一、肾小管上皮细胞增殖和肥大与细胞周期调节蛋白（论文文献综述）
庾雪鹰[1]（2021）在《复方仙草颗粒对早期糖尿病肾病患者肾小管间质损伤保护作用的研究》文中进行了进一步梳理目的:通过观察复方仙草颗粒对Ⅲ期糖尿病肾病（DKD）患者尿-β2微球蛋白（β2-MG）、尿胱抑素C（Cys C）、尿视黄醇结合蛋白（RBP）、尿N-乙酰β-D氨基葡萄糖苷酶（NAG）、尿微量白蛋白/尿肌酐（ACR）、24小时尿蛋白定量（24h-UTP）、血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、糖化血红蛋白（Hb Alc）等相关指标的影响,评价复方仙草颗粒对早期糖尿病肾病患者肾小管间质保护作用的有效性及安全性。方法:在广西中医药大学附属国际壮医医院和广西中医药大学附属瑞康医院肾内科门诊及住院部选取符合糖尿病肾病诊断标准且符合中医脾肾两虚、湿热瘀血证患者60名作为研究对象。随机分为治疗组和对照组,各30例,对照组采用西医常规治疗（降糖、控制血压、调脂等）,治疗组在对照组治疗的基础上加服复方仙草颗粒,两组共同疗程为12周。监测两组患者治疗前后相关指标变化:β2-MG、Cys C、RBP、NAG、ACR、24h-UTP、Scr、BUN、Hb Alc,对患者治疗前后的临床体征和症状进行观察,对两组治疗后的效果进行评价。结果:1、治疗后两组患者取得较好的疗效,治疗组89.29%优于对照组53.57%（P<0.05）,差异有统计学意义。2、中医证候积分比较:治疗组治疗前后比较神疲乏力、尿多浊沫症状改善明显,差异有统计学意义（P<0.01）;对照组治疗前后,差异有统计学意义（P<0.01）,两组治疗后比较,差异有统计学意义（P<0.01）。3、检测指标的比较:检测指标β2-MG、Cys C、RBP、NAG、ACR、24h-UTP、Scr、BUN、Hb Alc两组治疗前比较无统计学差异（P>0.05）;两组治疗后均较治疗前显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）,且治疗组较对照组下降更为明显（P<0.01）。结论:1.复方仙草颗粒对脾肾两虚,湿热瘀血证的DKD有明显的疗效。2.复方仙草颗粒能降低DKD患者β2-MG、Cys C、RBP、NAG、ACR、24h-UTP、Scr、BUN和Hb Alc的水平,减轻DKD患者肾小管间质损害,具有保护肾脏的作用。
许春梅[2]（2021）在《肾小管上皮细胞Bim蛋白介导管球交流致足细胞骨架损伤的机制研究》文中提出研究背景近年,全球罹患糖尿病（diabetes mellitus,DM）的人数激增,在我国,DM患者人数俨然跃居全球首位,广大患者的健康问题受到严峻挑战,生存质量受到严重侵害。糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是DM的主要慢性并发症,虽然许多大型临床研究,如DCCT和UKPDS等均显示,强化降糖、降压、调脂等治疗能显着减少尿蛋白,但DN发生发展的剩余风险仍高达50%-86%。目前,DN已成为中国住院患者罹患终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）的首位致病原因。指南推荐的DN治疗主要是抗肾素（renin）-血管紧张素（angiotensin）-醛固酮（aldosterone）系统（RAAS）治疗,但其获益有较大的局限性,减少ESRD的证据不足,ESRD不断增长的发病率提示我们DN存在的潜在的发病机制仍有待探索。因此当前,我们亟需进一步明确DN的新的发病机制及干预靶点,以期为DN患者提供更佳的治疗方式。国内外针对DN发病机制的研究一直是热点,当前针对DN源头病变理论存在争议。既往,专家们多认为,DN主要由肾小球病变所致,但之后,越来越多的证据表明,肾小管病变在DN的发生发展,尤其是早期病变过程中发挥关键作用。肾小管病变对早期肾功能的影响更为密切。通常,人体肾小球每天滤过约3.3g白蛋白,其中约97%由肾小管重吸收以至于仅3%的白蛋白最终随尿液排出。在参与白蛋白重吸收中起主要作用的为近端肾小管上皮细胞（proximal renal tubular epithelial cells,PTECs）,其可重吸收滤过白蛋白的71%。在DN的发病过程中,PTECs可先于肾小球发生损伤,即,肾小管重吸收功能异常先于肾小球滤过功能障碍。肾小球滤过膜是一种高度分化的血液滤过性屏障,在保持体内的水、电解质和酸碱平衡中发挥重要的作用。因而,肾小球损伤被视为DN蛋白尿发生和进展中的主要原因。足细胞（podocyte）是肾小球滤过膜的最后一道屏障,在DN中扮演重要角色,也是DN肾内平衡紊乱中最薄弱的环节之一。研究表明足细胞病变与DN蛋白尿发生密切相关。而我们前期通过构建DN大鼠模型,发现在早期DN大鼠的肾脏中存在明显凋亡的PTECs,与之形成鲜明对比的是,此时凋亡的肾小球细胞却极少出现,即早期DN中,凋亡的肾小管先于肾小球出现。Bim是Bcl-2蛋白家族成员,其是一种仅含有一个Bcl-2的同源性（BH3）结构域的促凋亡蛋白,在细胞死亡途径的激活中起重要作用。我们前期通过体外功能实验进一步明确了 Bim蛋白是介导PTECs早期凋亡的关键因子。当前绝大多数针对DN的机制研究都是立足于一个点,如:单纯针对足细胞、肾小管上皮细胞等单一细胞病变在DN中的作用,忽略了肾脏作为一个组织整体,细胞间信息交流在病变发生发展中同样具有重要作用。当前,细胞间交流作用促DN发生发展越来越受到广泛关注。肾单位中,肾小球和肾小管分别发挥滤过和重吸收的功能,而作为两者中最具代表性的两类细胞,肾小球足细胞与PTECs无疑分别是上述功能的有力执行者。目前,针对两者间相互作用机制的研究刚刚起步,二者相互作用介导DN发生的机制尚不明确,仍需进一步探索。足细胞骨架改变是造成DN早期足细胞病变的主要原因,同时也是诱发早期DN蛋白尿的重要因素。因此,阐明足细胞骨架病变的发病机制,延缓并阻止肾小球滤过屏障损伤,成为防治DN的重要环节。另有研究发现,不仅局限于介导凋亡作用,Bim还可诱导细胞因子分泌发挥促凋亡外的其他作用。那么,我们前期发现的促肾小管凋亡的Bim蛋白是否可通过调控某种因子诱导肾小球足细胞骨架损伤,进而致DN进展的作用未见报道。本部分研究以此为重点,拟探索肾小管Bim蛋白介导的管球交流致DN足细胞损伤的作用及分子机制。研究目的1.通过构建PTECs与足细胞体外共培养模型,明确高糖下PTECs致足细胞损伤作用,即管球交流作用的存在。2.明确高糖下PTECs介导足细胞骨架损伤的分子作用机制。3.通过构建体内DN小鼠模型,于体内探究肾小管Bim介导DN足细胞骨架损伤作用。研究方法1.最佳高糖浓度及处理时间筛选:设置不同糖浓度梯度及时间梯度处理人足细胞,检测足细胞骨架蛋白synaptopodin表达情况以确定最佳高糖浓度及高糖最佳处理时间。2.RT-PCR及Western blot:明确高糖处理PTECs 48 h后Bim mRNA及蛋白表达水平。3.下调Bim慢病毒转染PTECs构建稳转细胞株:（1）转染下调Bim慢病毒,构建稳定转染细胞株:1)慢病毒感染预实验,感染复数值（MOI）筛选及感染最佳时间确定:设置不同病毒感染复孔,向PTECs（人HK-2细胞株）转染慢病毒。当达到80%的转染效率时,观察细胞生存情况,以此为依据记录转染条件及MOI值以备正式实验所用。2)慢病毒感染正式实验:应用病毒感染预实验得到的感染条件进行正式实验,对细胞进行长达约72小时的感染后,将其置于荧光显微镜下观察荧光表达情况以明确感染效率。（2）嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株:设置不同浓度的嘌呤霉素进行药物浓度筛选。药物筛选周期为1周,观察慢病毒携带荧光强度,选取存活的具备抵抗能力的细胞进行进一步的传代培养,将一部分细胞冻存,另一部分用于验证蛋白干预情况及功能探索等。4.共培养模型构建:培养人足细胞及HK-2密度达到80-90%进行消化处理。之后向六孔板及Transwell小室加入正糖培养基,将两种细胞按5 ×104分别均匀种至上述器皿,继续正常培养。6小时待细胞完全贴壁后,应用40 mM的高糖培养基孵育,将种有HK-2的Transwell小室中用镊子夹取放到种有人足细胞的六孔板中,向CO2培养箱中置于共培养体系,细胞正常培养48小时后进行观察与处理。5.Western blot:对空白组、病毒干预组及阴性对照组HK-2中Bim蛋白表达进行检测,验证慢病毒转染后干预效果;检测足细胞骨架蛋白synaptopodin蛋白表达情况,明确与不同PTECs共培养后对足细胞中骨架蛋白表达的影响。6.免疫荧光检测足细胞骨架蛋白synaptopodin荧光阳染及骨架微丝排列情况:（1）免疫荧光检测足细胞骨架蛋白synaptopodin阳性表达:将不同处理组的足细胞行免疫荧光染色,应用免疫荧光显微镜检测足细胞爬片的荧光表达情况并采集图片。（2）罗丹明红标记鬼笔环肽染色细胞骨架排列情况检测:将不同处理组的足细胞行罗丹明红标记的鬼笔环肽染色,之后将爬片置于荧光显微镜下观察并采集图片。7.RT-PCR:对不同PTECs处理组中NFAT家族的不同亚型mRNA表达进行检测。8.免疫荧光检测不同PTECs处理组中NFAT2核转位情况。9.过表达质粒及小干扰RNA（siRNA）分别上调与下调PTECs中NFAT2表达,RT-PCR及Western blot检测干预效果:（1）向稳定下调Bim的HK-2细胞转染NFAT2质粒:将NFAT2质粒和LipofectamineTM 3000混合液转染至已稳定下调Bim的HK-2细胞中。（2）向 HK-2 细胞转染 NFAT2-siRNA:将 NFAT2-siRNA 和 LipofectamineTM 2000混合液转染至HK-2细胞中。（3）RT-PCR及Western blot:对经过不同处理的HK-2中的NFAT2 mRNA及蛋白表达水平进行检测。10.在调控PTECs中NFAT2表达后,再次构建共培养模型,Western blot检测不同处理组足细胞骨架蛋白表达情况;免疫荧光检测不同处理组足细胞骨架蛋白synaptopodin阳性表达及骨架微丝排列情况。11.小鼠饲养:将C57BL/6J雄性6-8周龄小鼠进行为期1周的适应性喂养,选取状态佳、体重相近的小鼠进行随机分组,分别为单侧肾脏切除组（UNX）、糖尿病肾病组（DN）及假手术组（Sham）进行后续处理与操作。12.小鼠DN模型构建:应用单侧肾切+小剂量链脲佐菌素（STZ）连续5天进行注射。13.体重、血糖、尿量、尿蛋白含量、血肌酐、尿素氮水平检测:为了对小鼠的体重及血糖值进行检测,分别于术前,STZ注射后3d,DM成模后第2,4,6,8,10,12周对小鼠尾尖进行采血。第二天通过代谢笼收集小鼠的全天尿液,全天小鼠饮食受限但不限制饮水,尿液收集结束后对小鼠尿量进行检测,并对小鼠尿蛋白水平应用考马斯亮蓝法进行检测;在第12周末,取小鼠心尖血,检测各组小鼠血肌酐、尿素氮水平。14.肾脏糖原染色（periodicacid-Schiff,PAS）:在试验第12周末处死小鼠,应用组织切片机将小鼠肾脏组织进行切割（厚度约3μm）,然后进行肾脏PAS染色,应用普通光学显微镜观察肾脏糖原沉积情况及病理学变化。15.免疫组化检测肾脏组织中Bim在各组小鼠中的定位及表达情况。16.Western blot检测肾脏组织中Bim及足细胞骨架蛋白synaptopodin蛋白表达水平。17.免疫荧光检测足细胞骨架蛋白synaptopodin在不同组小鼠中表达情况。18.统计学分析:所有样本重复3次以上进行统计学分析。所得数据均采用SPSS 22.0软件对其进行统计学处理分析。统计学意义的评估:两组间比较采用T检验,数据均以mean±S.E.M.表示;应用单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法对三组以上数据进行比较。P<0.05（双侧）被认为组间差异具有统计学意义。使用GraphPad Prism 5.0软件进绘制柱状图。研究结果1.40 mM高糖处理48 h显着诱导足细胞骨架蛋白synaptopodin表达下调及PTECs中Bim表达上调。（1）为了确定最佳高糖浓度及处理时间,对足细胞行不同高糖浓度及时间处理。Western blot结果显示:与正糖浓度5.5 mM相比,高糖浓度40 mM处理足细胞48小时显着诱导骨架蛋白synaptopodin表达减少（P<0.05）。（2）应用40 mM高糖处理PTECs,Western blot结果显示:与正糖5.5 mM组相比,40 mM高糖组PTECs中Bim蛋白表达明显增加（P<0.05）。2.Bim下调PTECs稳定转染细胞株构建成功。（1）应用Enhance液稀释的病毒滴度MOI为20时转染下调Bim慢病毒的效率最高,荧光表达强度最强。（2）继续应用病毒滴度MOI为20的慢病毒感染PTECs,并应用1 μg/ml嘌呤霉素筛选1周,应用RT-PCR及Western blot验证干预效率,结果示:与转染阴性对照病毒组相比,转染干预Bim病毒组PTECs中Bim mRNA及蛋白表达均明显下调（P<0.05）,证实Bim下调PTECs稳定转染细胞株构建成功,留作后续使用。3.体外共培养模型成功构建:共培养模式图显示不同处理组,包括与对照PTECs高糖共培养足细胞组,与转染下调Bim慢病毒的PTECs高糖共培养足细胞组,与转染对照慢病毒的PTECs高糖共培养足细胞组。4.高糖诱导PTECs中Bim上调促使足细胞骨架损伤、排列紊乱,与下调Bim的PTECs共培养后足细胞骨架损伤得到明显缓解。（1）免疫荧光示:与PTECs在高糖下共培养48小时,足细胞骨架排列发生紊乱,但干预PTECs的Bim后再与足细胞共培养48小时,足细胞骨架排列重新恢复极性。（2）免疫荧光示:与对照PTECs在高糖下共培养48小时后,足细胞骨架蛋白synaptopodin表达明显下调,但与干预Bim的PTECs共培养48小时后,足细胞骨架蛋白synaptopodin表达恢复上调。（3）Western blot检测不同共培养处理组足细胞中synaptopodin蛋白表达结果与前述synaptopodin荧光染色结果一致:与对照PTECs在高糖下共培养48小时后,足细胞骨架蛋白synaptopodin表达明显下调,但与干预Bim的PTECs共培养48小时后,足细胞骨架蛋白synaptopodin表达恢复上调（P<0.05）。5.进一步筛选PTECs中受Bim调控的诱导足细胞骨架损伤的下游分子,发现NFAT2表达及核转位受Bim调控。（1）应用RT-PCR筛选NFAT家族中受Bim调控的亚型,并用Western blot证实蛋白表达,研究结果示:PTECs中的NFAT2 mRNA及蛋白表达均受Bim调控。（2）由于NFAT家族是一类转录因子,主要通过发生核转位发挥基因调控功能。通过免疫荧光共聚焦显微镜检测在调控Bim后,PTECs中的NFAT2的核转位变化。结果示,在干预PTECs的Bim后,NFAT2核转位明显减少。6.RT-PCR及Western blot检测转染NFAT2-siRNA及过表达质粒分别下调与上调NFAT2后PTECs中NFAT2 mRNA及蛋白表达变化。结果示,与转染阴性对照小干扰RNA相比,转染NFAT2-siRNA后,PTECs中NFAT2 mRNA及蛋白表达明显下调（P<0.05）;与转染阴性对照质粒相比,转染NFAT2质粒后,PTECs中NFAT2 mRNA及蛋白表达明显上调（P<0.05）。7.高糖条件下PTECs中的Bim激活NFAT2介导足细胞骨架损伤。为了进一步明确PTECs中Bim调控NFAT2对足细胞骨架的影响,通过向PTECs转染干预NFAT2表达的siRNA,向稳定转染Lenti-Bim-shRNA的PTECs细胞株转染上调NFAT2表达的质粒,在此基础上与足细胞共培养,检测足细胞骨架蛋白synaptopodin表达及骨架微丝排列情况。（1）免疫荧光示:在干预PTECs中Bim的基础上重新上调NFAT2表达,足细胞微丝F-actin排列紊乱,骨架蛋白synaptopodin表达显着下调,提示高糖下PTECs中Bim上调NFAT2表达介导足细胞骨架损伤。（2）Western blot检测足细胞骨架蛋白synaptopodin表达,其结果与免疫荧光染色synaptopodin表达结果一致。8.小鼠外观、形态等基本情况:从实验开始到最终结束,UNX及Sham组小鼠精神可,状态佳,日常表现活跃,拥有光滑整齐且干净的体毛,对外界刺激能够做出快速且正确的反应。DN组小鼠待造模成功后总体状态偏差,日常表现萎靡不振,全身毛发暗黄枯燥,对外界事物无法做出及时且有效的反应。9.小鼠体重、血糖及尿量水平:与Sham及UNX组小鼠相比,DN组小鼠体重增加减缓,部分小鼠体重甚至减轻;随机血糖明显升高,无自发血糖恢复;日常饮水量与尿量明显增加。10.小鼠尿蛋白、肾重/体重比值及血肌酐、尿素氮变化:与Sham及UNX组小鼠相比,DN组小鼠尿蛋白、肾重/体重比值、血肌酐及尿素氮水平明显增加。11.肾脏糖原染色:UNX及Sham组小鼠肾小球结构清晰,肾小管结构正常,排列整齐。DN组小鼠肾脏肥大,系膜细胞轻度增生,糖原沉积明显增多,出现肾小管排列紊乱,基底膜增厚等DN肾脏损伤病理变化。12免疫组化结果显示:与UNX及Sham组小鼠相比,DN组小鼠肾脏近端肾小管中Bim阳性染色明显增多,Bim在肾小球中无阳染。13.Western blot结果显示:与UNX及Sham组小鼠相比,DN组小鼠肾脏组织中Bim蛋白表达明显上调（P<0.05）,肾小球足细胞骨架蛋白synaptopodin表达显着下调（P<0.05）。14.免疫荧光结果显示:与UNX及Sham组小鼠相比,DN组小鼠肾小球足细胞骨架蛋白synaptopodin荧光表达显着下调。研究结论1.通过构建体外共培养模型,明确PTECs与足细胞之间存在管球交流作用。2.管球交流作用的机制初探为:高糖下,肾小管中表达上调的Bim通过激活下游NFAT2诱导足细胞骨架排列紊乱,即Bim/NFAT2介导管球交流在DN发生中具有潜在调节作用。3.DN小鼠肾小管Bim蛋白表达上调,足细胞骨架蛋白表达降低参与介导DN蛋白尿发生。研究背景DN的发生机制包括多种因素,遗传基因及信号转导通路中的蛋白分子常作为重要影响因素参与介导DN关键基因表型的表达。然而,不断增加的DN发生率表明,仍需要更深入地了解其潜在的分子机制,以确定更佳的治疗方法。越来越多的证据表明,与DN发生发展相关的基因不仅受到经典信号通路的调控,还受到组蛋白染色质修饰、DNA甲基化和非编码RNA等表观遗传机制的调控。通过全表观基因组关联研究来鉴定DN表观遗传发生机理也可能为精准医学研究提供信息,对及时诊断及治疗以防止其发展为终末期肾病具有重要价值。我们前期研究发现在DN病程中,肾小管病变早于肾小球,并通过构建体外近端肾小管上皮细胞（PTECs）-足细胞共培养模型,发现肾小管Bim上调致足细胞骨架紊乱参与DN发生发展,即早期的肾小管病变可通过Bim蛋白进一步诱导足细胞损伤。但是当前,针对小管小球间相互作用机制的研究刚刚起步,二者相互作用介导DN的确切机制仍有待探索。并且在实际临床工作中发现,因DN起病隐匿,很多患者在就诊时往往错过了干预早期肾小管病变的时机,病变已蔓延至肾小球,因此阻止肾小球病变的进展成为研究的重点。为寻找DN管球交流后诱导足细胞病变的“元凶”,此部分拟针对足细胞病变的始动机制展开研究。长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lncRNA）是一种非编码RNA,其转录之后的RNA长度超过200个核苷酸,但不能编码任何蛋白质,是研究较多的一种非编码RNA。近来研究表明,lncRNA在生长、发育、衰老、死亡等多种生物学过程中起重要作用。许多证据表明,lncRNA具有独特的基因调控作用,影响着基因转录、剪接、mRNA稳定性、表观遗传调控、细胞周期控制、分化和免疫应答等多种生物学机制和过程。lncRNA也可作为miRNAs的宿主RNA,并作为具有独立结构域的模块分子,使其能够与DNA、RNA和/或蛋白特异性结合,从而影响基因表达。因此,lncRNA常作为重要转录调控因子,参与多种疾病的起病及进展。许多lncRNA表达在人类疾病中被异常调节,lncRNA介导疾病发生发展的作用逐步被揭示。近年来研究表明lncRNA在介导DN发生中也发挥着重要作用。lncRNAPVT1参与纤维化和DN发病;另一项研究发现有21种lncRNAs在两种肾纤维化模型中表达上调,而在Smad3敲除小鼠模型中表达下调,提示这些lncRNA可能受到TGFβ/Smad3信号通路的调节,从而参与介导肾脏炎症及肾脏间质纤维化的发生。2016年的一项研究发现,lncRNAMGC是miR-379簇中近40个miRNA的宿主lncRNA,可以促进早期DN小鼠模型中系膜细胞外基质（ECM）的积累和肥大。另外有研究显示:过表达lncRNACYP4B1-PS1-001抑制DN系膜细胞增殖及纤维化。虽然目前已有较多阐述lncRNA在DN发生发展作用的机制研究,但是这些研究均仅从一个角度进行探索,对于细胞间交流介导DN发生的lncRNA的作用尚未有研究深入报道。为实现DN早期治疗,明确管球交流致足细胞早期病变的始动机制,我们将与不同肾小管细胞共培养的足细胞进行mRNA及lncRNA高通量芯片检测,得到在管球交流之后足细胞中lncRNA及靶基因变化数据,并进行相关机制研究,为进一步完善丰富管球交流致足细胞骨架紊乱机制提供阐释作用。研究目的我们前期研究已证实:肾小管上皮细胞的Bim蛋白能介导肾小球足细胞骨架损伤及其机制,为了能在管球交流的更早环节阻断对足细胞的损伤,我们进行了如下探索。研究方法1.Sino human lncRNA array V3.0 高通量芯片检测本研究利用Sino human lncRNA array V3.0高通量芯片进行检测。检测范围包括 lncRNA 与 mRNA。2.RT-PCR检测lncRNA表达验证lncRNA表达水平是否与芯片结果一致。3.调控足细胞中lncRNANONHSAT179542.1表达,RT-PCR检测调控效果:（1）向足细胞转染下调lncRNANONHSAT179542.1的小干扰RNA及阴性对照小干扰RNA;（2）RT-PCR检测调控足细胞中 lncRNA NONHSAT179542.1 后 lncRNA NONHSAT1 79542.1 mRNA 表达情况。4.调控足细胞中MICAL2表达,RT-PCR检测调控效果:（1）向足细胞转染上调MICAL2的过表达质粒及阴性对照质粒（MICAL2-NC）;（2）RT-PCR检测调控足细胞中MICAL2后MICAL2 mRNA表达。5.免疫荧光检测不同共培养组足细胞骨架排列情况:（1）进一步构建体外共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中lncRNANONHSAT179542.1表达水平,观察足细胞骨架微丝排列情况。（2）构建体外共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中MICAL2表达水平,观察足细胞骨架微丝排列情况。6.免疫荧光检测不同共培养组足细胞骨架蛋白荧光表达情况:（1）构建体外共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中lncRNANONHSAT179542.1表达水平,观察足细胞骨架蛋白荧光表达情况。（2）构建体外共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中MICAL2表达水平,观察足细胞骨架蛋白荧光表达情况。7.KEGG富集分析及cis/trans靶基因预测:（1）KEGG富集与细胞骨架相关通路;（2）应用cis/trans靶基因预测lncRNANONHSAT179542.1下游靶基因。8.Western blot检测不同共培养组足细胞中蛋白表达变化:（1）检测不同共培养组足细胞中骨架蛋白synaptopodin蛋白表达情况:1)构建共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中lncRNA NONHSAT179542.1表达水平,观察足细胞骨架蛋白表达情况。2)构建共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中MICAL2表达水平,观察足细胞骨架蛋白表达情况。（2）检测不同共培养组足细胞中MICAL2蛋白表达情况:1)构建共培养模型,分别检测在与对照PTECs共培养及与敲除Bim的PTECs共培养的足细胞中MICAL2表达。2)构建共培养模型,分别检测在与敲除Bim的PTECs共培养的足细胞,在下调PTECs中Bim的基础上向足细胞转染下调lncRNA NONHSAT179542.1的siRNA,在下调PTECs中Bim的基础上向足细胞转染lncRNANONHSAT179542.1阴性对照小干扰后足细胞中MICAL2表达情况。3)构建共培养模型,分别检测与敲除Bim的PTECs共培养的足细胞,与敲除Bim的PTECs共培养的基础上向足细胞转染MICAL2过表达质粒,与敲除Bim的PTECs共培养的基础上向足细胞转染MICAL2阴性对照质粒后足细胞中MICAL2表达情况。9.免疫组化检测不同组小鼠肾脏组织中MICAL2定位表达情况。10.统计学分析:对所有样本进行重复操作至少3次以上。应用统计学常用软件SPSS 22.0对所得数据进行统计学处理分析。统计学意义的评估:两组间比较采用T检验,数据均以mean±S.E.M.表示;应用单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法对三组以上数据进行比较。组间差异统计学意义的设定为:P<0.05（双侧）。将所得数据输入GraphPad Prism 5.0软件中对柱状图进行绘制,予以直观展示。研究结果1.差异性lncRNAs筛选结果:（1）设置差异倍数（fold change,FC）1.5倍,P<0.05,将与对照PTECs高糖共培养的足细胞同与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞比较后,得到35个差异性表达的lncRNAs,其中17个lncRNAs在与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞中表达上调,18个lncRNAs在与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞中表达下调。我们选取前十位差异表达倍数最大的差异性表达lncRNAs。（2）将与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞vs.与转染阴性对照慢病毒的PTECs高糖共培养的足细胞比较后,得到38个差异性表达的lncRNAs,其中21个lncRNAs在与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞中表达上调,17个lncRNAs在与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞中表达下调。（3）由于与对照PTECs高糖共培养的足细胞与Lenti-Bim-shNC高糖共培养的足细胞二者产生的效应相似,故将二者分别同与Lenti-Bim-shRNA高糖共培养的足细胞比较,再取二者各自比较后的交集,共得到6个交集lncRNAs。将这6个交集lncRNAs同在与对照PTECs共培养vs.与Lenti-Bim-shRNA共培养比较后得到的前十个lncRNAs进行汇总,共得到14种lncRNAs进行后期验证处理。2.RT-PCR验证所挑选的14种lncRNAs表达水平是否与芯片检测结果一致:结果显示,lncRNANONHSAT179542.1,lncRNANONHSAT040129.2 及 lncRNA NONHSAT203700.1表达与芯片检测结果一致,三者均在与Lenti-Bim-shRNA高糖共培养的足细胞中表达上调,而其余11种lncRNA表达未见统计学差异。3.利用lncRNAs富集分析数据,我们选取29个与细胞骨架相关通路进行KEGG富集制图。联合lncRNA靶基因预测结果,选取与上述29个与细胞骨架相关通路相关的lncRNAs及靶基因进行制图,结果表明:lncRNA NONHSAT179542.1的26个靶基因所在通路与细胞骨架相关。结合RT-PCR验证结果,提示lncRNANONHSAT179542.1是介导共培养后足细胞骨架损伤的关键性 lncRNA。4.进一步调控足细胞中lncRNANONHSAT179542.1表达,明确其参与介导足细胞骨架损伤。（1）向与下调Bim的PTECs高糖共培养的足细胞转染干预lncRNA NONHSAT179542.1表达的siRNA及阴性对照小干扰siNC,RT-PCR检测干预效果。发现与阴性对照组相比,转染siRNA后成功下调足细胞中lncRNA NONHSAT179542.1 表达（P<0.05）。（2）Western blot结果表明:与Lenti-Bim-shRNA共培养组相比,Lenti-Bim-shRNA+转染干预 lncRNA NONHSAT179542.1-siRNA 共培养组足细胞骨架蛋白表达显着减少（P<0.05）。（3）在成功干预足细胞lncRNANONHSAT179542.1表达后,进一步进行体外共培养,免疫荧光染色微丝F-actin发现:与Lenti-Bim-shRNA共培养组相比,Lenti-Bim-shRNA+转染干预 lncRNA NONHSAT179542.1-siRNA 共培养组足细胞骨架再次出现排列紊乱,极性消失甚至发生融合。（4）同样,免疫荧光染色足细胞骨架蛋白synaptopodin得到与Western blot一致的结果。5.靶基因预测及功能验证示MICAL2为lncRNA NONHSAT179542.1潜在下游靶基因。（1）lncRNA NONHSAT179542.1 的 cis/trans 靶基因预测:将lncRNA NONHSAT179542.1进行cis/trans靶基因预测后绘制网络图,预测该lncRNA共有218个潜在下游靶基因。（2）结合mRNA芯片数据结果,发现218个靶基因中仅MICAL2在对照PTECs共培养足细胞与Lenti-Bim-shRNA共培养足细胞中差异性表达。进一步应用Western blot验证发现与对照PTECs共培养足细胞相比,MICAL2在与Lenti-Bim-shRNA共培养足细胞中表达显着降低（P<0.05）,与芯片结果趋势一致。（3）进一步调控足细胞中lncRNANONHSAT179542.1后检测MICAL2表达,Western blot结果表明干预肾小管中Bim表达,足细胞中lncRNA NONHSAT179542.1表达上调,MICAL2表达显着减少（P<0.05）;而在下调肾小管中Bim表达的基础上,继续下调足细胞中lncRNANONHSAT179542.1表达,MICAL2表达则恢复上调（P<0.05）。6.体外进一步调控足细胞中MICAL2表达,RT-PCR及Western blot检测调控效果。向与Lenti-Bim-shRNA高糖共培养的足细胞转染上调MICAL2表达质粒及阴性对照质粒,RT-PCR及Western blot检测调控效果。结果显示:与阴性对照质粒组相比,转染MICAL2过表达质粒后成功上调足细胞中MICAL2 mRNA与蛋白表达（P<0.05）。7.体外再次构建共培养模型,免疫荧光染色验证MICAL2参与肾小管Bim介导的足细胞骨架损伤。（1）免疫荧光染色骨架微丝排列结果显示:在干预肾小管Bim后上调足细胞MICAL2表达,足细胞骨架微丝排列紊乱。（2）免疫荧光染色骨架蛋白表达结果显示:在干预肾小管Bim后上调足细胞MICAL2表达,足细胞骨架蛋白表达显着下调,提示足细胞MICAL2参与介导肾小管Bim诱导的足细胞骨架功能障碍。8.Western blot验证MICAL2参与肾小管Bim介导的足细胞骨架蛋白表达异常。Western blot结果与免疫荧光染色骨架蛋白结果一致。表明:在与Lenti-Bim-shRNA共培养的基础上继续上调足细胞MICAL2表达,足细胞骨架蛋白表达再次减少（P<0.05）。9.免疫组化结果显示:与UNX及Sham组小鼠相比,DN组小鼠肾小球中MICAL2阳性染色显着增多。UNX与Sham组小鼠肾脏中MICAL2阳性染色情况无显着差异。研究结论1.LncRNANONHSAT179542.1是参与肾小管Bim诱导的足细胞骨架损伤的关键性 lncRNA。2.LncRNA NONHSAT179542.1通过调控下游因子MICAL2参与肾小管Bim诱导的足细胞骨架损伤作用。3.本研究从表观遗传学角度揭示管球交流介导早期足细胞骨架损伤作用,深入阐明了“管球交流”来源的lncRNANONHSAT179542.1介导早期足细胞损伤的致病机理,为从效应蛋白MICAL2入手抑制足细胞损伤的治疗奠定基础,为明确DN发生机制提供新视角与新发现。
李慧敏[3]（2021）在《STAT3调控的自噬在血管紧张素Ⅱ诱导的肾小管上皮细胞衰老过程中的作用及氯沙坦对其的影响》文中指出目的:人口老龄化是目前全球人口趋势,这给世界各国社会医疗、养老、劳动力、经济发展等方面带来诸多挑战,因此研究衰老导致的相关疾病具有十分重要意义。肾脏具有排泄代谢废物、维持水、电解质平衡的重要功能,其衰老对机体影响不容忽视。肾脏衰老包括随年龄增加导致的生理性衰老和由于一些疾病,如高血压、糖尿病等疾病导致的早老性衰老,它可增加慢性肾脏病（CKD）的发病率,给社会带来沉重的医疗负担。衰老在组织水平表现为DNA、蛋白质和脂质、细胞器损伤以及毒性修饰的聚集;而自噬正是一种涉及蛋白质和细胞器降解的细胞途径,它可维持细胞稳态,参与机体衰老、炎症、肿瘤、免疫等多种病理生理过程。STAT3作为JAK/STATs通路的重要成员,参与多种肾脏疾病的发生及自噬、衰老等过程。肾素-血管紧张素-醛固酮系统是维持肾脏正常生理功能的主要系统,其异常亦可导致多种肾脏疾病的发生,该系统的主要效应因子为血管紧张素II（Ang II）。STAT3参与调控的自噬在血管紧张素II诱导的肾小管上皮细胞衰老过程中的作用尚未阐明。因此本文着重于研究血管紧张素II诱导的肾小管上皮细胞衰老过程中STAT3通路、自噬参与的调控作用和机制,并观察应用血管紧张素II受体拮抗剂氯沙坦在改善肾小管上皮细胞衰老过程中的作用和机制,并在小鼠体内进行验证,以期为延缓肾脏衰老、慢性肾脏病防治提供策略。研究方法:1.建立血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小管上皮细胞衰老模型并观察自噬在其衰老过程中的变化及对衰老的影响。应用10-6mol/L浓度的Ang II作用于人HK-2细胞0h至72h,采用流式细胞术检测细胞周期、Western blot法检测衰老相关蛋白P21表达水平、衰老相关β-半乳糖苷酶染色（SAβ-gal）检测衰老细胞阳性率方法以建立人肾小管上皮细胞衰老模型。此后应用Ang II、3-MA作用于人HK-2细胞,并应用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3II、P62、衰老相关蛋白P21表达水平、电镜检测自噬体数量、LC3-GFP-m RFP自噬双标腺病毒转染及激光共聚焦显微镜观察自噬光斑数量、SAβ-gal检测衰老细胞阳性率,以观察Ang II诱导的人肾小管上皮细胞自噬的变化及对衰老的影响。2.调控STAT3通路并观察其在血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小管上皮细胞衰老过程中的作用及氯沙坦干预对人肾小管上皮细胞STAT3通路、自噬、衰老的影响。应用Ang II诱导人肾小管上皮细胞衰老,使用Western blot法检测STAT3/PI3KC3通路变化,并应用S3I-201药物阻断及si RNA-STAT3基因阻断STAT3并应用Western blot法观察p STAT3蛋白、PI3KC3蛋白、衰老相关蛋白P21、自噬相关蛋白LC3II、P62表达水平、电镜检测自噬体数量,LC3-GFP-m RFP自噬双标腺病毒转染观察自噬光斑数量、β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞阳性率等指标。在Ang II诱导人肾小管上皮细胞衰老过程中应用氯沙坦处理人HK-2细胞,并应用Western blot法观察p STAT3、P21、LC3II、P62表达水平、电镜检测自噬体数量,LC3-GFP-m RFP自噬双标腺病毒转染观察自噬光斑数量、SAβ-gal染色检测衰老细胞阳性率等方法观察氯沙坦对HK-2细胞STAT3通路、自噬、衰老的影响及作用。3.体内验证血管紧张素Ⅱ诱导小鼠肾脏衰老过程肾小管上皮细胞STAT3通路、自噬及衰老的变化及氯沙坦对其影响。18只雄性C57BL/6J小鼠适应性饲养1周后将小鼠随机分为3组,即:年轻对照组（小鼠不做任何处理,正常饲养4周）、Ang II组（输注Ang II:Alzet微渗透泵输注Ang II,以1000 ng/kg/min速率连续输注Ang II,共4周）、Ang II+氯沙坦组（输注Ang II+灌胃氯沙坦;Ang II通过Alzet微渗透泵以1000 ng/kg/min速率连续输注4周,开始输注2周后,开始给予氯沙坦以30 mg/kg/d给予小鼠连续灌胃2周）,每组均为6只。每周监测小鼠血压变化。第4周结束后收集小鼠血液、尿液标本并检测小鼠血尿素氮、血肌酐、24h尿蛋白、尿NAG变化,留取肾脏标本并采用Masson染色、SAβ-gal染色、免疫组化、Western blot法检测P21、LC3、p STAT3变化以观察小鼠肾脏STAT3通路、自噬、衰老变化。结果:1.血管紧张素Ⅱ诱导人肾小管上皮细胞衰老过程中自噬活性增强并介导其衰老。10-6mol/L浓度的Ang II作用于人HK-2细胞,CCK-8法结果显示Ang II 0-72h促进人HK-2细胞增殖,此后抑制细胞增殖;细胞周期检测发现Ang II作用于人HK-2细胞72h后超过80%的细胞进入G0-G1期,显着高于正常对照组;Western blot结果显示,与正常对照组相比,人HK-2细胞衰老相关蛋白P21表达水平呈时间依赖性增加,72h时P21蛋白表达水平显着高于正常对照组;SAβ-gal染色发现,与正常对照组相比,人HK-2细胞β-半乳糖苷酶染色细胞阳性率呈时间依赖性增加,48h、72h时与对照组相比均显着增加,72小时达最高值。应用10-6mol/L浓度的AngⅡ诱导人HK-2细胞衰老过程中,与正常对照组相比,Western blot结果显示自噬相关蛋白LC3II/LC3Ι比值呈时间依赖性增加、72h时与正常对照组相比显着增加,P62蛋白表达24h开始显着减少、72h达最低;电镜检测显示在72h时HK-2细胞自噬体数量明显增加;LC3-GFP-m RFP自噬双标腺病毒转染显示在72h时HK-2细胞LC3荧光点数量显着增多。加入3-MA抑制人HK-2细胞自噬后,与Ang II组相比（72h）,Ang II+3-MA组Western blot结果显示LC3II蛋白表达明显下降,P62蛋白表达明显增多,P21蛋白表达明显下降,电镜检测自噬体数量明显减少,LC3-GFP-m RFP自噬双标腺病毒转染LC3荧光点数量显着减少,SAβ-gal染色细胞阳性率显着减少。2.血管紧张素Ⅱ诱导人肾小管上皮细胞衰老过程中STAT3/PI3KC3通路激活,药物抑制和基因沉默STAT3表达可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小管上皮细胞自噬激活,减轻细胞衰老应用10-6mol/L浓度Ang II作用于人HK-2细胞,Western blot结果显示p STAT3蛋白在第24h开始呈时间依赖性表达增加,72h时p STAT3蛋白表达与正常对照组相比显着增加;随着p STAT3的激活,PI3KC3蛋白在48h开始表达显着增加,72h时表达显着高于正常对照组。提示血管紧张素II诱导人肾小管上皮细胞衰老过程中STAT3/PI3KC3通路激活。在10-6mol/LAng II作用的人HK-2细胞中加入S3I-201、si RNA-STAT3、氯沙坦后,与Ang II组（72h）相比,Ang II+S3I-201组、Ang II+si RNA-STAT3组、Ang II+氯沙坦组Western blot结果显示p STAT3蛋白表达被显着抑制、LC3II蛋白表达明显下降、P62蛋白表达明显增加、P21蛋白表达明显下降,电镜检测发现自噬体数量均显着减少,LC3-GFP-m RFP自噬双标腺病毒转染LC3荧光点数量均显着减少,SAβ-gal染色阳性率均显着减低。3.氯沙坦可抑制血管紧张素Ⅱ诱导小鼠肾脏衰老过程中STAT3激活、自噬激活并延缓小鼠肾小管上皮细胞衰老Ang II诱导小鼠肾脏衰老过程中,随着小鼠周龄的增加,与年轻对照组相比,Ang II组小鼠收缩压及舒张压均逐渐增高,第4周龄时Ang II组小鼠收缩压、舒张压均显着高于年轻对照组,血尿素氮、血肌酐、24h尿蛋白、尿NAG均显着高于年轻对照组,Masson染色显示肾小管间质纤维化程度明显加重,β-半乳糖苷酶染色阳性率显着增加,免疫组化显示肾小管上皮细胞P21表达水平显着升高,p STAT3、LC3表达水平亦显着高于年轻对照组,Western blot结果显示肾小管上皮细胞P21蛋白表达水平显着升高,p STAT3、LC3蛋白表达水平亦显着高于年轻对照组。而应用氯沙坦后,在第4周龄时,与Ang II组相比,Ang II+氯沙坦组小鼠收缩压、血尿素氮、24h尿蛋白、尿NAG均显着下降,但舒张压、血肌酐下降无统计学差异,Masson染色显示肾小管间质纤维化程度明显减轻,SAβ-gal染色阳性率显着下降,免疫组化显示肾小管上皮细胞P21表达水平显着减低、p STAT3、LC3表达水平显着下降,Western blot结果显示肾小管上皮细胞P21蛋白表达水平显着下降,p STAT3、LC3蛋白表达水平显着下降。结论:1、Ang II可通过促进自噬的方式诱导人肾小管上皮细胞衰老,使用3-MA抑制自噬、可减轻Ang II诱导的人肾小管上皮细胞衰老。2、Ang II诱导人肾小管上皮细胞衰老过程中STAT3/PI3KC3通路激活,S3I-201、si RNA-STAT3、氯沙坦均可通过抑制STAT3的激活,进而抑制Ang II诱导的人肾小管上皮细胞自噬并减轻细胞衰老。3、STAT3通路及自噬激活参与了Ang II诱导的小鼠肾小管上皮细胞衰老过程,氯沙坦可抑制此过程中STAT3的激活、抑制自噬过度激活并延缓小鼠肾小管上皮细胞衰老,为第一部分和第二部分论文提供了体内验证支持。
郭晓媛[4]（2021）在《滋肾丸干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞焦亡作用及机制研究》文中进行了进一步梳理[目的]探究滋肾丸（ZiShenWan,ZSW）对糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）肾小管上皮细胞焦亡的干预作用及机制,通过网络药理学研究分析ZSW治疗DN的靶点及通路,为ZSW治疗DN提供科学依据。[方法]1.动物实验:采取随机对照方法,将雄性6周龄db/db小鼠分为模型组、阳性对照组、ZSW高剂量组、ZSW中剂量组、ZSW低剂量组（n=10）;非糖尿病db/m小鼠为正常对照组（n=10）。适应性喂养2周后,ZSW各剂量组给予ZSW乙醇提取物灌胃（高剂量:6.0g/kg;中剂量:3.0g/kg;低剂量:1.5 g/kg）;阳性对照组给予达格列净灌胃（1.0mg/kg）;模型组和正常对照组同时给予等体积去离子水灌胃。每天灌胃1次,持续12周。每2周检测体重、尾静脉FBG;每4周检测尿液ACR、NAG酶、NGAL和CysC;给药12周后摘眼球取血,称量右肾脏重量,固定或冻存肾组织。血清检测HbA1c、BUN和CRE。肾组织经HE染色、PAS染色、Masson染色后光镜观察组织病理学改变,透射电镜观察超微结构改变,进行病理半定量评分;免疫组化染色观察分析肾小管上皮细胞上皮—间充质转化（EMT）标志物α-SMA和E-cadherin的表达强度;TUNEL染色观察分析肾小管上皮细胞核的损伤水平;Western blot及RT-qPCR分别检测NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1以及焦亡相关炎症因子IL-1β、cleaved IL-1β和IL-18的蛋白及mRNA表达水平。2.细胞实验:正常人近端肾小管上皮细胞（HK-2）进行复苏、传代及培养。通过MTT法检测细胞增殖活力筛选细胞培养条件及药物干预剂量,以高渗葡萄糖（45μmol/L）培养HK-2细胞48 h诱导焦亡及EMT,分为高糖组、ZSW低剂量组、ZWS中剂量组、ZSW高剂量组、阳性对照组。ZSW各剂量组给予ZSW乙醇提取物干预（高剂量:15μg/ml;中剂量:7.5μg/ml;低剂量:3.75μg/ml）;阳性对照组给予达格列净干预（0.1μmol/L）。另设空白组为正常对照、甘露醇组为高渗对照。光镜观察细胞形态改变;Transwell试验检测细胞迁移能力;TUNEL染色评估细胞核的损伤、LDH试验评估细胞膜的损伤、Annexin V/PI双染检测细胞焦亡水平;ELISA检测细胞上清液IL-1β、IL-18水平;Western blot 及 RT-qPCR 分别检测细胞 NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、cleaved IL-1 β、IL-18的蛋白及mRNA表达水平。3.网络药理学:通过检索数据库筛选ZSW的药物活性成分和DN的疾病靶点,获得ZSW治疗DN的作用靶点;应用Cytoscape软件构建ZSW治疗DN的“药物—成分—靶点”网络,应用STRING数据库构建ZSW治疗DN的关键靶点的PPI网络,筛选ZSW治疗DN的核心关键靶点;应用Cytoscape软件和DAVID数据库进行基因功能和通路分析。[结果]1.动物实验:（1）药效学:与正常对照组相比,模型组FBG、HbAlc、BUN、血CRE及尿ACR、NAG酶、NGAL、CysC显着升高（P<0.01）。经ZSW干预后上述指标均显着降低（P<0.01）。（2）肾组织病理学:模型组肾小球出现体积增大、基底膜不均匀增厚、系膜基质增生;肾小管出现上皮细胞空泡变性、炎性细胞浸润;胶原纤维染色面积、基底膜厚度、肾小管损伤指数显着升高（P<0.01）。ZSW不同程度减轻上述病理改变,显着降低病理半定量评分（P<0.01）。（3）肾小管上皮细胞EMT:与正常对照组相比,模型组肾小管上皮细胞α-SMA表达强度、肾组织α-SMA蛋白及mRNA表达显着升高;肾小管上皮细胞E-cadherin表达强度、肾组织E-cadherin蛋白及mRNA表达显着降低（P<0.01）。ZSW显着改变肾小管上皮细胞α-SMA和E-cadherin表达强度,不同程度降低肾组织α-SMA蛋白及mRNA表达、升高肾组织E-cadherin的蛋白及mRNA表达（P<0.05或P<0.01）。（4）肾小管上皮细胞焦亡:与正常对照组相比,模型组肾小管上皮细胞核碎裂增多,TUNEL染色阳性率显着升高,肾组织IL-1β、cleaved IL-1β和IL-18蛋白及mRNA表达显着升高（P<0.01）。ZSW减轻肾小管上皮细胞核碎裂,显着降低细胞TUNEL染色阳性率,显着降低肾组织IL-1β、cleaved IL-1β和IL-18蛋白及mRNA表达（P<0.01）。（5）肾组织NLRP3炎症小体活化:与正常对照组相比,模型组肾组织NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白及mRNA表达显着升高（P<0.01）,ZSW不同程度降低上述指标的蛋白表达（P<0.05或P<0.01）,显着降低NLRP3、ASC mRNA表达（P<0.01）,高剂量ZSW显着降低Caspase-1 mRNA表达（P<0.01）。2.细胞实验:（1）EMT:高糖培养使HK-2细胞形态发生间质细胞样改变,迁移能力显着增强,α-SMA蛋白及mRNA表达显着升高,E-cadherin蛋白及mRNA表达显着降低（P<0.01）;ZSW抑制高糖诱导的HK-2细胞的间质样改变,显着降低细胞迁移能力,显着降低α-SMA蛋白及mRNA表达,不同程度升高E-cadherin蛋白及mRNA表达（P<0.05或P<0.01）。（2）焦亡:高糖培养使HK-2细胞的细胞核及细胞膜损伤加重,焦亡水平升高,IL-1β、IL-18释放增加,IL-1β、cleaved IL-1β和IL-18蛋白及mRNA表达显着升高（P<0.01）;ZSW明显减轻细胞核及细胞膜损伤,显着降低焦亡水平,显着减少IL-1β、IL-18释放以及 IL-1β、cleaved IL-1β 和 IL-18 蛋白及 mRNA 表达（P<0.01）。（3）NLRP3炎症小体活化:高糖培养使HK-2细胞NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白及mRNA表达显着升高（P<0.01）;ZSW不同程度降低上述指标的蛋白及mRNA表达（P<0.05 或 P<0.01）。3.网络药理学:经筛选获得ZSW的56个有效活性成分,与数据库中DN的疾病靶点映射获得166个ZSW治疗DN的靶点,与51个ZSW的有效活性成分共同构建“药物—成分—靶点”网络,通过PPI网络筛选获得154个关键核心靶点,诸多靶点涉及炎症反应相关,主要富集在钙通道复合体、膜区、突触和细胞质等细胞组分;G蛋白偶联受体活性、神经递质结合等分子功能;脂多糖介导的信号通路、氧化还原、突触传递等生物学过程;包含NOD样受体（NLR）信号通路在内的炎症反应、晚期糖基化终末产物、细胞增殖分化、内分泌抵抗、神经组织传导等相关信号通路。[结论]1.ZSW有效降低db/db小鼠血糖,减少尿蛋白,改善肾小管早期损伤指标及肾功能,减轻肾组织病理损伤,抑制肾小管上皮EMT及焦亡,可能是通过抑制NLRP3炎症小体活化实现的。2.ZSW有效抑制高糖诱导的HK-2细胞EMT及焦亡,可能是通过抑制NLRP3炎症小体活化实现的。3.ZSW中的多种有效成分多靶点、多通路治疗DN,干预炎症反应是ZSW治疗DN的重要作用机制。
倪岳晖[5]（2021）在《IgA肾病免疫抑制治疗的长期随访研究及YAP对足细胞的保护作用》文中提出研究背景及目的:IgA肾病（IgA nephropathy,IgAN）是亚洲目前最常见的原发性肾小球疾病之一。IgAN具有异质性、进展性等特点,其临床表现多样,确诊IgA肾病的患者,20%-40%的患者会在20年内进展至终末期肾病。降低持续性蛋白尿是IgA肾病治疗的主要目标之一,目前治疗方式主要包括ACEI/ARB类足量使用和免疫抑制治疗。目前,IgA肾病患者免疫抑制治疗是否获益仍存在争议,指南中对免疫抑制治疗的推荐级别整体较低,特别是对那些肾病理损伤较严重和（或）肾功能下降的患者。与目前现有大规模IgAN队列相比,我院IgAN队列具有病情较重、免疫抑制治疗较积极且随访时间较长等特点。本研究通过回顾性分析CKD 3-4期IgAN且随访超过5年的患者,探究免疫抑制治疗对病情较重的患者治疗的有效性,并了解哪些患者接受免疫抑制治疗可能获益,以期为IgAN患者提供新的治疗策略。研究方法:为一项单中心回顾性研究,收集2012年1月至2014年12月在我院首次诊断IgA肾病的496例患者的基线临床数据并进行为期5年以上的随访。根据患者的肾功能水平及免疫抑制治疗情况将患者分成4组:①CKD 3期免疫抑制治疗（96例）,②CKD 3期无免疫抑制治疗组（30例）,③CKD 4期免疫抑制治疗（26例）,④CKD 4期无免疫抑制治疗组（12例）。以死亡、进展至ESRD或透析、血肌酐倍增作为主要研究终点,以eGFR进行性下降（下降>1ml/min/1.73m2/年）作为次要研究终点。并对CKD3期接受免疫抑制治疗的96例患者进行亚组分析,探究免疫抑制治疗的IgAN患者预后影响的因素,以及是否存在长期预后的短期预测指标。使用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行数据分析,定义p<0.05具有统计学显着性。研究结果:研究共纳入符合入排标准的164例患者,其中男性98例、女性66例,男女比例为1.5:1;平均年龄42.75±13.04岁（18-69岁）,平均随访时间为5.51±1.13年。CKD 3期患者126例、CKD 4期患者38例,不同分期CKD患者根据是否接受免疫抑制治疗分组后,基线年龄、性别、肾脏病病程、既往高血压及糖尿病等代谢性疾病病史方面均无明显差异。Cox单因素及多因素回归分析表明,免疫抑制治疗可显着改善CKD 3期IgAN患者的预后（HR 0.435,95%CI 0.200-0.944,p=0.035）,但对 CKD 4 期 IgAN 患者的预后无明显改善作用（p=0.364）。亚组分析显示,基线eGFR（OR0.909,95%CI0.834-0.991,p=0.031）与主要研究终点和尿蛋白缓解相关,但CKD3a期及3b期接受免疫抑制治疗的肾脏预后无明显差异（p=0.197）。毛细血管襻坏死（OR 0.189[95%CI 0.050-0.709],p=0.014）、新月体小球比例（OR0.200[95%CI 0.100-0.521],p=0.003）、牛津分型 T2 相对 T0 评分（OR5.490,95%CI 1.323-22.727,p=0.019）、C2 相对 C0 评分（OR0.580,95%CI0.070-0.910,p=0.009）与患者次要研究终点相关。接受免疫抑制治疗的患者1年内部分或完全缓解,可提示较好的长期肾脏预后（HR0.555[95%CI0.296-0.759;p=0.035]）,且治疗后达到缓解的时间越短,其预后可能更好。研究结论:CKD 3期的IgAN患者接受免疫抑制治疗可能获益,不仅改善蛋白尿缓解情况,还可以延缓肾功能恶化。但对于CKD4期的患者,积极的免疫抑制治疗需要谨慎。基线肾功能较好或者肾脏病理襻坏死、新月体等急性病变较多或间质纤维化、小管萎缩等慢性病变较少的患者接受免疫治疗后预后较好,在确诊后可给予积极的治疗。此外,在接受免疫抑制治疗1年内可达完全或部分缓解的患者长期预后较好。研究背景及目的:IgA肾病患者可存在足细胞肥大、足突融合、足细胞内吞形成囊泡等病理表现,且超过70%的患者存在局灶节段硬化（S1）,是肾脏预后不良的独立危险因素。此外,足细胞损伤程度也可作为提示疾病严重程度的指标和疾病进展的预测指标。探讨如何减轻足细胞损伤也许可成为IgA肾病潜在的药物治疗靶点及研究方向,可减轻患者蛋白尿及慢性肾脏病进展。而Hippo信号通路及其中最重要的转录激活因子Yes相关蛋白（YAP）在足细胞的细胞凋亡及损伤后修复的过程中发挥着重要作用。本研究关注IgA肾病患者的足细胞损伤及YAP表达情况,推测在IgAN中YAP对足细胞可能起到一定的保护作用,且YAP表达水平与患者疾病严重程度及肾脏预后具有相关性,从而为减轻IgAN患者尿蛋白水平,减缓肾小球硬化及改善患者预后提供新的治疗思路。研究方法:筛选2012年1月至2014年12月于北京协和医院住院行肾穿刺首次诊断IgAN的患者共496例,随机抽取Lee氏3级及4级患者,并根据性别、年龄匹配得到蛋白尿≥3.5g/d的Lee 3-4级患者16例,尿蛋白l-3.5g/d的Lee 3-4级患者16例,匹配Lee 2级患者3例作为疾病对照;同时获取健康对照5例,均为肾脏肿瘤行单侧肾切除后获得其远离肾脏肿瘤的相对健康的肾脏皮质。免疫组化及免疫荧光染色确定YAP在肾脏的表达情况,免疫荧光WT1及YAP共染确定核内表达YAP的足细胞,利用YAP核（+）的足细胞数与该小球足细胞总数的比例代表YAP表达水平。并对不同病理损伤等级的IgAN患者及不同YAP表达水平的IgAN患者进行亚组分析。研究结果:（1）IgAN Lee氏3-4级患者与健康对照相比,足细胞计数明显减少（26.18[23.96,28.39]vs 35.37[29.40,41.75],p=0.043;16.37[13.42,19.31]vs35.37[29.40,41.75],p=0.001）,并且随着病理级别增加,足细胞计数减少及损伤加重。（2）IgAN Lee 2-4级患者细胞核内YAP阳性的足细胞比例均较健康对照组明显下降,且随着病理级别增加,YAP核（+）的足细胞比例逐渐减少。根据散点图及Pearson相关性检验,YAP的表达水平与足细胞计数具有正相线性关系（r=0.876,p<0.001）,YAP核阳性的足细胞比例增加,肾小球的足细胞数越多。（3）IgAN患者YAP的表达水平与疾病严重程度具有相关性,高YAP表达组具有较低的 24hUP[2.60（1.18,4.02）vs 3.86（3.38,3.34）,p=0.038]及更高的 eGFR[106.68±20.01 vs 64.62±19.64,p<0.001],组织病理检查还具有较低的球性硬化比例[3.77%（1.30%,6.26%）vs 30.40%（21.13%,39.68%）,p<0.001]、节段性硬化比例[2.33%（0.94%,3.73%）vs 13.16%（7.25%,19.08%）,p<0.001]]及新月体比例[6.21%（2.94%,9.48%）vs 16.59%（9.60%,23.57%）,p=0.011],且小管间质纤维化程度更轻（p<0.001）。根据MEST-C分组显示,存在肾小球硬化（S1）、肾小管萎缩或间质纤维化（T1-2）、重度细胞/纤维细胞性新月体（C2）病变的患者足细胞YAP表达水平更低。（4）在中位随访6年后,8例IgAN患者到达结局终点,根据COX单因素及多因素回归分析表明,足细胞高YAP表达可显着改善患者预后（HR 0.106[95%CI 0.013-0.869];p=0.037）。研究结论:本研究发现IgA肾病患者存在足细胞损伤,而YAP可能对足细胞起到保护作用。足细胞YAP表达水平与患者临床实验室指标、组织病理评分等具有相关性,且可对患者肾脏预后具有预测价值。阻断Hippo通路使YAP核内表达增加可能成为IgAN新的治疗手段。
时宇[6]（2020）在《α-酮戊二酸促心肌细胞增殖及AdipoRon保护造影剂肾病的相关研究》文中认为研究背景:心肌梗死（Myocardial infarction,MI）是当今发病率和死亡率最高的心血管病之一,严重影响人类健康并加重社会经济负担。据统计,我国60岁以上人群心肌梗死患病率高达27%。心肌梗死是由粥样硬化斑块、血栓以及栓塞等引起的冠状动脉堵塞所造成心肌缺血缺氧,导致大量心肌细胞死亡,但由于成年心肌无法通过自我增殖进行修复,因此大部分心梗病人心功能不断恶化,最终发展为心力衰竭。流行病学调查研究显示,全世界范围内约2600万人患有心力衰竭,且死亡率极高,与恶行肿瘤病人相似。当前针对心肌梗死的治疗只能延缓疾病进程,但都不能有效修复受损心肌,无法有效防止终末事件的发生。经典病理学认为哺乳心脏是终末分化器官,不具备再生能力。随着近年来研究手段的进步,心肌可再生已得到证实,但再生效率低下仍是亟待解决的问题。具有代表性的一项关于人类心脏的研究显示心肌细胞以每年约0.3%至1%的速率进行更新,提示内源性心肌再生的存在,但这种低效的细胞更新通常不足以产生在心脏损伤后具有临床意义的心肌再生。因此,探明内源性心肌再生的机制,并对其进行调控刺激是当前的研究热点。哺乳动物在出生早期仍具有较强心肌增殖能力,但该修复能力在出生后第7天急剧下降。与此同时,心肌代谢方式也在出生后第7天由糖酵解作为主要代谢方式转化为以脂肪酸氧化为主,该心肌代谢方式重编程时间点与心肌增殖能力关闭窗口同步,显示心肌能量代谢方式转变可能是影响心肌增殖能力的关键因素。新近研究以心肌糖脂代谢为切入点,发现抑制脂肪酸代谢可促进糖酵解以及心肌细胞增殖,提示代谢方式对心肌增殖起着重要的调控作用,但代谢方式改变是怎么影响心肌增殖的机制尚不清楚。因此,我们重点关注了糖脂代谢转换所引起的代谢产物频谱改变上。新近非靶向代谢组学分析发现出生后1天与7天小鼠心脏代谢产物谱存在明显差异,在对这些差异代谢产物的筛选过程中,α-酮戊二酸（α-ketoglutarate,α-KG）由于变化大、含量高引起我们的重视,并且,既往的研究中显示了α-KG具有促增殖作用,如:外源给予α-KG可显着促进胚胎干细胞增殖。此外,也有报道显示应用α-KG干预可改善压力负荷所造成的心功能不全的预后,但α-酮戊二酸是否影响心肌细胞增殖能力尚无报道。因此,本研究旨在探明α-KG是否作为干预能量代谢促成年心肌细胞增殖的主要介质,明确α-KG是否能够促进梗死后心肌修复、再生,并阐明其下游作用机制。研究方法:第一部分:1.为了探索α-KG在心肌细胞增殖中的作用,我们首先利用不同终浓度的α-KG（0.1m M,1m M,5m M）处理心肌细胞,24小时后利用增殖标记物Ki67免疫荧光染色检测心肌细胞的增殖。2.在细胞中,α-酮戊二酸脱氢酶（Oxoglutarate Dehydrogenase,OGDH）催化α-KG生成琥珀酰辅酶（Succinyl-Co A）和二氧化碳（CO2）。为进一步探索内源性α-KG对心肌细胞增殖能力的影响,我们用si RNA干扰心肌细胞中的OGDH,阻断α-KG的去路,增加其在心肌细胞中的含量。然后利用免疫荧光染色检测增殖标记物Ki67和PH3阳性率。3.为明确α-KG在心脏发育过程中对心肌细胞增殖的影响,我们连续两周对7天龄普通C57/BL6J小鼠进行α-KG腹腔注射（30mg/kg）。两周后,检测小鼠的心脏体重比,比较心脏的大小;取心脏进行切片,利用小麦胚芽凝集素（Wheat germ agglutinin,WGA）染色比较心肌细胞的大小,排除心肌肥大引起心脏体重比增加的可能。使用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,Ed U）脉冲追踪检测心肌细胞的增殖。第二部分:1.α-KG为组蛋白去甲基化酶十文字结构域包含蛋白（Jumonji domain containing protein 3,JMJD3）的辅酶,可激活JMJD3的活性,进而特异地调控H3组蛋白第27位赖氨酸（H3K27）三甲基化水平（H3K27me3）。H3K27me3是基因转录抑制的标志,其去甲基化后可激活基因转录,JMJD3去甲基化酶则能够特异性地去除基因启动子区H3K27me3甲基化状态,进而解除抑制效应。为探明α-KG在心肌细胞中是否也能调控JMJD3的活性,我们用α-KG处理心肌细胞后,比较JMJD3下游靶修饰H3K27me3的表达量。为进一步明确JMJD3是否作为α-KG调控心肌增殖的作用靶点,我们用si RNA和竞争性抑制剂琥珀酸（Succinate）分别干扰和抑制心肌细胞中JMJD3,而后利用免疫荧光染色观察增殖标记物PH3阳性的心肌细胞比率。2.为明确JMJD3下游靶修饰H3K27me3与心肌增殖能力间的关系,我们以1天龄,7天龄以及28天龄的C57/BL6J小鼠为目标,该三个时间点代表心肌增殖能力逐渐减弱。横向比较小鼠心脏中H3K27me3的表达量。3.使用α-KG处理心肌细胞后,利用生物学技术染色质共沉淀-q PCR（Chromatin immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction,Ch IP-q PCR）检测H3K27me3对细胞周期调节基因的影响,并用q PCR进行验证。进一步明确α-KG解除H3K27me3对细胞周期调节基因的抑制。第三部分:1.为了进一步探究α-KG是否能够促进成年小鼠心肌细胞增殖的影响以及促使梗死后心肌修复,我们在C57/BL6J小鼠上建立MI模型,并每天腹腔注射α-KG,连续注射两周。两周后,观察小鼠心功能的变化。取小鼠心脏组织,切片,利用Masson三色染色检测梗死后心脏纤维化程度。利用Ed U脉冲标记检测心肌增殖能力。血管内皮细胞标记物CD31免疫荧光染色检测血管新生。研究结果:第一部分:1.以不同终浓度的α-KG（0.1m M,1m M,5m M）处理心肌细胞后,与对照组相比,Ki67阳性心肌细胞比率明显增加,其中以浓度为5m M时最为显着。2.用si RNA干扰心肌细胞中的OGDH以增加内源性α-KG后,Ki67和PH3阳性心肌细胞数量明显高于对照组。3.相较于对照组,α-KG注射组小鼠心脏体积较大,心脏体重比增加,而WGA染色显示心肌细胞体积并未增大。提示α-KG注射可促进在体心肌细胞增殖,而不影响心肌肥大。α-KG注射可提高Ed U阳性心肌细胞比率,进一步说明了α-KG可促进心肌细胞增殖。第二部分:1.为了探索JMJD3是否是α-KG调控心肌增殖的靶点,我们用si RNA敲低了心肌细胞中的JMJD3。敲低JMJD3后,PH3阳性心肌细胞数量较对照组明显减少。而且,敲低JMJD3后,α-KG促心肌细胞增殖的作用被阻断。同样,抑制剂Succinate抑制JMJD3后结果与si RNA干扰后一致。说明JMJD3是调控心肌增殖的关键分子,并且是α-KG促进心肌增殖的靶分子。2.1天龄小鼠心肌增殖能力最强,7天龄大幅下降,28天龄几乎丧失。H3K27me3表达量在1天龄小鼠心肌中最低,在7天龄小鼠心脏中较高,而在28天龄小鼠心脏中最高。提示H3K27me3可能抑制心肌细胞增殖。3.Ch IP-q PCR结果进一步显示H3K27me3可富集在细胞周期调节基因B1（Cell cyclin B1,CCNB1）、细胞周期调节基因D1（Cell cyclin D1,CCND1）、细胞周期基因依赖激酶1（Cyclin-dependent kinase 1,CDK1）以及细胞周期基因依赖激酶4（Cyclin-dependent kinase 4,CDK4）。上述细胞周期基因对于心肌增殖极为重要。α-KG处理可明显降低H3K27me3在细胞周期调节基因启动子上的的富集,从而解除H3K27me3对细胞周期基因转录表达的抑制。第三部分:1.心肌梗死后2周,α-KG注射组小鼠心功能较对照组得到明显改善,Masson染色显示α-KG注射组小鼠心肌梗死瘢痕面积减小,CD31免疫荧光染色结果显示α-KG可促进血管新生,Ed U免疫荧光染色显示α-KG注射可促进心肌细胞增殖。说明α-KG可促进成年心肌细胞增殖并促使梗死后新机修复。结论:α-酮戊二酸是干预能量代谢促成年心肌细胞增殖的主要介质,α-酮戊二酸通过激活JMJD3活性、增强其对H3K27me3的去甲基化作用,从而解除H3K27me3对细胞周期调节基因的抑制,最终促进成年心肌细胞增殖,达到修复心梗、防治心衰发生的目的。
杜华[7]（2020）在《益肾颗粒调控LncRNA MALAT1/mTOR诱导足细胞自噬改善糖尿病肾病的机制研究》文中认为糖尿病肾病（Diabetic kidney disease,DKD 或 Diabetic nephropathy,DN）,是由糖尿病导致的慢性肾脏病,在发达国家,DN已经成为终末期肾病的主要原因。DN发病机制复杂,长链非编码RNA与自噬在发病机制中的作用被越来越多的认识到。因机制的不明确性,目前尚缺乏有效的治疗方案,益肾颗粒（Yishen Granule,YSG）是导师张宁教授治疗DN的经验方,临床已验证其有效性,并成为院内制剂,但是YSG的药理成分和作用机制尚不清楚。所以,本研究以高糖高脂饲料喂养联合STZ腹腔注射构建的DN大鼠模型和糖脂毒诱导的足细胞损伤模型为研究对象,予益肾颗粒进行干预,观察YSG通过LncRNA MALAT1/mTOR信号通路,激活足细胞自噬,减轻病理损伤,延缓DN进展的作用和机制。并且,通过高效液相色谱分析法鉴定YSG的化合物成分。实验一:益肾颗粒成分鉴定目的:通过高效液相色谱分析法鉴定YSG的化学成分,明确YSG发挥作用的物质基础。方法:水提法对益肾颗粒进行预处理,减压浓缩后进行定容,所得滤液过0.45μm的微孔膜,取10ul注入高效液相色谱仪。同时,制备标准品溶液,过0.45μm的微孔膜,取10ul,注入高效液相色谱仪。优化高效液相色谱分析仪检测条件:ODS色谱柱,流动相:乙腈（A）-水（B）梯度洗脱:0-10min 2-10%A,10-20min 10-20%A,20-30min 20-30%A,30-40min 30-60%A,40-50min 60-80%A,50-60min 80-95%A,60-65min 95%A;流速 1ml/min,柱温 30℃,进样量10ul（益肾颗粒/标准品）,分离纯化得到化合物。将益肾颗粒的波峰与标准品波峰,进行比对,比对成功即为益肾颗粒成分。结果:在不同的波长254nm和203nm中,可以分离出比较清晰的波峰,得到益肾颗粒的色谱图。与标准品比对后,在254nm波长时,毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮4个成分得到明确。在波长为203nm时,黄芪甲苷、藁本内酯、没食子酸、梓醇4个成分得到明确。结论:通过HPLC法鉴定益肾颗粒中8种成分,分别为黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、藁本内酯、没食子酸、梓醇,为YSG的作用和机制研究奠定物质基础。实验二:益肾颗粒防治HFSD+STZ诱导的糖尿病肾病模型大鼠肾小球硬化的作用。目的:观察YSG对纤连蛋白（FN）、平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、足细胞desmin蛋白的影响,探讨YSG防治DN肾小球硬化的作用。方法:采用高脂高糖饲料（high fat/high sucrose diet,HFSD）喂养配合STZ腹腔注射方法构建糖尿病肾病模型。HFSD喂养6周,然后予1%STZ溶液30mg/kg腹腔注射。72h后,3次尾静脉随机血糖≥16.7mmol/L,为糖尿病成模标准,即为本次研究的模型纳入标准。分为模型组、氯沙坦钾组、益肾颗粒低剂量组、益肾颗粒中剂量组、益肾颗粒高剂量组,另设正常组。分别予灌胃干预10周。干预结束后,麻醉杀检。双缩脲法检测24小时尿蛋白定量（24hU-Pro）,酶法检测大鼠空腹血糖（FBG）、血浆白蛋白（ALB）、血肌酐（Scr）、尿素氮（Bun）、胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）等。肾组织进行HE、PAS病理染色,FN、α-SMA免疫组化,desmin免疫荧光,caspase-3免疫印迹。结果:与正常组相比,模型组24hU-Pro、Bun、FBG、CHO、TG均增加（P<0.01或P<0.05）,ALB减少（P<0.01）,益肾颗粒干预后,24hU-Pro、Bun、FBG、CHO、TG均有下降（P<0.01 或P<0.05）,ALB增加（P<0.05）其中益肾颗粒高剂量效果最为明显,效果优于氯沙坦钾组。HE、PAS染色显示:模型组出现肾小球基底膜增厚、系膜基质的增多、肾小管内细胞空泡样变性、内皮细胞损伤;未出现K-W结节、肾小球塌陷、小动脉玻璃样变性等晚期病变;氯沙坦钾组、益肾颗粒组在用药10W后,肾组织均有不同程度的好转。α-SMA、FN免疫组化显示:正常组肾小球、小管及间质α-SMA、FN的阳性表达较少;模型组可见肾小球基底膜区、系膜区、肾小管上皮细胞、间质区等不同程度的阳性信号（棕黄染）;氯沙坦钾、益肾颗粒干预后,阳性信号有不同程度减弱,以益肾颗粒高剂量组效果最为显着（P<0.01）。足细胞desmin免疫荧光、caspase-3免疫印迹结果显示:模型组desmin、caspase-3表达增加,益肾颗粒干预后,desmin、caspase-3表达下调（P<0.05）。结论:YSG可以降低DN模型大鼠的尿蛋白,减轻氮质血症,改善糖脂代谢,并且能够通过调节FN和α-SMA表达减轻病理损伤,最终延缓肾小球硬化进展。并且,益肾颗粒发挥这些作用,可能是通过减轻足细胞细胞骨架损伤,保护足细胞结构,减少凋亡产生的。实验三:益肾颗粒通过LncRNA MALAT1/mTOR信号通路调控自噬改善DN和足细胞损伤的机制研究。目的:观察益肾颗粒对足细胞LncRNAMALAT1和mTOR介导的自噬的影响,以及MALAT1-mTOR之间关系,探讨益肾颗粒作用机制。方法:体内实验部分:实验二中肾组织Atg5免疫组化;qRT-PCR检测MALAT1 表达;WB 检测 LC3、ATG5、SRSF1、p-mTOR、c-MYC 表达。体外实验部分:通过糖脂毒诱导足细胞损伤模型,25mM糖+0.08mM棕榈酸（PA）干预48h为造模条件,予益肾颗粒冻干粉进行干预,以氯沙坦钾为阳性对照。①通过CCK-8法检测足细胞增殖活力;划痕实验评估足细胞迁移能力;FITC鬼笔环肽进行细胞骨架染色;Lyso-tracker Red进行自噬溶酶体染色;Annexin V-FITC/PI流式细胞术进行足细胞凋亡检测;qRT-PCR检测MALAT1表达;WB检测足细胞骨架蛋白desmin、Synaptopodin;自噬相关蛋白ATG5、P62;通路相关蛋白p-mTOR、SRSF1、c-MYC表达。观察益肾颗粒对足细胞骨架、自噬、通路的作用。②加入自噬激活剂雷帕霉素（Rap）、抑制剂（CQ）,WB法检测ATG5、P62表达水平,观察益肾颗粒对自噬的表达变化。在Rap条件下,qRT-PCR检测MALAT1表达,观察mTOR对MALAT1的作用,以及益肾颗粒在其中的作用。③对MALAT1进行siRNA干扰,qRT-PCR检测MALAT1表达,观察益肾颗粒对MALAT1的影响;WB检测p-mTOR、SRSF1、c-MYC表达,观察MALAT1对mTOR的作用,以及益肾颗粒在其中的作用。结果:体内实验部分:与正常组相比,模型组Atg5免疫组化表达减少,YSG干预后,Atg5表达增加。WB结果显示,模型组LC3、ATG5表达下调（P<0.05）,p-mTOR表达上调（P<0.05）,SRSF1、c-MYC 变化不明显;YSG干预后,自噬相关蛋白LC3、ATG5表达增加（P<0.05）,p-mTOR表达下调（P<0.05）。提示YSG激活了自噬。体外实验部分:①益肾颗粒能够增加足细胞增殖活力,促进细胞迁移;与模型组相比,能增加Synaptopodin表达,减少desmin表达,使肌动蛋白束状排列整齐,减少细胞骨架重排。提示益肾颗粒能够增加足细胞活力,保护足细胞骨架。②益肾颗粒组与模型组相比,能够增加Atg5表达,减少P62累积;益肾颗粒+Rap组比Rap组、益肾颗粒+CQ组比CQ组Atg5表达更高（P<0.01）,但P62未见减少。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡显示,益肾颗粒干预后,凋亡率较模型组均明显下降,与正常组没有统计学差异（P>0.05）。提示,益肾颗粒能够增加足细胞自噬,增加自噬体形成和自噬溶酶体结合,减少足细胞凋亡。③益肾颗粒干预后,MALAT1表达较模型组增加（P<0.05）,p-mTOR表达下调。沉默MALAT1后,p-mTOR增加,糖脂毒性损伤后,p-mTOR进一步增加（与阴性对照相比,P<0.05）,益肾颗粒干预后,p-mTOR明显下调,与阴性对照相比没有统计学差异（P>0.05）。在糖脂毒条件下,与正常组相比,SRSF1表达减少,益肾颗粒和氯沙坦钾干预后,有表达增加趋势,但没有统计学差异（P>0.05）;siRNA处理后,SRSF1表达增加,益肾颗粒干预后,比模型组表达增加趋势,但没有统计学差异（P>0.05）。c-myc在不同条件下,变化不大。提示,MALAT1与mTOR能够相互影响,呈负相关。YSG可以激活MALAT1/mTOR信号通路,机制可能与SRSF1剪接因子的调控作用关系不大。结论:MALAT1与mTOR能够相互影响,呈负相关。MALAT1的下调可以激活mTOR,进而抑制自噬,增加细胞凋亡。YSG可以通过激活MALAT1/mTOR信号通路,增加自噬（促进自噬体形成和自噬溶酶体结合）,减少足细胞骨架重排,减少细胞凋亡。MALAT1对mTOR的调控作用,可能与SRSF1剪接因子的调控作用关系不大。
秦田雨[8]（2020）在《肾康注射液对慢性肾脏病和肾纤维化的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理[目的]从整体动物、细胞和分子水平,结合系统药理学靶点预测,研究中药复方肾康注射液（Shenkang,SK）对慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）和肾纤维化的保护作用和机制,为SK对CKD及肾纤维化的临床治疗提供更多的数据支持及科学依据。[方法]1.系统药理学:首先通过数据挖掘和文献查阅构建SK分子数据库,并通过药物相似性和药物半衰期评估来筛选活性分子;使用WES药物靶向模型来预测生物活性成分的直接药物靶向;使用Cytoscape 3.2软件构建复合物-靶标,靶标-通路和靶标-疾病网络,并根据BioGPS数据库确定靶标在组织和器官中的分布。2.整体动物:C57BL/6小鼠36只,采用随机对照设计法将小鼠按体重随机分为:假手术组,模型组,阳性药（ARB）组,SK高剂量组,SK中剂量组,SK低剂量组（n=6）。对模型组、ARB组、SK各剂量组小鼠实施UUO手术,制备肾纤维化模型,假手术组分离左输尿管但不结扎输尿管。术后第一天开始给药,共计14天。假手术组和模型组:尾静脉注射生理盐水0.13 mL/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,ARB组:尾静脉注射生理盐水0.13 mL/10g,灌胃氯沙坦钾溶液0.15 mL（生药0.13 g）/10 g,SK高剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL（生药0.08 g）/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,SK中剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL（生药0.04 g）/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,SK低剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL（生药0.02 g）/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,实验过程中观察记录小鼠体重等一般情况,给药第13天行MRI扫描测定FA值明确活体肾纤维化程度,给药14天后摘眼球取血,称量肾脏重量,分别冻存固定肾脏。比色法测定血肌酐、血尿素氮、血CysC水平,行HE和天狼星红染色观察患侧肾脏病理形态学和纤维化程度,透射电镜观察超微结构情况,Western Blot检测各组小鼠肾脏肌成纤维细胞标志物α-SMA,ECM成分Col Ⅰ,JAK2/STAT3通路分子蛋白磷酸化水平,Real-time PCR检测假手术组、UUO组和SK中剂量组肾脏肌成纤维细胞标志物α-SMA,FSP-1、ECM成分(Col Ⅲ,JAK2、STAT3、TGF-β1和负调节分子SOCS1,SOCS3 mRNA水平。3.细胞:NRK-49F细胞进行复苏传代培养,以10 ng/mL 的TGF-β1刺激48 h诱导NRK-49F细胞增殖活化,不同浓度SK（0,1,2,4mg/mL）干预后,观察细胞形态、Western Blot检测NRK-49F细胞成纤维细胞标志物α-SMA,ECM成分Col Ⅲ,JAK2/STAT3通路分子蛋白磷酸化水平和负调节分子Prdx5的表达,Real-time PCR检测NRK-49F细胞肌成纤维细胞标志物α-SMA,JAK2、STAT3 mRNA 水平。[结果]1.系统药理学部分:以DL≥0.6为筛选标准,“HL=long”用于定义适当的HL范围。最终选出88种化合物作为活性分子。利用WES算法和CTD、TTD筛选结果,确定了 85个与治疗CKD相关的潜在化合物作用靶点,包括STAT3。通过KEGG数据库映射获得关键通路,包括NF-κB、MAPK、TRP离子通道和VEGF通路,结合CKD病理机制的相关进展,构建了 CKD治疗模块的通路,包括炎症、增殖、分化、迁移、通透性、降解等模块。对靶标-疾病相互作用网络的深入分析表明,SK治疗CKD主要通过影响6种疾病发挥作用:泌尿生殖系统疾病、代谢性疾病、内分泌疾病、心血管疾病,病理过程和免疫疾病。组织定位结果显示SK通过包括肾脏、肝脏、肺和心脏在内的组织模块发挥作用。2.整体动物部分:（1）肾功能检测:与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏血CREA、BUN、Cys-C水平显着性升高（p<0.01）;与UUO组相比,ARB和高剂量SK组小鼠血CREA水平显着降低（p<0.01）;与UUO组相比,ARB和SK各剂量组小鼠血BUN水平显着降低（p<0.05或p<0.01）;与UUO组相比,SK高剂量组小鼠血Cys-C水平显着降低（p<0.05）。（2）肾脏重量和病理检测:与假手术组相比,UUO模型组的患侧肾质量/体重、患侧肾/对侧肾质量、对侧肾质量/体重均显着增加（p<0.05或p<0.01）。但各药物治疗后对UUO小鼠肾脏重量各指标没有产生影响。与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏FA值显着性升高（p<0.01）;与UUO组相比,ARB阳性药组、SK高中低剂量组FA值显着降低（p<0.01或p<0.001）,其中以SK中剂量组最为显着（p<0.001）。与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏病理损伤明显;与UUO组比较,各治疗组肾脏损伤情况均有不同程度缓解,细胞外基质积聚、炎性细胞浸润、肾小管扩张和/或萎缩减轻,以SK中剂量组和高剂量组较好。与假手术组比较,UUO组小鼠天狼星红面积极显着增加（p<0.001）;与UUO组比较,ARB组、SK高、中、低剂量组小鼠患侧肾脏天狼星红染色红色面积显着减少（p<0.05或p<0.01）。电镜下观察各浓度SK对UUO所致的细胞器丰富的成纤维细胞增多,间质局灶胶原纤维增生和肾小管凋亡均有一定的改善作用。（3）Western blot检测:与假手术组相比,UUO组α-SMA蛋白水平显着增加（p<0.01）,与UUO比较,SK中剂量组和低剂量组显着下调了 UUO状态下的α-SMA蛋白水平升高（p<0.05）;与假手术组相比,UUO组Col Ⅰ蛋白水平显着增加（p<0.01）,与UUO 比较,SK中剂量组显着下调了 Col Ⅰ蛋白水平升高（p<0.05）;与假手术组相比,UUO组p-STAT3（Try705位点）/STAT3比例显着增加（p<0.01）,与UUO比较,SK中（p<0.01）、低剂量（p<0.001）组显着下调了 Try705位点的STAT3磷酸化程度;与假手术组相比,UUO组p-JAK2（Try1007位点）/JAK2比例有上升趋势,但无统计学差异,与UUO 比较,SK高剂量组显着下调了 Try1007位点的JAK2磷酸化程度（p<0.05）,（4）PCR检测:与假手术组相比,UUO组小鼠患侧ECM成分Col Ⅰ、Col Ⅲ、FN,成纤维细胞活化标志物α-SMA、FSP-1,以及 JAK2、STAT3、TGF-β、JAK2/STAT3 通路负调节因子SOCS1、SOCS3 mRNA水平显着上升（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;与UUO组相比,SK中剂量组显着降低了 Col Ⅰ、ColⅢ、FN,α-SMA、FSP-1,JAK2、TGF-β、SOCS1、SOCS3 mRNA 水平（p<0.05 或p<0.01）。3.细胞实验:TGF-β1诱导后,NRK-49F细胞的细胞骨架显示出内部微丝束,并逐渐增厚和伸长,丧失纺锤形或星形成纤维细胞外观。不同浓度的SK一定程度上逆转了TGF-β1诱导的形态变化和增殖。与空白对照组比较,模型对照组成纤维细胞p-STAT3（Try705位点）/STAT3、Prdx5蛋白水平显着性升高（p<0.05）,p-JAK2（Try1007位点）/JAK2有一定程度升高但未达统计学意义（p>0.05）;与模型对照组相比,4 mg/mL SK组和2 mg/mL SK组细胞的STAT3蛋白Try705位点的磷酸化水平显着降低（p<0.05）,1 mg/mL SK组和2 mg/mL SK组细胞的JAK2蛋白Try1007位点的磷酸化水平显着降低（p<0.05）,4 mg/mL SK组细胞的Prdx5蛋白表达水平显着降低（p<0.05）。与空白对照组比较,模型对照组成纤维细胞α-SMA、JAK2、STAT3 mRNA水平显着升高（p<0.05或p<0.001）;与模型对照组相比,ARB及不同浓度SK均极显着地降低了α-SMA mRNA 水平（p<0.001）,与模型对照组相比,ARB、1mg/mL、2 mg/mL SK（p<0.05）及 4 mg/mL SK（p<0.01）显着降低了 STAT3 mRNA 水平,与模型对照组相比,ARB及4 mg/mL SK显着降低了 JAK2 mRNA水平（p<0.05）。[结论]（1）系统药理学预测显示SK中多种化合物可能通过作用于与炎症、凋亡、增殖等相关的NF-κB、MAPK、TRP离子通道和VEGF等多通路的靶点分子治疗CKD。（2）SK有效改善UUO小鼠肾功能指标和肾间质纤维化,其机制可能是通过调节JAK2/STAT3信号通路抑制成纤维细胞活化实现的,验证了系统药理学结果。（3）SK还能够抑制TGF-β1诱导NRK-49F增殖活化以及ECM产生,其作用机制可能是通过抑制JAK2/STAT3通路的激活介导的。
王遥[9]（2020）在《蒿甲醚改善1型糖尿病肾病的作用机制研究》文中指出目的糖尿病肾脏疾病（Diabetic kidney disease,DKD）是由糖尿病引起的肾脏微血管并发症,其特征为蛋白尿以及进行性肾功能损伤,DKD是导致终末期肾脏病的主要原因之一。由于DKD给个人家庭和社会带来了沉重的经济负担,因此它是全球范围内的主要公共卫生问题。近年来,国内由DKD引起的终末期肾脏疾病的比例每年都会增加。因此,探究DKD发病机制并寻求其有效治疗方法在减轻家庭和社会的经济负担以及解决社会公共卫生问题等方面,具有重要社会意义和经济价值。DKD发病机制非常复杂,目前尚未完全阐明,涉及到高血糖、炎症、氧化应激和血流动力学改变等因素。高血糖和氧化应激在DKD疾病致病机制中起到关键作用,一方面可以诱导激活多条与细胞增生、肥大相关信号通路,并造成DKD早期肾脏肥大等特征性病理改变。另一方面,氧化还原应激状态和高血糖都会导致线粒体蛋白和线粒体DNA氧化损伤以及线粒体自噬,从而造成其功能损伤,促进DKD的进展。蒿甲醚是由中药青蒿提取物青蒿素衍变而来,近年来的研究表明蒿甲醚不仅对不同类型肿瘤细胞的增殖具有抑制作用,也发现其对代谢性疾病具有一定治疗作用。但是,蒿甲醚对1型DKD的作用及其机制并未见有报道。因此本研究基于前期的研究基础,以链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）诱导的1型糖尿病动物模型和体外细胞实验两个方面,目的在于探讨:（1）蒿甲醚对STZ诱导的1型糖尿病小鼠是否具有肾脏保护作用;（2）蒿甲醚对1型糖尿病相关症状是否有改善作用;（3）蒿甲醚是否可以改善1型糖尿病肾脏肥大及其作用机制;（4）蒿甲醚是否可以改善1型糖尿病的肾脏线粒体功能及其作用机制。方法1、动物实验以STZ诱导的糖尿病小鼠为研究对象,按照随机数字表法将其分为正常对照组（即T1D-ctr1组）、糖尿病组（即STZ组）和蒿甲醚干预组（即STZ+Art）。T1D-ctr1和STZ组小鼠给予标准饲料喂养,STZ+Art组给予含药物饲料（蒿甲醚/饲料:0.67g/kg）喂养,蒿甲醚开始治疗时设置为0周点,共计用药干预8周。使用小鼠代谢笼留取0、4、8周点各组小鼠24h尿液,同时采集24h饮水量、尿量、进食量及粪便量数据;用药后每周点称量各组小鼠体重并使用血糖仪测定空腹血糖。药物干预8周后,留取各组小鼠全血、血清、胰腺、肾脏等标本。使用ELISA试剂盒测定小鼠尿白蛋白排泄率、NGAL、Kim-1和血清胰岛素;使用生化法检测小鼠尿糖结果;采用PAS染色观察小鼠肾脏形态学变化并测量计算出肾小球血管袢面积、肾小球毛细血管袢体积、系膜基质面积、肾小管面积、肾小管管腔和管壁面积;应用电镜检测各组小鼠肾小球和肾小管基底膜厚度以及足突宽度;在HE染色下,计数胰腺内的每个胰岛的个数并测量每个胰岛面积;使用激光共聚焦显微镜检测并计算胰岛内α、β和δ细胞阳性面积比例;使用Amplex UltraRed检测肾脏线粒体H202释放速率;使用免疫组化法检测肾组织中catalase、SOD2、p-Erk1/2和p-S6RP的分布情况;使用荧光定量PCR方法检测肾组织中catalase、SOD2、PDH、MPC1和PDK1的相对表达量;使用 western blot 法检测肾组织中 PDK1、PGC-1 α、catalase、SOD2、p-Erk1/2、p-MEK1/2、p-S6RP、p70S6K、p-Akt、p-mTOR、p-p27kip蛋白含量,同时检测肾脏线粒体蛋白中PDK1的蛋白表达水平。2、细胞实验以大鼠肾小管上皮细胞系（Normal rat kidney epithelial cells,NRK-52E）为研究对象,通过给予高浓度葡萄糖刺激NRK-52E细胞活性增加,通过MTT法检测细胞活性;给予蒿甲醚干预24h、48h、72h后,通过MTT法检测细胞活性;通过western blot检测蒿甲醚对mTOR/p70S6K信号通路的作用。结果1、动物实验（1）蒿甲醚可以显着降低STZ小鼠尿蛋白排泄率并减轻肾脏重量;（2）蒿甲醚可以改善STZ小鼠肾脏肥大性病理改变,减少肾小球血管袢面积和体积、肾小球系膜区面积、减少肾小球基底膜厚度和足细胞足突宽度、肾小管及其管腔和管壁面积、肾小管基底膜厚度;（3）蒿甲醚可以降低STZ小鼠空腹血糖和糖化血红蛋白水平,降低尿糖水平并改善其多饮、多食、多尿症状;（4）蒿甲醚可以改善STZ小鼠胰岛内α、β和δ细胞比例失衡,增加血清胰岛素浓度;（5）蒿甲醚可以降低 STZ 小鼠肾组织中 p-Erk1/2、p-MEK1/2、p-S6RP、p70S6K、p-Akt、p-mTOR、p-p27kip 蛋白含量;（6）蒿甲醚可以降低STZ小鼠肾脏线粒体中PDK1的蛋白表达量,同时可以降低肾组织中PDK1蛋白水平以及PDK1的mRNA相对表达量,增加肾组织中PDH、MPC1的mRNA相对表达量,以及增加肾组织中PGC-1 α蛋白水平;（7）蒿甲醚可以增加STZ小鼠肾组织中catalase、SOD2蛋白浓度及catalase、SOD2 mRNA相对表达量;（8）蒿甲醚可以增加STZ小鼠肾组织线粒体中H2O2释放速率。2、细胞实验（1）不同浓度葡萄糖刺激下,NRK-52E细胞活性提升,并呈一定时间依赖性;（2）蒿甲醚可明显抑制高糖刺激的NRK-52E细胞活性;（3）蒿甲醚可以下调高糖干预24h、48h以及72h的NRK-52E细胞中S6RP、p70S6K、和mTOR蛋白磷酸化水平,在48h最为明显。结论本研究首次验证了蒿甲醚对STZ诱导的1型糖尿病小鼠具有肾脏保护作用,能够改善STZ小鼠的糖尿病症状,降低1型糖尿病小鼠尿白蛋白排泄率,减轻肾脏病理损伤。蒿甲醚对糖尿病肾脏的保护作用可能以下因素有关。（1）蒿甲醚能增加STZ小鼠胰岛素的分泌,降低血糖;（2）蒿甲醚能调节糖尿病小鼠肾脏内氧化应激反应,抑制Akt/mTOR/p70S6K和MAPK/Erk信号通路的活化;（3）蒿甲醚能通过改善1型糖尿病肾脏线粒体对丙酮酸的摄取和氧化能力从而提升了线粒体功能。
李晓喻[10]（2020）在《整合素β6和雷公藤甲素对糖尿病肾脏疾病的作用》文中进行了进一步梳理第一部分整合素β6在糖尿病肾脏疾病上皮-间质转分化中的作用及机制研究研究目的作为糖尿病（diabetes mellitus,DM）常见的并发症之一,糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney diseases,DKD）的患者数量已随着DM发病率的上升出现显着的增长,但现阶段却并没有足够有效的治疗方法。DKD主要的病理改变之一是发生肾脏纤维化和上皮-间质转分化（epithelial to mesenchymal transition,EMT）。整合素（integrin,ITG）是介导细胞和细胞外基质（extra-cellular matrix,ECM）之间信号交流的跨膜蛋白家族,是细胞生理调节的关键因子,主要功能是将细胞锚定在ECM上,控制细胞粘附和迁移。整合素β6亚基仅位于上皮类细胞中,只结合整合素αv亚基以形成异二聚体。整合素αvβ6结合ECM中的纤连蛋白（fibronectin,FN）以调节细胞内生理状态。本实验着眼于整合素β6在DKD发生和发展中的作用,探寻DKD可能的发生机制及潜在的治疗靶点。研究方法选取16周龄的db/db小鼠与同窝db/m小鼠,测量血糖和尿蛋白水平。马松染色和纤维化标志物FN免疫组织化学染色（immunohistochemical staining,IHC）以评估纤维化程度。肾组织进行转录组测序（RNA sequencing,RNA-Seq）与生物信息学分析,寻找表达有显着差异的基因。免疫印迹（Western blot,WB）和IHC检测确定肾脏中整合素β6和EMT指标波形蛋白（vimentin,Vim）、E-钙黏素（E-Cadherin,E-Ca）的表达水平。WB实验检测黏着斑激酶（focal adhesion kinase,Fak）、Src（sarcoma gene,Src）、Yes相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）的磷酸化水平,并检测Notch1的表达。应用多聚赖氨酸（poly-l-lysine,PLL）和FN干预人肾小管上皮细胞（HK-2）48h,WB和免疫荧光染色（immunofluorescence,IF）检测整合素β6以及E-Ca的表达。WB实验检测HK-2细胞内Fak、Src、YAP与Notch1的表达情况。转染ITGβ6-si RNA和Notch1-si RNA以确定作用通路。收集健康对照者（NC）、DM患者（不伴发DKD）以及DKD患者的尿液,检测尿蛋白谱的变化情况。酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbentassay,ELISA）评估尿液中整合素β6的表达情况。研究结果1、与db/m小鼠相比,db/db小鼠血糖水平和尿蛋白水平明显上升,出现明显的DKD病变。db/db小鼠肾脏中胶原和FN表达增多,纤维化水平显着增加。2、实验小鼠RNA-Seq和生物信息学分析结果显示,细胞粘附功能相关基因在db/db小鼠体内明显改变。整合素β6在db/db小鼠肾脏内表达显着增加,且与其他发生显着改变的粘附功能相关基因关系紧密。3、db/db小鼠肾脏中整合素β6表达明显升高,Vim表达增加,E-Ca表达显着降低,提示db/db小鼠EMT水平明显上升。db/db小鼠Fak、Src和YAP的磷酸化水平增加,Notch1的表达增多。4、与PLL干预组相比,FN干预的HK-2细胞整合素β6表达明显增加,E-Ca表达下降,EMT程度显着升高。FN组HK-2细胞Fak、Src与YAP的磷酸化水平升高,Notch1表达水平增加,提示FN通过激活Fak/Src通路,增加YAP的磷酸化,促进Notch1表达,继而介导EMT发生。5、HK-2细胞转染ITGβ6-si RNA后,Fak、Src与YAP的磷酸化水平受明显抑制,Notch1表达水平降低,EMT程度得到缓解,提示整合素β6介导了FN诱导的肾小管上皮细胞EMT。转染Notch1-si RNA后,Vim表达水平明显下降,E-Ca表达显着上升,EMT得到明显缓解。6、与DM患者相比,DKD患者尿液中肾小管与肾小球功能标志性蛋白表达显着提高。与NC组相比,DM患者尿液中整合素β6的表达未出现明显改变,而DKD患者尿液中整合素β6含量显着上升。研究结论整合素β6在db/db小鼠、FN干预的肾小管上皮细胞以及DKD患者尿液中的表达明显增加。当ECM纤维化程度提升时,FN表达水平增加,作用于细胞膜上的整合素β6,激活Fak/Src通路,促进YAP的磷酸化,增加Notch1表达,进而促进肾小管上皮细胞发生EMT。DKD患者尿液中的整合素β6可能作为DKD的潜在生物标志物,而抑制肾小管上皮细胞中整合素β6的表达可能为我们提供预防和临床治疗DKD的新靶点和新思路。第二部分雷公藤甲素对糖尿病肾脏疾病自噬和纤维化的作用及机制研究研究目的DKD作为DM常见的并发症之一,严重威胁人体的健康。自噬是机体通过降解细胞器组分和蛋白以维持细胞内正常新陈代谢的生理过程。DKD模型中ECM明显积聚,肾脏发生纤维化,自噬程序受明显抑制。雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook F,TWHF）是一种提取自中国传统药材雷公藤的药物,常被临床用于治疗DKD等肾脏疾病,并取得良好疗效。然而TWHF导致的肝损伤等不良反应也十分明显。雷公藤甲素（triptolide,TP）是雷公藤的主要活性成分之一。作为一种单纯的化合物,TP是否可以在维持TWHF对蛋白尿良好疗效的同时有效规避这些不良反应尚不明确。本实验旨在探寻TP对DKD的作用效果及作用机制,为临床治疗和预防DKD提供新的思路。研究方法雄性SD大鼠分为标准饮食喂养组（NC）、高脂饮食（high-fat diet,HFD）合并单次链脲佐菌素（streptozocin,STZ）腹腔内注射组（DKD）,以及HFD/STZ造模并接受200mg/kg/d TP灌胃治疗组（DKD+TP）。测量实验大鼠的血糖和尿微量白蛋白（urine microalbumin,UMA）。IHC和WB实验评估肾组织切片中纤维化指标Ⅳ型胶原（CollegenⅣ,ColⅣ）、FN以及自噬指标P62、LC3的表达。人肾小球系膜细胞（human renal mesangial cells,HRMCs）分为4组,分别以5.5mmol/L葡萄糖（NG）、5.5mmol/L葡萄糖加19.5mmol/L甘露醇（MA）、25mmol/L葡萄糖（HG）、25mmol/L葡萄糖加10μmol/L TP（HG+TP）干预48h。应用自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）干预细胞或以si RNA技术敲减自噬相关基因（autophagy-related gene,Atg）5,检测纤维化指标的变化,以评估自噬和纤维化的关系。进行mi RNA芯片分析以寻找差异表达的mi RNA,根据Target Scan数据库预测靶基因,荧光素酶报告基因实验进行验证。转染磷酸酶和张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologue,PTEN）的si RNA,检测自噬和纤维化指标的改变情况。分别转染mi R-141-3p类似物和抑制物,检测PTEN和下游的蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）表达情况。研究结果1、DKD大鼠血糖水平和UMA水平明显升高。DKD+TP组大鼠UMA水平显着下降,且肝功能及血常规指标未出现明显的统计学差异。DKD大鼠自噬水平显着下降,而DKD+TP组自噬水平明显回升,纤维化得到显着缓解。2、HG干预下的HRMCs中ColⅣ、FN和P62表达明显升高,LC3Ⅱ/Ⅰ比值显着下降,即HG组细胞自噬水平下降,纤维化水平上升。TP干预后,HRMCs自噬水平回升,纤维平水平被显着抑制。3、应用3-MA或Atg-5 si RNA抑制自噬后,ColⅣ、FN表达明显上升,TP对纤维化指标的恢复作用明显受损,提示TP通过恢复细胞自噬而缓解纤维化进程。4、mi RNA芯片分析发现,HG组细胞中mi R-141-3p含量明显升高,而HG+TP组中mi R-141-3p表达明显降低。mi R-141-3p可以直接作用于PTEN的3’UTR区并抑制PTEN的表达。HG+TP组细胞转染PTEN-si RNA后,TP对于HG诱导下自噬和纤维化的恢复作用被显着抑制。5、HG干预的细胞转染mi R-141-3p抑制物后,PTEN表达提升,下游Akt/m TOR通路被抑制,ColⅣ、FN和P62表达下降,LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高,提示自噬水平回升,纤维化程度下降。而转染mi R-141-3p类似物可抑制TP恢复自噬并缓解纤维化的作用。研究结论HFD/STZ造模的DKD大鼠血糖水平和纤维化水平显着上升,自噬水平明显下降。TP治疗减轻DKD大鼠尿蛋白,有效缓解肾组织肥大,恢复自噬水平并缓解肾脏纤维化,且未发现TP对肝功能和血液系统的副作用。高糖干预会引起mi R-141-3p表达升高,进而作用于靶基因PTEN的3’UTR区,抑制PTEN表达,激活下游Akt/m TOR通路,抑制细胞自噬,从而促进纤维化进程。TP抑制mi R-141-3p表达,通过作用于PTEN/Akt/m TOR通路,恢复自噬,进而缓解肾脏纤维化。
二、肾小管上皮细胞增殖和肥大与细胞周期调节蛋白（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肾小管上皮细胞增殖和肥大与细胞周期调节蛋白（论文提纲范文）
（1）复方仙草颗粒对早期糖尿病肾病患者肾小管间质损伤保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 研究对象和方法 |
| 1 选取对象 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 西医诊断标准 |
| 2.2 中医诊断要点 |
| 2.3 研究对象选取标准 |
| 2.4 研究对象排除标准 |
| 2.5 研究对象的脱落 |
| 2.6 研究对象的伦理学审查 |
| 2.7 研究步骤 |
| 第二章 研究结果 |
| 1 治疗前一般情况 |
| 2 结果 |
| 2.1 复方仙草颗粒对糖尿病肾病患者临床疗效的影响 |
| 2.2 复方仙草颗粒对糖尿病肾病患者中医证候积分的影响 |
| 2.3 复方仙草颗粒对糖尿病肾病患者相关理化指标的影响 |
| 第三章 讨论 |
| 一、西医对DKD的认识 |
| 1 DKD患者肾脏结构和功能的表现 |
| 2 DKD的病因及发病机制 |
| 2.1 糖代谢紊乱 |
| 2.2 血流动力学改变 |
| 2.3 氧化应激反应 |
| 2.4 细胞因子 |
| 2.5 炎症反应 |
| 2.6 高血压 |
| 2.7 遗传因素 |
| 3 DKD肾小管间质损害的相关标志物 |
| 3.1 β2-微球蛋白(β2-MG) |
| 3.2 N-乙酰-β-D-氨基葡萄苷酶(NAG) |
| 3.3 胱抑素C(Cys C) |
| 3.4 尿视黄醇结合蛋白(RBP) |
| 3.5 尿微量白蛋白/尿肌酐(ACR) |
| 4 现代医学对DKD治疗的研究 |
| 4.1 控制血糖 |
| 4.2 降低血压 |
| 4.3 降低血脂 |
| 4.4 抗氧化应激 |
| 4.5 抑制糖基化终末产物 |
| 4.6 抑制多元醇代谢通路 |
| 4.7 抑制蛋白激酶C |
| 二、祖国医学对DKD的认识与研究 |
| 1 历代医家的认识 |
| 2 对病因病机的认识 |
| 2.1 阴虚燥热 |
| 2.2 脾肾亏虚 |
| 2.3 气阴两虚 |
| 2.4 肝肾两虚 |
| 2.5 瘀血组络 |
| 2.6 湿热内蕴 |
| 3 中医治疗DKD的探讨 |
| 3.1 辨证论治 |
| 3.2 经方 |
| 3.3 中成药 |
| 3.4 单味中药 |
| 三、复方仙草颗粒对DKD的作用 |
| 1 复方仙草颗粒的组成及方解特点 |
| 2 复方仙草颗粒的药物分析研究 |
| 四、研究结果分析 |
| 1 改善患者的临床症状及中医证候积分 |
| 2 改善患者肾小管间质功能 |
| 五、安全性评估 |
| 第四章 问题及展望 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 糖尿病肾病对肾小管间质损害的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（2）肾小管上皮细胞Bim蛋白介导管球交流致足细胞骨架损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 一、“管球交流”中肾小管上皮细胞Bim/NFAT通路介导足细胞骨架损伤的机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 二、受Bim调控的lncRNA NONHSAT179542.1在“管球交流”致足细胞骨架损伤中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
（3）STAT3调控的自噬在血管紧张素Ⅱ诱导的肾小管上皮细胞衰老过程中的作用及氯沙坦对其的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 自噬在血管紧张素Ⅱ诱导人肾小管上皮细胞衰老过程中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 细胞来源 |
| 2.1.2 实验主要仪器 |
| 2.1.3 实验主要试剂及药品 |
| 2.1.4 实验主要试剂及药品配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人肾小管上皮细胞培养 |
| 2.2.2 建立血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小管上皮细胞衰老模型 |
| 2.2.3 实验分组 |
| 2.2.4 实验检测指标 |
| 2.2.5 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 血管紧张素Ⅱ可诱导人肾小管上皮细胞发生衰老 |
| 3.1.1 细胞周期检测结果 |
| 3.1.2 Western blot结果 |
| 3.1.3 β-半乳糖苷酶染色结果 |
| 3.2 血管紧张素Ⅱ诱导人肾小管上皮细胞衰老过程中自噬活性增强并介导其衰老 |
| 3.2.1 Western blot结果 |
| 3.2.2 电镜结果 |
| 3.2.3 LC3-GFP-mRFP自噬双标腺病毒转染结果 |
| 3.2.4 β-半乳糖苷酶染色结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 STAT3/PI3KC3调控的自噬在血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小管上皮细胞衰老过程中的调控作用 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 细胞来源 |
| 2.1.2 实验主要仪器 |
| 2.1.3 实验主要试剂及药品 |
| 2.1.4 实验主要试剂及药品配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人肾小管上皮细胞培养 |
| 2.2.2 实验分组 |
| 2.2.3 siRNA-STAT3转染及STAT3基因沉默 |
| 2.2.4 实验检测指标 |
| 2.2.5 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 血管紧张素Ⅱ诱导人肾小管上皮细胞衰老过程中STAT3/PI3KC3通路激活 |
| 3.2 药物抑制和基因沉默STAT3表达,可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小管上皮细胞自噬激活,减轻细胞衰老 |
| 3.2.1 S3I-201抑制STAT3表达后,AngⅡ诱导的人肾小管上皮细胞自噬激活被抑制,肾小管上皮细胞衰老减轻 |
| 3.2.2 siRNA-STAT3基因沉默STAT3表达后,Ang Ⅱ诱导的人肾小管上皮细胞自噬激活被抑制,肾小管上皮细胞衰老减轻 |
| 3.3 氯沙坦可通过抑制STAT3激活,进而抑制血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小管上皮细胞自噬、减轻细胞衰老 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 氯沙坦可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠衰老过程中STAT3激活、并减轻小鼠肾小管上皮细胞衰老 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验主要仪器 |
| 2.1.3 实验主要试剂及药品 |
| 2.1.4 实验主要试剂及药品配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物饲养方法及分组 |
| 2.2.2 制备给药微渗透泵及皮下植入 |
| 2.2.3 小鼠血液、尿液及肾脏组织标本的留取 |
| 2.2.4 小鼠血压测量 |
| 2.2.5 实验检测指标 |
| 2.2.6 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 血管紧张素Ⅱ诱导小鼠肾脏衰老过程中小鼠血压、血尿素氮、血肌酐、24小时尿蛋白、尿NAG的变化及氯沙坦对其影响 |
| 3.2 血管紧张素Ⅱ可诱导小鼠肾小管上皮细胞发生衰老 |
| 3.3 氯沙坦可通过抑制STAT3激活,减轻自噬激活、延缓血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠肾小管上皮细胞肾小管上皮细胞衰老 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 衰老与肾脏疾病 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）滋肾丸干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞焦亡作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 糖尿病肾病炎症机制及中医药干预研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 糖尿病肾病炎症反应的主要参与成分 |
| 3 糖尿病肾病炎症反应的主要信号转导通路 |
| 4 糖尿病肾病炎症反应的中医病机与辨证 |
| 5 中医药干预糖尿病肾病炎症反应的作用及机制 |
| 6 中医药防治糖尿病肾病炎症反应的现代研究方法 |
| 参考文献 |
| 综述二 滋肾丸临床应用及相关研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 滋肾丸的源流与命名 |
| 3 滋肾丸的方证与方义 |
| 4 滋肾丸的制方与化裁 |
| 5 滋肾丸的名家应用经验 |
| 6 滋肾丸的临床应用研究 |
| 7 滋肾丸的现代研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 滋肾丸干预糖尿病肾病小鼠肾小管上皮细胞焦亡作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 实验二 滋肾丸干预高糖培养的人近端肾小管上皮细胞焦亡作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 实验三 滋肾丸治疗糖尿病肾病网络药理学研究 |
| 1 资料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（5）IgA肾病免疫抑制治疗的长期随访研究及YAP对足细胞的保护作用（论文提纲范文）
| 主要缩略词 |
| 第一部分 CKD 3-4期IgA肾病患者免疫抑制治疗的长期随访研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| （一）研究对象及方法 |
| （二）研究结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 IgA肾病的足细胞损伤及YAP对足细胞的保护作用 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| （一）试验材料和方法 |
| （二）试验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述1 IgA肾病的个体化治疗 |
| 参考文献 |
| 综述2 足细胞损伤对IgA肾病的预测价值及损伤机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）α-酮戊二酸促心肌细胞增殖及AdipoRon保护造影剂肾病的相关研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 α-酮戊二酸在心肌细胞增殖中的作用研究 |
| 2.1 材料与实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 α-酮戊二酸调控心肌细胞增殖的分子机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 脂联素受体激动剂AdipoRon通过激活AMPK途径抑制氧化应激与炎症以保护造影剂诱导的肾损伤 |
| 参考文献 |
| 文献综述 代谢,表观遗传修饰与心肌再生 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）益肾颗粒调控LncRNA MALAT1/mTOR诱导足细胞自噬改善糖尿病肾病的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 文献综述 |
| 综述一 中医药在糖尿病肾脏病中研究进展 |
| 综述二 长链非编码RNA在糖尿病及并发症中作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 益肾颗粒有效成分鉴定 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 益肾颗粒防治HFSD+STZ诱导的糖尿病肾病模型大鼠肾小球硬化的作用 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 益肾颗粒通过LncRNA MALAT1/mTOR信号通路调控自噬改善DN和足细胞损伤的机制研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附件 |
（8）肾康注射液对慢性肾脏病和肾纤维化的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 慢性肾脏病肾纤维化的现代研究进展 |
| 1 病因研究 |
| 2 发病机制研究 |
| 3 治疗与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药防治慢性肾脏病研究进展 |
| 1 病名研究 |
| 2 病因病机研究 |
| 3 防治研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 肾康注射液治疗慢性肾脏病的系统药理学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果和讨论 |
| 3 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 肾康注射液对UUO小鼠肾间质纤维化的保护作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 肾康注射液对NRK-49F人鼠肾间质成纤维细胞活化的作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 主要研究成果 |
| 个人简历 |
（9）蒿甲醚改善1型糖尿病肾病的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 中医对消渴肾病的认识 |
| 一、病因病机 |
| 二、辨证论治 |
| 第二节 糖尿病肾脏疾病研究进展 |
| 一、糖尿病肾脏疾病流行病学 |
| 二、DKD肾脏病理改变 |
| 三、糖尿病肾脏疾病发病机制 |
| 四、糖尿病肾脏疾病治疗进展 |
| 第三节 青蒿素及其衍生物 |
| 一、疟疾性疾病 |
| 二、肿瘤性疾病 |
| 三、代谢性疾病 |
| 四、自身免疫性疾病 |
| 第二章 动物实验 |
| 第一节 实验动物和饲养 |
| 一、实验动物 |
| 二、动物饲养 |
| 第二节 主要试剂和仪器 |
| 一、主要试剂 |
| 二、主要试剂配制 |
| 三、主要仪器 |
| 第三节 实验方法 |
| 一、糖尿病小鼠模型建立 |
| 二、样本采集和处理 |
| 三、血清、尿液生化检测 |
| 四、糖化血红蛋白 |
| 五、肾组织病理分析 |
| 六、胰腺组织病理分析 |
| 七、肾组织线粒体提取 |
| 八、酶联免疫吸附实验 |
| 九、肾组织线粒体H_2O_2测定 |
| 十、实时荧光定量PCR(qPCR) |
| 十一、蛋白质免疫印迹 |
| 十二、统计学方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 一、各组小鼠4、8周点尿白蛋白排泄率变化情况比较 |
| 二、各组小鼠8周点肾脏重量和大体形态变化情况比较 |
| 三、各组小鼠8周点肾小球毛细血管袢面积、体积和系膜基质面积比较 |
| 四、各组小鼠8周点肾小球基底膜厚度、足细胞足突宽度变化情况 |
| 五、各组小鼠8周点近端肾小管面积、肾小管管腔和管壁面积比较 |
| 六、各组小鼠8周点肾小管基底膜变化 |
| 七、各组小鼠8周点尿NAG、NGAL和Kim-1变化情况比较 |
| 八、各组小鼠8周点血清TP和ALB变化情况比较 |
| 九、各组小鼠糖尿病症状变化情况比较 |
| 十、小鼠0、4、8周点空腹血糖变化情况比较 |
| 十一、小鼠8周点糖化血红蛋白和尿糖结果变化情况比较 |
| 十二、小鼠8周点血清胰岛素检测结果变化情况比较 |
| 十三、小鼠8周点平均胰岛面积变化情况比较 |
| 十四、小鼠8周点胰高血糖素/胰岛素和生长抑素/胰岛素面积比例结果 |
| 十五、蒿甲醚对1型糖尿病小鼠肾脏肥大的作用机制研究 |
| 十六、各组小鼠8周点肾脏组织中氧化还原状态 |
| 十七、8周点各组小鼠肾组织和肾脏线粒体丙酮酸代谢情况 |
| 十八、各组小鼠8周点肾脏组织线粒体H_2O_2排泄率 |
| 第五节 讨论 |
| 第六节 小结 |
| 第三章 细胞实验 |
| 第一节 实验细胞 |
| 第二节 主要试剂和仪器 |
| 一、主要试剂 |
| 二、主要试剂配置 |
| 三、主要仪器 |
| 第三节 实验方法 |
| 一、NRK-52E细胞复苏 |
| 二、NRK-52E细胞培养 |
| 三、NRK-52E细胞传代 |
| 四、NRK-52E细胞冻存 |
| 五、NRK-52E细胞铺板同化 |
| 六、MTT法检测细胞活性 |
| 七、不同浓度蒿甲醚对高糖刺激下细胞蛋白的影响 |
| 八、统计学方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 一、高糖刺激下NRK-52E的作用 |
| 二、蒿甲醚对高糖刺激下NRK-52E细胞mTOR/p70S6K信号通路的影响 |
| 第五节 讨论 |
| 第六节 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（10）整合素β6和雷公藤甲素对糖尿病肾脏疾病的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 第一部分 |
| 第二部分 |
| Abstract |
| Part Ⅰ |
| Part Ⅱ |
| 缩略语/符号说明 |
| 第一部分 整合素β6在糖尿病肾脏疾病上皮-间质转分化中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、整合素β6在db/db小鼠肾脏中的作用和机制研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物及饲养方法 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.1.5 统计方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 db/db小鼠血糖上升蛋白尿增加 |
| 1.2.2 db/db小鼠纤维化和上皮-间质转分化水平升高 |
| 1.2.3 转录组测序及生物信息学分析结果 |
| 1.2.4 db/db小鼠整合素β6表达升高 |
| 1.2.5 db/db小鼠Fak/Src/Yap/Notch通路活性增加 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 db/db小鼠的特点与应用 |
| 1.3.2 整合素αvβ6的表达与作用 |
| 1.4 小结 |
| 二、整合素β6对纤连蛋白干预的肾小管上皮细胞的作用和机制研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验细胞及培养方法 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.1.5 统计方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 纤连蛋白促进肾小管上皮细胞上皮-间质转分化 |
| 2.2.2 纤连蛋白增加肾小管上皮细胞整合素β6表达 |
| 2.2.3 纤连蛋白激活Fak/Src/YAP/Notch1 通路 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 整合素与Fak/Src信号通路的关系 |
| 2.3.2 糖尿病肾脏疾病模型中YAP的变化与作用 |
| 2.3.3 糖尿病肾脏疾病模型中Notch的变化与作用 |
| 2.3.4 Fak/Src、YAP和 Notch通路的相互作用 |
| 2.3.5 整合素β6在糖尿病相关疾病中的作用与前景 |
| 2.4 小结 |
| 三、整合素β6在糖尿病肾脏疾病患者尿液中的改变情况 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 目标人群 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.1.5 统计方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 糖尿病肾脏疾病患者蛋白尿和肾功能损伤 |
| 3.2.2 糖尿病肾脏疾病患者尿整合素β6水平升高 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 糖尿病肾脏疾病患者尿蛋白谱的改变 |
| 3.3.2 尿液中整合素的变化与意义 |
| 3.3.3 整合素β6作为生物标志物的可能性 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 第二部分 雷公藤甲素对糖尿病肾脏疾病自噬和纤维化的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、雷公藤甲素改善糖尿病肾脏疾病大鼠自噬和纤维化 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物及饲养方法 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.1.5 统计方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 实验大鼠血糖和尿蛋白水平升高 |
| 1.2.2 雷公藤甲素缓解糖尿病肾脏疾病大鼠纤维化 |
| 1.2.3 雷公藤甲素恢复糖尿病肾脏疾病大鼠自噬 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 HFD/STZ诱导的糖尿病肾脏疾病动物模型的特点 |
| 1.3.2 雷公藤及其衍生物的临床应用与不良反应 |
| 1.4 小结 |
| 二、雷公藤甲素改善高糖诱导的人肾小球系膜细胞自噬和纤维化 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验细胞及培养方法 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.1.5 统计方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 长时间高糖干预抑制人肾小球系膜细胞自噬 |
| 2.2.2 雷公藤甲素恢复人肾小球系膜细胞自噬 |
| 2.2.3 雷公藤甲素缓解人肾小球系膜细胞纤维化 |
| 2.2.4 雷公藤甲素通过恢复自噬来缓解纤维化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 糖尿病相关疾病自噬水平的变化 |
| 2.3.2 雷公藤甲素对自噬的影响 |
| 2.4 小结 |
| 三、雷公藤甲素改善自噬和纤维化水平的机制研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验细胞及培养方法 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.1.5 统计方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 高糖诱导的人肾小球系膜细胞miRNA改变 |
| 3.2.2 雷公藤甲素作用于miR-141-3p以调节自噬和纤维化 |
| 3.2.3 miR-141-3p作用于PTEN以调节自噬和纤维化 |
| 3.2.4 雷公藤甲素调节PTEN及下游Akt/m TOR通路 |
| 3.2.5 雷公藤甲素调节miR-141-3p/PTEN/Akt/mTOR通路 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 miR-141-3p在肾脏疾病中的改变和作用 |
| 3.3.2 雷公藤甲素调节自噬和纤维化的机制 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 整合素和糖尿病肾脏疾病的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、肾小管上皮细胞增殖和肥大与细胞周期调节蛋白（论文参考文献）
- [1]复方仙草颗粒对早期糖尿病肾病患者肾小管间质损伤保护作用的研究[D]. 庾雪鹰. 广西中医药大学, 2021(02)
- [2]肾小管上皮细胞Bim蛋白介导管球交流致足细胞骨架损伤的机制研究[D]. 许春梅. 山东大学, 2021(11)
- [3]STAT3调控的自噬在血管紧张素Ⅱ诱导的肾小管上皮细胞衰老过程中的作用及氯沙坦对其的影响[D]. 李慧敏. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]滋肾丸干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞焦亡作用及机制研究[D]. 郭晓媛. 北京中医药大学, 2021(01)
- [5]IgA肾病免疫抑制治疗的长期随访研究及YAP对足细胞的保护作用[D]. 倪岳晖. 北京协和医学院, 2021(02)
- [6]α-酮戊二酸促心肌细胞增殖及AdipoRon保护造影剂肾病的相关研究[D]. 时宇. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [7]益肾颗粒调控LncRNA MALAT1/mTOR诱导足细胞自噬改善糖尿病肾病的机制研究[D]. 杜华. 中国中医科学院, 2020(01)
- [8]肾康注射液对慢性肾脏病和肾纤维化的作用及机制研究[D]. 秦田雨. 北京中医药大学, 2020(04)
- [9]蒿甲醚改善1型糖尿病肾病的作用机制研究[D]. 王遥. 广州中医药大学, 2020(06)
- [10]整合素β6和雷公藤甲素对糖尿病肾脏疾病的作用[D]. 李晓喻. 天津医科大学, 2020(06)