA1靶点,构建了定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变同源重组打靶载体,并与相应的CRISPR/Cas9切割载体共转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞,应用嘌呤霉素进行克隆细胞筛选。通过Junction PCR、Long-range PCR以及Southern blot检测鉴定出6株双等位基因打靶的阳性单克隆细胞。5.以上述阳性单克隆细胞作为核移植供体细胞,利用体细胞核移植技术获得转基因克隆胚胎,对随机挑选的转基因克隆胚胎进行PCR检测,排除供核细胞中混有非基因打靶细胞的可能。对发育形态良好的克隆囊胚进行胚胎移植,截至目前共计19头受体牛维持妊娠。综上所述,本研究通过构建定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变转基因小鼠模型,验证MSTN基因纯合点突变能够引起动物产生双肌表型,FABP4基因特异性表达能够增加骨骼肌组织中的甘油三酯含量。同时,应用CRISPR/Cas9系统进行定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变转基因肉牛的生产,为我国高产优质肉牛新品种的培育提供重要育种材料。
王森,孙永刚,李瑞哲,马志杰,陈生梅,徐惊涛[4]（2018）在《牦牛体细胞核移植电融合参数和重构胚胎培养方法的优化》文中提出为了探索牦牛体细胞核移植胚胎培养方法和体系,试验采用不同的脉冲电压和脉冲时间对牦牛重构胚胎进行融合,采用不同的培养方法对牦牛核移植重构胚胎进行培养,从而优化牦牛体细胞核移植胚胎的培养体系。结果表明:牦牛核移植重构胚胎采用16 V、20μs、2次脉冲融合率最高,为（80.8±3.8）%。采用mSOF培养液、G1/G2培养液、输卵管上皮细胞共培养三种培养体系对牦牛体细胞克隆胚胎的卵裂率影响差异不显着（P>0.05）,但是G1/G2培养液的囊胚率为（20.0±2.4）%,与输卵管上皮细胞共培养的囊胚率[（19.4±2.3）%]相比差异不显着（P>0.05）,显着高于mSOF培养液的囊胚率[（13.7±3.8）%]（P<0.05）。
陶林林[5]（2013）在《5-氮-2-脱氧胞苷和丁酸钠对水牛供体细胞生长、周期、凋亡及克隆胚胎发育的影响》文中认为体细胞核移植技术对于体外胚胎的生产具有重要的意义,但是体细胞核移植成功率非常低,影响了该技术的实际应用。目前认为体细胞核移植效率低的主要原因是供体细胞的不完全重编程。科学家们已经尝试使用DNA甲基化酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理核移植供体细胞或胚胎,从而提高表观遗传重编程的程度。本试验用DNA甲基化酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷（5-aza-dC）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠（Sodium butyrate, NaBu）处理水牛成纤维细胞,检测细胞形态、生长、周期和凋亡等,并移植到黄牛卵母细胞中,观察胚胎发育情况,从而筛选两种试剂处理供体细胞的最佳处理方式,得到如下结果与结论：1.不同浓度的NaBu对水牛成纤维细胞形态、生长、细胞周期和凋亡的影响用0、0.5、1.0、2.0、2.5和3.0mmol/L NaBu处理水牛成纤维细胞,检测细胞形态、生长、周期和凋亡,确定处理细胞的最佳浓度。结果显示：0.5和1.0mmol/L NaBu处理的细胞形态正常,2.0、2.5和3.0mmol/L NaBu处理的细胞变大变长,并出现大量死亡；随着NaBu浓度的升高,对细胞生长抑制作用增强,0.5mmol/L NaBu处理48h后的细胞抑制率与对照组无显着差异（2.75对0,P>0.05）,其他浓度的均有显着性差异（P<0.05）；0.5mmol/L和1.0mmol/L NaBu处理细胞的G0/G1期和S期细胞比例与对照组无显着性差异（P>0.05）,2.0、2.5、3.0mmol/L处理的G0/G1期和S期细胞比例有显着性差异（P<0.05）;0.5mmol/L和1.0mmol/LNaBu处理的早期凋亡与对照组无显着差异（P>0.05）,2.0、2.5、3.0mmol/L处理与对照组差异显着（P<0.05）；0.5mmol/L NaBu处理的晚期凋亡与对照组无显着差异（P>0.05）,其他组均与对照组有显着差异（P<0.05）。从结果可知：0.5mmol/L和1.0mmol/L NaBu对细胞形态、生长、周期和凋亡影响较小,适合作为处理供体细胞的浓度。2.5-aza-dC和NaBu联合处理对水牛成纤维细胞生长、周期和凋亡的影响根据本课题组前期的试验结果,选择0.01μmol/L5-aza-dC处理水牛成纤维细胞72h,1.0mmol/L NaBu处理48h和两种试剂联合处理,检测细胞生长、周期和凋亡。结果显示：联合处理比单独使用5-aza-dC、NaBu以及对照组对细胞抑制作用显着增强（P<0.05）;5-aza-dC对细胞周期无明显影响,NaBu和联合处理可使细胞显着阻滞于G0/G1期（P<0.05）；联合处理的正常细胞数比5-aza-dC和对照组处理均显着减少（P<0.05）,而与NaBu组无显着差异（P>0.05）,联合处理晚期凋亡比5-aza-dC、NaBu以及对照组显着增加（P<0.05）,各试验组早期凋亡无显着差异。以上结果说明了联合处理组能够显着影响细胞生长、周期和凋亡。3.5-aza-dC和NaBu处理供体细胞对水牛-黄牛异种核移植胚胎的影响用0.01μmol/L5-aza-dC处理水牛成纤维细胞72h,1.0mmol/L NaBu处理48h,和两种试剂联合处理的细胞进行水牛-黄牛异种核移植,并以未处理组及同种核移植作对照。结果显示：水牛-黄牛异种体细胞核移植胚胎的2-细胞,8-16-细胞及囊胚发育率均显着低于同种体细胞核移植胚胎（P<0.05）;1.Ommol/L NaBu处理的细胞作为供体细胞进行水牛-黄牛异种体细胞核移植,8-16-细胞和囊胚发育率均显着高于对照组（P<0.05）;5-aza-dC和NaBu联合处理供体细胞得到的水牛-黄牛异种核移植胚胎8-16-细胞发育率显着高于对照组（P<0.05）,囊胚率显着高于对照组和单独处理组（P<0.05）。以上结果说明了异种核移植胚胎发育率低于同种核移植胚胎；NaBu处理供体细胞能够显着提高克隆胚胎的体外发育；5-aza-dC和NaBu联合处理能够显着提高克隆胚胎的发育率。
杨月春[6]（2010）在《延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤的研究》文中提出延边黄牛作为我国五大地方良种牛之一,其肉质细嫩,营养丰富,具有优秀的肉用潜能和广阔的产品商业化发展前景,随着我国畜牧业的发展和吉林省“东黄西红”肉牛发展战略的实施,延边黄牛养殖业发展越来越快,扩大产业化规模和提高科技附加值已经成为当前延边黄牛肉用发展的一个必要途径。体细胞克隆技术作为一种新兴的科技手段,不仅能够作为胚胎干细胞技术、转基因技术和医学等科学研究的技术支撑,同时在畜牧业上可以用来生产大量具有相同基因型的家畜,在家畜育种、保种上具有深远的意义,但是目前为止的研究表明,该项技术存在效率低、生产的后代多有生理缺陷等情况,还不能够达到生产实际的需要。在体外受精、人工授精、胚胎移植等繁殖生物技术中,研究配子在体外生产或体外保存过程中所受的氧化损伤,在体细胞克隆技术中研究显微操作方法、融合激活方法、核质重组（核重编程）机制、DNA甲基化等方面已有大量报道,研究体细胞克隆后代生理缺陷的分子机制已经成为新的热点,但是关于体细胞克隆胚胎的氧化损伤研究尚未见报道。目的：（1）观察氧化剂过氧化氢（H2O2）对延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育的影响,探讨过氧化氢对其氧化损伤的作用；（2）观察抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）对延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育的影响,探讨谷胱甘肽对其氧化损伤的保护作用；（3）以孤雌激活胚胎为对照,检测延边黄牛体细胞克隆胚胎内部H2O2和超氧阴离子（O2·-）两种活性氧（ROS）的含量,探讨其在延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育不同阶段的变化规律；（4）以孤雌激活胚胎为对照,检测延边黄牛体细胞克隆胚胎不同发育阶段编码过氧化氢酶（CAT）、含锰的超氧化物酶（Mn-SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的mRNA表达水平,探讨其与氧化损伤程度之间的关系。方法与内容：（1）在体外培养液中添加外源性H2O2,观察延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育效率、发育速度以及氧化损伤带来的质量影响,确定H2O2影响其发育的临界浓度、影响最大的时间；（2）在体外培养液中添加外源性GSH,观察延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育效率,确定缓解氧化损伤所需添加的适宜浓度及适宜时间；（3）使用二氢乙锭和2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯分别对延边黄牛体细胞克隆胚胎内部的H2O2和O2·-进行染色,使用荧光显微镜观察照相,利用图像处理软件进行量化分析,测定体细胞克隆胚胎不同发育时期的ROS含量,探求体细胞克隆胚胎内部活性氧的变化规律；（4）使用特异引物,利用反转录聚合酶链式反应扩增延边黄牛体细胞克隆胚胎编码CAT、Mn-SOD和GPx的mRNA,并通过琼脂糖凝胶电泳检测其表达结果,同时使用凝胶图像分析软件进行半定量分析,确定其在延边黄牛体细胞克隆胚胎体外不同发育阶段的表达规律。结果：（1）添加0μMol/L、60μMol/L、80μMol/LH2O2时卵裂率显着高于100μMol/L和120μMol/L组（P<0.05）,所有添加H202的处理组囊胚发育率显着低于未添加的处理组（P<0.05）；0～24h添加H2O2的处理组卵裂率显着高于其它组（P<0.05）,48～72h组16细胞以上发育率显着低于其它处理组（P<0.05）；不同时期不添加H202对延边黄牛重组胚卵裂率没有显着影响（P>0.05）,但是不同时期不添加H2O2时所有处理组16细胞以上发育率显着低于对照组（所有时期不添加,P<0.05）；经过H2O2处理后的重组胚卵裂球表面粗糙,胞质不均匀,少且疏松,偶尔能见到极少或没有胞质的卵裂球,卵裂球与透明带之间的间隙较大,发育不规则,卵裂球大小不一,相差较大,存在大量细胞碎片。（2）添加外源性GSH时,1 mMol/L组卵裂率显着高于7 mMol/L组（P<0.05）,1 mMol/L和7 mMol/L组卵裂率与0 mMol/L和4 mMol/L组差异不显着（P＞0.05）,1 mMol/L组囊胚发育率显着高于0 mMol/L、4 mMol/L和7 mMol/L组（P<0.05）；不同时间添加GSH时,0～24 h组和24～48 h组卵裂率显着高于对照组、48～72 h组和72～96h组（P<0.05）,16细胞以上发育率与其它组差异不显着（P>0.05）,对照组16细胞以上发育率显着低于48～72 h组和72～96h组（P<0.05）。（3）2细胞期孤雌激活与体细胞克隆组间O2·-水平差异不显着（P>0.05）,4细胞期、8细胞期、16细胞期和囊胚期体细胞克隆组均显着高于孤雌激活组（P<0.05）,延边黄牛孤雌激活胚胎O2·-变化以2细胞期最高,4细胞期最低,8细胞期有所上升,但低于2细胞期水平,16细胞期下降,囊胚期又再升高。延边黄牛体细胞克隆胚胎O2·-变化以2细胞期最低,4细胞期急速上升,8细胞期降低,16细胞期开始上升,至囊胚期基本持平；各细胞期体细胞克隆胚胎H2O2水平均显着高于孤雌激活胚胎（P<0.05）,延边黄牛孤雌激活胚胎H2O2变化为2细胞期至囊胚期持续升高,延边黄牛体细胞克隆胚胎H2O2变化以2细胞期最低,4细胞期急速上升,8细胞期降低后至囊胚期持续上升。（4）卵母细胞时期编码CAT＞Mn-SOD和GPx的基因均无表达,2细胞时期体细胞克隆胚胎编码CAT的基因有表达,4细胞时期体细胞克隆胚胎编码CAT和GPx的基因有表达,孤雌激活胚胎编码CAT的基因有表达,8细胞时期和16细胞以上时期体细胞克隆和孤雌激活胚胎编码CAT、Mn-SOD和GPx的基因均有表达；延边黄牛核移植和孤雌激活胚胎编码CAT的基因表达丰度之间在2细胞期以上均存在显着差异（P<0.05）,延边黄牛核移植和孤雌激活胚胎编码Mn-SOD的基因表达丰度之间在8细胞期差异不显着（P>0.05）,16细胞期以上时期差异显着（P<0.05）,延边黄牛核移植和孤雌激活胚胎编码GPx的基因表达丰度之间在4细胞期差异显着（P<0.05）,8细胞期以上时期差异不显着（P<0.05）。结论：（1）H2O2对延边黄牛体细胞克隆胚胎具有氧化损伤及加快体外发育速度的作用,GSH对延边黄牛体细胞克隆胚胎具有抗氧化保护作用；（2）延边黄牛体细胞克隆胚胎所受的氧化应激致使其氧化损伤水平高于孤雌激活胚胎,其内部ROS变化较大的时期正处于染色体基因组开始激活的时期；（3）延边黄牛体细胞克隆胚胎编码Mn-SOD和GPx的mRNA随着染色体基因组的激活而表达,大量表达的时期晚于胚胎内部ROS大量产生的时期。
韩岩[7]（2010）在《氨基酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响》文中提出氨基酸是体外培养液的重要成分,目前应用的多种培养液中都含有必需／非必需氨酸,但是很少有针对单一氨基酸或联合添加几种氨基酸对胚胎发育影响的研究报道。本实验主要研究了培养液中添加谷氨酰胺、牛磺酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、精氨酸以及谷氨酰胺与牛磺酸联合添加对重组胚卵裂、8-16C发育及囊胚发育的影响,以期从中探寻氨基酸是否能够提高延边黄牛体细胞克隆效率。本次实验是在体外培养液中分别添加以上几种不同种类不同浓度的氨基酸,对延边黄牛体细胞克隆重组胚进行体外培养,然后观察重组胚的发育情况。实验得出的结果如下：1.在体外培养液中添加不同浓度的谷氨酰胺对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响的试验中,添加1.0 mmol/L谷氨酰胺组的重组胚的卵裂率、8-16C发育率均高于其他浓度,囊胚率显着高于其他浓度组（P<0.05）,所以确定1.0mmol/L是单独应用谷氨酰胺时最适合延边黄牛卵母细胞体细胞克隆重组胚发育的最佳浓度。2.在体外培养液中添加不同浓度的牛磺酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响的试验中,添加7mmol/L和14 mmol/L牛磺酸组的重组胚的卵裂率高于其它浓度组,8-16C发育率和囊胚发育率显着高于其它浓度组（P<0.05）,但7mmol/L组在重组胚的卵裂率、8-16C发育率、囊胚发育率上均高于14mmol/L组。所以确定7mmol/L是单独应用牛磺酸时最适合延边黄牛卵母细胞体细胞克隆重组胚发育的最佳浓度。3.在体外培养液中同时添加谷氨酰胺和牛磺酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响的试验中,仅有重组胚的卵裂率略高于单独添加组,而囊胚发育率上联合添加组显着低于单独应用组（P<0.05）。4.在体外培养液中添加不同浓度的谷氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育影响的试验中,各浓度组之间重组胚的卵裂率和8-16C发育率差异不显着,囊胚发育率上6.4mmol/L.组显着高于其它浓度组（P<0.05）,所以确定6.4mmol/L是单独应用谷氨酸时最适合延边黄牛卵母细胞体细胞克隆重组胚发育的最佳浓度。5.在体外培养液中添加不同浓度的精氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育影响的试验中,各浓度组之间重组胚的卵裂率和8-16C发育率差异不显着,囊胚发育率上0.061mmol/L浓度组显着高于对照组（P<0.05）,各实验组之间差异小显着,但是0.061mmol/L组的囊胚发育率高于其它实验组,所以确定0.061mmol/L是单独应用精氨酸时最适合延边黄牛卵母细胞体细胞克隆重组胚发育的最佳浓度。6.在体外培养液中添加不同浓度的甘氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育影响的试验中,各浓度组之间重组胚的卵裂率和8-16C发育率差异不显着,囊胚发育率上7mmol/L组显着高于对照组和最高浓度组（21mmol/L,P<0.05）,略高于14mmol/L浓度组,所以确定7mmol/L是单独应用甘氨酸时最适合延边黄牛卵母细胞体细胞克隆重组胚发育的最佳浓度。7.在体外培养液中添加不同浓度的丙氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育影响的试验中,0.586mmol/L浓度的丙氨酸可以促进重组胚的卵裂,显着高于对照组（P<0.05）,各浓度组之间的8-16C发育率上差异不显着,1.172 mmol/L浓度的丙氨酸能够促进囊胚的发育,显着高于对照组（P<0.05）,更适合延边黄牛体细胞克隆重组胚的体外培养。8.在体外培养液中添加不同浓度的脯氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育影响的试验中,各组的卵裂率、8-16C发育率、囊胚率之间差异不显着,但是0.143mmol/L浓度组较其它组更适合延边黄牛体细胞克隆重组胚的体外培养。
孙焕林[8]（2009）在《成纤维细胞对延边黄牛体细胞克隆效率的影响》文中研究表明本实验以组织块贴壁率,组织块发育率,组织块的细胞贴壁率为不同生长阶段的衡量标准。着重探讨了不同品种牛的组织块原代培养情况。并对比了原代生长效果对传代后核移植效率的影响。以及不同年龄段和不同部位的延边黄牛成纤维细胞培养情况,及传代后对核移植效率的影响。从而探索出影响体细胞核移植胚胎发育率的新途径-体细胞原代培养效果对核移植的影响。试验结果表明:1.通过半胰酶消化法,获得延边黄牛,黑白花牛,利木赞牛成纤维细胞系,观察其生长状况。在组织块贴壁率上为利木赞好于延边黄牛,延边黄牛好于黑白花。在组织块发育率上为利木赞好于延边黄牛,延边黄牛与黑白花差异不显着。在组织块的细胞贴壁率为利木赞好于延边黄牛,延边黄牛与黑白花差异不显着。2.将传至3～5代的各种牛的成纤维细胞用于供核。观察囊胚率为利木赞显着高于延边黄牛与黑白花。延边黄牛与黑白花差异不显着。3.分别建立延边黄牛胎牛,青年牛,成年牛成纤维细胞系。在组织块贴壁率上胎牛要显着高于青年牛和成年牛,后两者差异不显着。在组织块发育率和组织块的细胞贴壁率。胎牛都显着高于青年牛,青年牛显着高于成年牛。4.将传至3～5代的各年龄段的延边黄牛的成纤维细胞用于供核。观察囊胚率为胎牛高于青年牛,青年牛高于成年牛。5.分别建立延边黄牛成年牛耳部和腹部的细胞系。在组织块贴壁率,组织块发育率,组织块的细胞贴壁率上均为腹部显着高于耳部。6.将传至3～5代的耳部和腹部的延边黄牛的成纤维细胞用于供核,在囊胚发育率上腹部显着高于耳部。7.对比各表发现,无论是不同品种牛还是同种牛不同年龄段和不同部位之间都表现出组织块细胞原代生长效果越好则囊胚发育率越高的特性。
宋君博[9]（2009）在《细胞松弛素B和咖啡因对延边黄牛体细胞克隆效率的影响》文中研究指明延边黄牛作为我国五大地方良种牛之一,是不可多得的具有我国特色的肉牛品种,极具国际市场潜力,目前延边黄牛产业已经形成独具特色的区域经济优势。近年来它的保种选育工作要求越来越大的科技投入,为了加快其改良进程,提高选种选育效率,我们引入了体细胞克隆技术,通过该技术能在短时间内生产出大量品质均一、性能优良的个体,可以大大提高生产水平,加快延边黄牛遗传育种工作的进程。为了这项工作的顺利开展,对其技术路线中的关键环节—融合、激活作进一步的改进和完善,从而保障该技术在延边黄牛保种选育工作中的成功应用。本研究采用延边黄牛耳皮肤成纤维细胞作为供核细胞,MⅡ期去核卵母细胞作受体细胞,挤压法去核,卵周隙内注核,探讨不同的融合、激活液成分对延边黄牛体细胞克隆效率的影响,探寻适宜延边黄牛体细胞克隆的最适的融合、激活液。实验结果以融合率、卵裂率、8-16细胞发育率和囊胚发育率来评定。研究结果如下:1.融合液中添加7.5μg/mLCCB的融合率是最高的,（81.04%,p＜0.05）,显着高于对照组和5.0μg/mL组,与10.0μg/mL组差异不显着;7.5μg/mL组的卵裂率、8-16cell率和囊胚发育率显着高于其他三组（92.49%,45.03%,26.96%,p＜0.05）。结果表明,融合液中添加CCB的最佳浓度是7.5μg/mL。2.融合液中添加7.5 mM咖啡因的融合率（80.33%,p＜0.05）,显着高于对照组,与其他两组差异不显着;卵裂率和囊胚发育率显着高于对照组和2.5 mM组,与5.0 mM组均差异不显着（87.02%,22.70%,p＜0.05）。结果表明,融合液中添加咖啡因的最佳浓度是7.5mM。3.确定了融合液中CCB和咖啡因的最佳浓度后,将二者联合添加,我们得到:单独添加CCB组和单独添加咖啡因组的融合率、卵裂率、8-16cell率及囊胚发育率均显着高于联合添加组（83.06%和81.12%,89.04%和87.71%,41.25%和40.41%,24.14%和22.33%,p＜0.05）。结果表明,单独添加CCB或单独添加咖啡因都明显好于联合添加组。4.激活液中添加5.0μg/mLCCB的卵裂率（87.20%,p＜0.05）,显着高于对照组和7.5μg/mL组,与2.5μg/mL组差异不显着;5.0μg/mL组的8-16cell率和囊胚发育率显着高于显着高于其他三组（49.02%,28.16%,p＜0.05）。结果表明,激活液中添加CCB的最佳浓度是5.0μg/mL。5.激活液中添加5.0 mM咖啡因的卵裂率和8-16cell率是最高的（85.45%,42.22%,p＜0.05）;5.0 mM组的囊胚发育率（20.55%,p＜0.05）,显着高于2.5 mM组和7.5 mM组,与对照组差异不显着。结果表明,激活液中添加咖啡因的最佳浓度是5.0 mM。6.确定了激活液中CCB和咖啡因的最佳浓度后,将二者联合添加,我们得到:单独添加CCB组和联合添加组的卵裂率和囊胚发育率均显着高于对照组和单独添加咖啡因组（86.83%和88.03%,24.44%和26.92%,p＜0.05）。结果表明,激活液中单独添加CCB或联合添加CCB和咖啡因的效果最好。7.确定了融合、激活液各自的最佳添加方案后,进行相互组合,我们得到的结论是:融合液中添加CCB+激活液添加CCB的组合、融合液中添加咖啡因+激活液中添加CCB的组合以及融合液中添加CCB+激活液中联合添加CCB和咖啡因的组合方案均可应用到延边黄牛体细胞克隆胚发育的融合、激活体系中。
韦精卫,孟凡丽,韦英明,杨素芳,陆凤花,石德顺[10]（2008）在《利用体细胞核移植技术生产黄牛和水牛同种、异种转基因克隆囊胚》文中指出以含neo和GFP基因双标记的水牛、黄牛胎儿成纤维细胞进行牛转基因体细胞核移植,结果发现:阿菲迪霉素可有效将胎儿成纤维细胞同步于G0/G1期;以GFP阳性细胞进行核移植,其卵裂率、囊胚率与对照组间无显着差异（P>0.05）,所构建的重组胚,2-细胞阶段观察不到GFP的表达,4-细胞以后GFP的表达逐渐增强,在囊胚的内细胞团和滋养层细胞均可检测到GFP的表达,将黄牛同种转基因克隆囊胚进行移植,获得1例妊娠;黄牛卵母细胞一水牛供核细胞构建异种重组胚囊胚率显着高于黄牛供核细胞一水牛卵母细胞构建的异种重组胚（P<0.05）,并且异种核移植重组胚中可检测到GFP表达,GFP可作为异种核移植胚胎来源的一种新标记.
二、黄牛体细胞核移植初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、黄牛体细胞核移植初步研究（论文提纲范文）
（1）水牛体细胞继代克隆及卵胞质对供体细胞核重编程作用的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 体细胞核移植简介 |
| 2 体细胞核移植的影响因素 |
| 2.1 供体细胞 |
| 2.2 受体卵母细胞 |
| 2.3 重构胚的构建与激活 |
| 2.4 重构胚的培养 |
| 2.5 重构胎移植 |
| 3 表观遗传学修饰 |
| 3.1 DNA甲基化 |
| 3.2 组蛋白修饰 |
| 3.3 X染色体失活 |
| 3.4 基因组印记 |
| 3.5 RNA活动 |
| 3.6 其他表观遗传学修饰 |
| 4 提高体细胞核移植效率的方法 |
| 4.1 降低甲基化水平 |
| 4.2 调控组蛋白修饰 |
| 4.3 调控染色体失活 |
| 5 继代克隆简介 |
| 6 母源因子 |
| 6.1 母源因子简介 |
| 6.2 母源因子功能简介 |
| 7 体细胞核移植的意义和展望 |
| 7.1 科研 |
| 7.2 动物育种 |
| 7.3 转基因研究 |
| 7.4 濒危动物保护 |
| 7.5 医疗 |
| 8 本研究的目的和意义 |
| 第二章 水牛体细胞继代克隆胚胎发育及表观遗传修饰的初步研究 |
| 前百 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 仪器设备及试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验设计 |
| 1.5 数据统计与分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 水牛体细胞继代克隆胚胎发育效率的检测 |
| 2.2 水牛体细胞继代克隆囊胚DNA甲基化水平的检测 |
| 2.3 水牛体细胞继代克隆囊胚组蛋白乙酰化水平的检测 |
| 2.4 水牛体细胞继代克隆囊胚组蛋白甲基化水平的检测 |
| 2.5 水牛体细胞继代克隆囊胚中DNA甲基化、组蛋白乙酰化相关基因表达的检测 |
| 2.6 水牛体细胞继代克隆胚胎中多能基因表达的检测 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 小结 |
| 第三章 水牛供体细胞生理特性及表观遗传修饰检测 |
| 前言 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 仪器设备及试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验设计 |
| 1.5 数据统计与分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 三株细胞形态、生长特性的检测 |
| 2.2 三株供体细胞DNA甲基化水平的检测 |
| 2.3 三株细胞间组蛋白乙酰化水平的检测 |
| 2.4 三株细胞间组蛋白甲基化水平的检测 |
| 2.5 三株细胞间DNA甲基化/组蛋白乙酰化相关基因表达水平的检测 |
| 2.6 三株细胞间印记基因启动子区甲基化水平的检测 |
| 2.7 三株细胞间印记基因表达水平的检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 卵胞质提取物处理对水牛体细胞核移植的影响 |
| 前言 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 仪器设备及试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验设计 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 Streptolysin-O处理对供体细胞DNA完整性的影响 |
| 2.2 水牛卵胞质提取物孵育供体细胞对细胞DNA甲基化和组蛋白H3K9me3水平的影响 |
| 2.3 水牛卵胞质提取物孵育供体细胞对后续体细胞核移植效率的影响 |
| 2.4 水牛卵胞质提取物孵育供体细胞对后续体细胞核移植囊胚细胞数的影响 |
| 2.5 水牛卵胞质提取物孵育供体细胞对体细胞核移植囊胚DNA甲基化和组蛋白H3K9me3的影响 |
| 2.6 水牛卵胞质提取物孵育供体细胞对后续体细胞核移植囊胚多能基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 水牛KDM1A基因的表达,克隆分析及真核表达载体的构建 |
| 前言 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 仪器设备及试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验设计 |
| 1.5 数据统计与分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 KDM1A基因在水牛GV期/MII期卵母细胞中表达模式的研究 |
| 2.2 水牛KDM1A基因的克隆与鉴定 |
| 2.3 水牛KDM1A基因序列的生物信息学分析 |
| 2.4 水牛pcDNA3.1 (+)-KDMIA真核表达载体的构建 |
| 2.5 水牛pcDNA3.1 (+)-KDM1A真核表达载体表达效率的验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 过表达KDM1A对水牛体细胞核移植胚胎发育的影响 |
| 前言 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 仪器设备及试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验设计 |
| 1.5 数据统计与分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 KDM1A mRNA的体外转录 |
| 2.2 显微注射参数的摸索 |
| 2.3 显微注射KDM1A mRNA对水牛体细胞核移植胚胎发育效率的影响 |
| 2.4 显微注射KDM1A mRNA对水牛克隆胚胎中KDM1A表达水平的影响 |
| 2.5 显微注射KDM1A mRNA对水牛体细胞核移植囊胚组蛋白H3K9me3表达的影响 |
| 2.6 显微注射KDM1A mRNA对水牛体细胞核移植胚胎基因表达水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 水牛编码区测序序列 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（2）Rapamycin对水牛成纤维细胞周期同期化以及核移植效率的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 体细胞核移植技术的研究进展 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 体细胞核移植技术目前面临的问题 |
| 1.3 提高核移植效率的方法 |
| 2 供体细胞对核移植效果的影响 |
| 2.1 供体细胞来源与类型 |
| 2.2 供体细胞年龄 |
| 2.3 供体细胞的性别 |
| 2.4 供体细胞代数 |
| 2.5 供体细胞周期 |
| 3 供体细胞周期同期化研究进展 |
| 3.1 细胞周期 |
| 3.1.1 细胞周期素与周期蛋白依赖性蛋白激酶 |
| 3.1.2 CKI及其作用 |
| 3.2 常用的供体细胞同期化方法及存在的问题 |
| 3.2.1 血清饥饿法 |
| 3.2.2 接触抑制 |
| 3.2.3 药物抑制剂 |
| 3.2.4 温度 |
| 4 Rapamycin对细胞的影响 |
| 4.1 Rapamycin与mTOR |
| 4.2 Rapamycin对细胞的影响 |
| 4.2.1 Rapamycin与细胞周期有关 |
| 4.2.2 Rapamycin与细胞线粒体有关 |
| 4.2.3 Rapamycin与细胞代谢有关 |
| 4.2.4 Rapamycin与组蛋白乙酰化有关 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂及仪器设备 |
| 1.2.1 主要试剂及药品 |
| 1.2.3 主要仪器设备 |
| 1.3 qRT-PCR引物设计与合成 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 水牛BEF的分离培养、冷冻保存、复苏、传代 |
| 1.4.2 CCK-8法检测细胞活力 |
| 1.4.3 细胞周期检测 |
| 1.4.4 生长曲线绘制 |
| 1.4.5 Annexin V-FITC双染检测细胞凋亡 |
| 1.4.6 细胞活性氧水平检测 |
| 1.4.7 细胞核型分析 |
| 1.4.8 细胞总RNA的提取及反转录cDNA |
| 1.4.9 实时荧光定量PCR检测 |
| 1.4.10 Western blot |
| 1.4.11 核移植技术 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.5.1 Rapamycin处理浓度和处理时间的确定 |
| 1.5.2 比较Rapamycin和血清饥饿法对BEF周期的影响 |
| 1.5.3 比较Rapamycin和血清饥饿法对BEF生理特征的影响 |
| 1.5.4 比较Rapamycin和血清饥饿法对BEF细胞核型的影响 |
| 1.5.5 比较Rapamycin和血清饥饿法对体细胞核移植胚胎发育能力的影响 |
| 1.6 数据统计与分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 Rapamycin处理浓度和时间的确定 |
| 2.1.1 不同浓度的Rapamycin对BEF活力的影响 |
| 2.1.2 不同浓度的Rapamycin对BEF细胞周期的影响 |
| 2.1.3 Rapamycin处理不同时间对BEF细胞周期的影响 |
| 2.2 比较Rapamycin和血清饥饿法对BEF细胞周期的影响 |
| 2.2.1 Rapamycin和血清饥饿法对BEF增殖的影响 |
| 2.2.2 比较Rapamycin和血清饥饿法对BEF细胞周期的影响 |
| 2.2.3 Rapamycin和血清饥饿法对BFF细胞周期相关基因表达水平的影响 |
| 2.2.4 Rapamycin和血清饥饿法对BEF细胞周期相关蛋白表达水平的影响 |
| 2.3 比较Rapamycin和血清饥饿法对BEF生理特征的影响 |
| 2.3.1 Rapamycin和血清饥饿法对BEF凋亡的影响 |
| 2.3.2 Rapamycin和血清饥饿法对BEF凋亡相关基因表达水平的影响 |
| 2.3.3 Rapamycin和血清饥饿法对BEF ROS水平的影响 |
| 2.3.4 Rapamycin和血清饥饿法对BEF代谢相关基因mRNA表达的影响 |
| 2.4 比较Rapamycin和血清饥饿法对BEF核型的影响 |
| 2.5 比较Rapamycin和血清饥饿法对体细胞核移植胚胎发育的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词-中文对照表 |
| 致谢 |
| 硕士期间论文发表情况 |
（3）定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变转基因小鼠及肉牛的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 基因编辑技术研究进展 |
| 1.1 基因编辑原理 |
| 1.1.1 非同源末端连接修复机制 |
| 1.1.2 同源重组修复机制 |
| 1.2 应用于基因编辑的核酸酶技术 |
| 1.2.1 HE技术 |
| 1.2.2 ZFN技术 |
| 1.2.3 TALEN技术 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas9 技术 |
| 1.3 基因编辑技术在转基因家畜生产中的应用 |
| 1.3.1 在家畜抗病育种中的应用 |
| 1.3.2 在家畜品种改良中的应用 |
| 1.3.3 动物生物反应器的建立 |
| 1.3.4 改善动物福利 |
| 1.3.5 在生物医学上的应用 |
| 第二章 CRISPR/Cas9 系统的发展及应用 |
| 2.1 CRISPR/Cas系统的进化与分类 |
| 2.1.1 CRISPR/Cas系统的进化 |
| 2.1.2 CRISPR/Cas系统的分类 |
| 2.2 CRISPR/Cas系统的作用机制 |
| 2.2.1 适应性阶段 |
| 2.2.2 表达性阶段 |
| 2.2.3 干扰性阶段 |
| 2.3 降低CRISPR/Cas9 系统的脱靶效应 |
| 2.3.1 sgRNA的设计与筛选 |
| 2.3.2 全基因组水平的基因编辑脱靶检测技术 |
| 2.3.3 Cas9 蛋白变体的研发与应用 |
| 2.4 CRISPR/Cas9 系统的多元化应用 |
| 2.4.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因表达调控 |
| 2.4.2 CRISPR/Cas9 系统介导的表观遗传修饰改变 |
| 2.4.3 CRISPR/Cas9 系统介导的活细胞染色质成像 |
| 2.4.4 CRISPR/Cas9 系统应用于细胞谱系追踪 |
| 2.4.5 CRISPR/Cas9 系统应用于全基因组筛选 |
| 试验研究 |
| 第三章 定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变转基因小鼠模型建立 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 靶向小鼠MSTN基因终止密码子TGA的 sgRNA设计 |
| 3.2.2 小鼠定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变同源重组打靶载体的构建 |
| 3.2.3 F0 代阳性转基因小鼠的生产及鉴定 |
| 3.2.4 F1 代杂合子转基因小鼠的生产及鉴定 |
| 3.2.5 F2 代纯合子转基因小鼠的生产及鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 靶向小鼠MSTN基因终止密码子TGA的 sgRNA脱靶评估 |
| 3.3.2 小鼠定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变同源重组载体的酶切鉴定 |
| 3.3.3 F0 代阳性转基因小鼠鉴定结果 |
| 3.3.4 F1 代杂合子转基因小鼠鉴定结果 |
| 3.3.5 F2 代纯合子转基因小鼠鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突转基因小鼠表型鉴定 |
| 4.1 材料和试剂 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 转基因小鼠肌肉形态检测 |
| 4.2.2 转基因小鼠组织学检测 |
| 4.2.3 转基因小鼠骨骼肌组织中相关基因m RNA表达水平检测 |
| 4.2.4 转基因小鼠骨骼肌组织中FABP4 蛋白和TG含量检测 |
| 4.2.5 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 转基因小鼠肌肉形态检测 |
| 4.3.2 转基因小鼠组织学检测 |
| 4.3.3 转基因小鼠骨骼肌组织中相关基因m RNA表达水平检测 |
| 4.3.4 转基因小鼠骨骼肌组织中FABP4 蛋白和TG含量检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变转基因肉牛的研制 |
| 5.1 材料和试剂 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 鲁西黄牛MSTN基因CRISPR/Cas9 切割载体的构建与活性检测 |
| 5.2.2 鲁西黄牛定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变同源重组打靶载体的构建 |
| 5.2.3 鲁西黄牛定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变阳性克隆细胞的筛选 |
| 5.2.4 利用体细胞核移植技术生产转基因鲁西黄牛 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 鲁西黄牛MSTN基因CRISPR/Cas9 切割载体的构建与活性检测 |
| 5.3.2 鲁西黄牛定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变同源重组打靶载体的构建 |
| 5.3.3 鲁西黄牛定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变阳性克隆细胞的筛选 |
| 5.3.4 利用体细胞核移植技术生产转基因鲁西黄牛 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论 |
| 创新之处与进一步研究课题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）牦牛体细胞核移植电融合参数和重构胚胎培养方法的优化（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 试验样本 |
| 1.2 耗材与试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 供体细胞的制备 |
| 2.2 卵母细胞的采集与成熟 |
| 2.3 体细胞核移植和体外培养 |
| 2.4 重构胚胎的体外培养 |
| 2.5 试验设计 |
| 2.6 数据的统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同电融合参数对牦牛体细胞核移植胚胎融合率的影响 |
| 3.2 不同培养方法对牦牛体细胞核移植胚胎发育的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
（5）5-氮-2-脱氧胞苷和丁酸钠对水牛供体细胞生长、周期、凋亡及克隆胚胎发育的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.1 异种克隆研究进展 |
| 2 影响核移植效率的因素 |
| 2.1 供体细胞的选择 |
| 2.2 供体细胞的周期状态 |
| 2.3 供体细胞的细胞系 |
| 3 体细胞核移植表观遗传修饰研究进展 |
| 3.1 DNA甲基化 |
| 3.2 组蛋白乙酰化 |
| 3.3 X染色体失活 |
| 3.4 基因组印记 |
| 3.5 端粒和端粒酶 |
| 4 DNA甲基化与体细胞核移植 |
| 4.1 DNA甲基化酶抑制剂5-aza-dC |
| 5 组蛋白乙酰化与体细胞核移植 |
| 6 研究目的与意义 |
| 第二章 丁酸钠(NaBu)对供体细胞形态、生长、周期和凋亡的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 水牛、黄牛耳成纤维细胞的制备与纯化 |
| 1.2.2 丁酸钠(NaBu)对水牛成纤维细胞形态的检测 |
| 1.2.3 丁酸钠(NaBu)处理水牛成纤维细胞生长曲线的测定 |
| 1.2.4 丁酸钠(NaBu)对水牛成纤维细胞周期的测定 |
| 1.2.5 丁酸钠(NaBu)对水牛成纤维细胞凋亡的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 5-aza-dC和NaBu联合处理对供体细胞生长、周期、凋亡及克隆胚胎发育的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 试验试剂和药品 |
| 1.1.3 试验操作液 |
| 1.1.4 显微操作针的制备 |
| 1.2 试验方案与方法 |
| 1.2.1 试验方案 |
| 1.2.2 试验方法 |
| 1.3 试验数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 5-aza-dC和NaBu联合处理对水牛成纤维细胞生长的影响 |
| 2.2 5-aza-dC和NaBu联合处理对水牛成纤维细胞生长抑制率的影响 |
| 2.3 5-aza-dC和NaBu联合处理对水牛成纤维细胞周期的影响 |
| 2.4 5-aza-dC和NaBu联合处理对水牛成纤维细胞凋亡的影响 |
| 2.5 5-aza-dC和NaBu联合处理供体细胞对水牛-黄牛异种核移植胚胎发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 5-aza-dC和NaBu联合处理水牛成纤维细胞生长、细胞周期、细胞凋亡的影响 |
| 3.2 异种与同种体细胞核移植胚胎发育 |
| 3.3 NaBu对体细胞核移植胚胎发育的影响 |
| 3.4 5-aza-dC和NaBu联合处理供体细胞对核移植胚胎发育的影响 |
| 4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
（6）延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 外源性H_2O_2和GSH对延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 延边黄牛体细胞克隆和孤雌激活胚胎活性氧含量变化规律的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 延边黄牛体细胞克隆和孤雌激活胚胎编码抗氧化酶基因表达的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 附录 |
（7）氨基酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 哺乳动物体细胞克隆技术的研究现状 |
| 1.2 影响哺乳动物体细胞克隆效率因素 |
| 1.2.1 培养条件对体细胞克隆效率的影响 |
| 1.2.2 培养液成分对体细胞克隆效率的影响 |
| 1.3 哺乳动物体细胞核移植技术存在的问题及应用前景 |
| 1.3.1 哺乳动物体细胞核移植技术存在的问题 |
| 1.3.2 哺乳动物体细胞核移植技术应用前景 |
| 1.4 本实验研究的目的和意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验时间和地点 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 试验主要药品及仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 药品的配制 |
| 2.2.2 实验步骤 |
| 2.3 试验设计 |
| 2.4 统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 培养液中添加不同浓度谷氨酰胺对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 3.2 培养液中添加不同浓度牛磺酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 3.3 培养液中谷氨酰胺及牛磺酸联合添加对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 3.4 培养液中添加不同浓度谷氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 3.5 培养液中添加不同浓度精氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 3.6 培养液中添加不同浓度甘氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 3.7 培养液中添加不同浓度丙氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 3.8 培养液中添加不同浓度脯氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 谷氨酰胺对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 4.2 牛磺酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 4.3 谷氨酰胺与牛磺酸联合作用对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 4.4 谷氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 4.5 精氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 4.6 甘氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 4.7 脯氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 4.8 丙氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A.硕士期间发表的论文 |
（8）成纤维细胞对延边黄牛体细胞克隆效率的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 动物细胞培养发展简史及展望 |
| 1.2 细胞培养条件及方法 |
| 1.3 克隆技术发展简史及展望 |
| 1.4 核移植的影响因素 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果的判定 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 不同品种牛耳部成纤维细胞原代培养效果 |
| 3.2 不同品种牛耳部成纤维细胞核移植效果比较 |
| 3.3 不同年龄段的延边黄牛组织块原代培养情况 |
| 3.4 不同年龄段的延边黄牛核移植效果比较 |
| 3.5 延边黄牛不同部位成纤维细胞原代培养效果 |
| 3.6 延边黄牛不同部位成纤维细胞核移植效果比较 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 不同品种牛耳部成纤维细胞原代培养效果对核移植效果的影响 |
| 4.2 不同品种牛耳部成纤维细胞核移植效果比较 |
| 4.3 不同年龄段的延边黄牛组织块原代培养情况 |
| 4.4 不同年龄段的延边黄牛核移植效果比较 |
| 4.5 延边黄牛不同部位成纤维细胞原代培养效果 |
| 4.6 延边黄牛不同部位成纤维细胞核移植效果比较 |
| 4.7 原代培养效果与核移植效率的关系 |
| 第五章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（9）细胞松弛素B和咖啡因对延边黄牛体细胞克隆效率的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 哺乳动物体细胞克隆技术的研究概况 |
| 1.2 影响哺乳动物体细胞克隆效率的因素 |
| 1.3 哺乳动物体细胞核移植技术存在的问题及应用价值 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 仪器与材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验设计 |
| 2.4 统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 融合液中添加不同浓度的细胞松弛素B对延边黄牛体细胞克隆胚融合率及重组胚发育率的影响 |
| 3.2 融合液中添加不同浓度的咖啡因对延边黄牛体细胞克隆胚融合率和重组胚发育率的影响 |
| 3.3 融合液中联合添加与单独添加最佳浓度的细胞松弛素B和咖啡因对体细胞克隆胚融合率及重组胚发育率的影响 |
| 3.4 激活液中添加不同浓度的细胞松弛素B对延边黄牛体细胞克隆胚发育率的影响 |
| 3.5 激活液中添加不同浓度的咖啡因对延边黄牛体细胞克隆胚发育率的影响 |
| 3.6 激活液中联合添加与单独添加最佳浓度的细胞松弛素B和咖啡因对体细胞克隆胚发育率的影响 |
| 3.7 融合、激活液的最佳添加方案相互作用的效果对体细胞克隆胚发育率的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 融合液中添加不同浓度的细胞松弛素B和咖啡因对延边黄牛体细胞克隆胚融合率及重组胚发育率的影响 |
| 4.2 激活液中添加不同浓度的细胞松弛素B和咖啡因对延边黄牛体细胞克隆胚发育率的影响 |
| 4.3 融合、激活液的最佳添加方案相互作用的效果对延边黄牛体细胞克隆胚发育率的影响 |
| 第五章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录: 攻读学位期间发表论文目录 |
四、黄牛体细胞核移植初步研究（论文参考文献）
- [1]水牛体细胞继代克隆及卵胞质对供体细胞核重编程作用的初步研究[D]. 赵鑫. 广西大学, 2019(11)
- [2]Rapamycin对水牛成纤维细胞周期同期化以及核移植效率的影响[D]. 许洁. 广西大学, 2019(01)
- [3]定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变转基因小鼠及肉牛的研制[D]. 康健. 西北农林科技大学, 2019
- [4]牦牛体细胞核移植电融合参数和重构胚胎培养方法的优化[J]. 王森,孙永刚,李瑞哲,马志杰,陈生梅,徐惊涛. 黑龙江畜牧兽医, 2018(07)
- [5]5-氮-2-脱氧胞苷和丁酸钠对水牛供体细胞生长、周期、凋亡及克隆胚胎发育的影响[D]. 陶林林. 华中农业大学, 2013(02)
- [6]延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤的研究[D]. 杨月春. 延边大学, 2010(09)
- [7]氨基酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响[D]. 韩岩. 延边大学, 2010(10)
- [8]成纤维细胞对延边黄牛体细胞克隆效率的影响[D]. 孙焕林. 延边大学, 2009(S1)
- [9]细胞松弛素B和咖啡因对延边黄牛体细胞克隆效率的影响[D]. 宋君博. 延边大学, 2009(S1)
- [10]利用体细胞核移植技术生产黄牛和水牛同种、异种转基因克隆囊胚[J]. 韦精卫,孟凡丽,韦英明,杨素芳,陆凤花,石德顺. 自然科学进展, 2008(08)