一、蔬菜转基因研究进展（论文文献综述）
王梦雨[1]（2021）在《转录因子BoaMYB51和BoaBIM1调控芥蓝吲哚族芥子油苷代谢机理及其功能研究》文中研究表明芥子油苷是一类主要存在于十字花科植物中的含氮含硫的植物次生代谢物质。芥子油苷的生物学功能非常广泛,不仅可以帮助植物抵御病原菌侵袭、防御昆虫及提高自身免疫,而且其自身及降解产物具有较强的抗癌活性。芸薹属蔬菜是我国蔬菜产业的重要组成部分。芥子油苷在芸薹属蔬菜中含量丰富,其不仅影响芸薹属蔬菜的风味和营养,而且在抵御蔬菜重要病害如黑斑病等中发挥重要的作用。目前,在模式植物拟南芥中芥子油苷生物合成途径和调控网络的研究已经较为深入,而在作物中研究较少。我国特产的甘蓝类蔬菜——芥蓝中芥子油苷种类和含量丰富,是芸薹属蔬菜中研究芥子油苷代谢调控网络的良好材料。本论文以芥蓝为材料,综合运用分子生物学、生理学、遗传学、基因组学等手段探究了吲哚族芥子油苷代谢途径的转录调控机制。主要研究结果如下:1.VIGS沉默BoaMYB51降低了芥蓝黑斑病抗性。本论文中利用virus-induced gene silencing（VIGS）技术获得了转录因子BoaMYB51基因沉默材料。通过接种芸薹链格孢孢子悬浮液进行侵染发现,BoaMYB51-VIGS的芥蓝叶片接种后菌斑面积及菌斑溶于水后的孢子浓度均显着高于对照叶片。结果表明,在芥蓝响应芸薹链格孢侵染的过程中,BoaMYB51参与正向调控芥蓝对黑斑病的抗性。2.BoaMYB51过表达促进芥蓝中吲哚族芥子油苷的合成。为了验证芥蓝中BoaMYB51的功能,通过遗传转化和VIGS技术获得了芥蓝BoaMYB51转基因材料和基因沉默材料。芥子油苷组分和含量分析结果显示,各吲哚族芥子油苷组分的含量在BoaMYB51基因沉默材料中均显着低于对照,而在芥蓝BoaMYB51基因过表达材料中均显着高于对照。相对应的,芥子油苷生物合成关键基因表达分析结果表明,BoaMYB51基因沉默材料中吲哚族芥子油苷生物合成关键基因BoaCYP79B2、BoaCYP79B3、BoaCYP83B1等均受到显着下调,而在BoaMYB51基因过表达材料中则显着上调。以上结果表明,BoaMYB51正向调控芥蓝中吲哚族芥子油苷的生物合成。3.bHLH类转录因子BoaBIM1与BoaMYB51互作。利用酵母双杂交筛选芥蓝cDNA文库,筛选到30个可能与BoaMYB51存在互作关系的蛋白,其中包括转录因子、核定位的调控蛋白、参与蛋白调控的蛋白以及功能未知的蛋白。之后对鉴定到的bHLH类转录因子BoaBIM1与BoaMYB51进行了酵母双杂交点对点验证,以及pull-down实验的进一步蛋白互作验证。在芥蓝中,共鉴定到两个BoaBIM1基因,氨基酸比对和进化树分析表明,BoaBIM1与At BIM1有较高的同源性。利用烟草瞬时表达系统对BoaBIM1蛋白进行亚细胞定位分析发现,其定位于细胞核中。芥蓝不同组织器官及芥蓝幼苗不同生长时期的表达模式分析显示,BoaBIM1在嫩叶、花、茎和根中表达量较高,而在角果中表达量很低。除此之外,芥蓝各组织器官中BoaBIM1.1的表达量均显着高于BoaBIM1.2。4.BoaBIM1转录调控吲哚族芥子油苷的生物合成。为了验证芥蓝中BoaBIM1的功能,利用VIGS基因沉默技术获得了BoaBIM1-VIGS的芥蓝材料。芥子油苷组分和含量分析结果表明,不同的BoaBIM1-VIGS芥蓝株系中吲哚族芥子油苷各组分的含量均显着低于对照。相比于对照,BoaBIM1-VIGS芥蓝植株中吲哚族芥子油苷重要转录因子BoaMYB51.1的基因表达量显着下降,而BoaMYB51.2的基因表达量则没有明显变化;吲哚族芥子油苷合成途径的关键酶基因表达均明显下降,其中以BoaCYP79B2.2和BoaSUR1.1下降最为显着。通过农杆菌浸花法获得了拟南芥BoaBIM1基因过表达植株,进一步测定了芥子油苷含量和芥子油苷合成相关基因表达量。在BIM1及其同源基因都缺失的三突突变体bim123中,各吲哚族芥子油苷组分含量显着低于野生型,而BoaBIM1.1过表达株系Col-035S:BoaBIM1.1和BoaBIM1.2过表达株系Col-035S:BoaBIM1.2中各吲哚族芥子油苷组分含量都显着高于野生型。与野生型拟南芥相比,突变体bim123中吲哚族芥子油苷的重要调节基因At MYB51及合成基因CYP79B2、CYP79B3、CYP83B1、CYP81F2、SUR1表达量均显着下降,而BoaBIM1过表达植株中则显着升高。说明在拟南芥中BIM1对吲哚族芥子油苷途径相关的基因有正向调控作用。染色体免疫共沉淀实验结果表明,BIM1能够直接结合到吲哚族芥子油苷合成基因CYP79B2、CYP79B3、CYP83B1、CYP81F2启动子的E-box上发挥作用。综上所述,本论文在芥蓝中揭示了BoaMYB51转录调控吲哚族芥子油苷合成的机制,并发现其正向调控芥蓝对黑斑病的抗性;筛选到BoaMYB51的互作蛋白——bHLH类转录因子BoaBIM1,发现BoaMYB51和BoaBIM1可能形成蛋白复合体,共同转录调控吲哚族芥子油苷相关基因的表达。本研究不仅在理论上丰富了芸薹属蔬菜中吲哚族芥子油苷的代谢调控网络和生物学功能,也为芸薹属蔬菜重要真菌病害黑斑病的控制提供了新的策略。
黄静静[2]（2021）在《Ogura CMS青花菜育性恢复材料的创制及其遗传背景解析》文中提出Ogura CMS雄性不育是青花菜制种中应用最广泛的不育系类型,但是该应用也严重限制了对优良材料的再利用,突破Ogura CMS技术限制,获得优良育性恢复材料对提升我国青花菜育种水平和资源收集具有重大意义。本研究以含有育性恢复基因Rfo的芥蓝中间材料14Y12（甘蓝BC1代育性恢复单株）为亲本,通过回交转育途径将Rfo基因导入6份优良Ogura CMS青花菜中,同时利用小孢子培养和遗传转化技术获得育性恢复DH系和Rfo阳性单株。主要研究结果如下:1.回交转育途径获得Rfo阳性单株及其遗传背景分析。由芥蓝中间材料14Y12与青花菜17B1253、18QB693杂交获得育性恢复株系18B592和19B711;18B592-1与18-NH（耐寒优秀）、18-YX（炎秀）、18BS-1、18BS36、18T2B2、18B1023杂交获得F1代;19B711-1与19Q雅翠91、19Q喜迎门、19Q国王1号杂交获得F1-2代;18B592-1与F1代Rfo阳性株回交获得BC1代。经细胞学观察,F1代Rfo阳性株花粉活力存在显着差异,变异范围为50%～70%;减数分裂后期有染色体不均等分裂和染色体丢失的异常现象;倍性鉴定表明,F1代Rfo阳性株中11份为二倍体,占总体比例78.57%,3份为介于三倍体和四倍体间倍性,占总体比例21.43%。遗传背景分析表明,在遗传相似系数0.50处,芥蓝中间材料14Y12、青花菜17B1253及F1代转育株可分为两大类,F1代转育株与芥蓝中间材料14Y12的遗传相似系数为0.24～0.88。其中19B809-8与青花菜的遗传相似系数为0.76,可作为Ogura CMS青花菜育性恢复的转育亲本材料。BC1代Rfo阳性单株花器官正常,花粉活力较高（大于70%）,Rfo基因传递效率为14.29%～55.56%,农艺性状偏向青花菜且遗传分离明显。综合农艺性状、细胞学和遗传背景,在遗传相似系数0.60出,Rfo回交转育后代48个Rfo阳性株可分为五大类,其中20B826-2与18B592-1的遗传相似系数为0.66,与青花菜B6的遗传相似系数为0.52,株型近青花菜,为Ogura CMS青花菜后代利用提供了直接恢复材料。2.小孢子培养途径创制育性恢复材料及其遗传背景分析。对青花菜18QB693、育性恢复株系19B711和F1代Rfo阳性株进行小孢子培养。小孢子Rfo阳性单株在叶型、花蕾大小、花柱性状遗传分离显着,有二倍体和四倍性,获得了B693-2、B693-3、B711-1-5重要育性恢复系材料,构建了小孢子Ogura CMS育性恢复技术体系。遗传背景分析表明,小孢子单株B693-2、B693-3与青花菜20B724-1遗传相似系数为0.73,与青花菜遗传背景最近;小孢子单株B711-1-5-1与芥蓝遗传相似系数为0.63,与芥蓝遗传背景最近,可进行优良Ogura CMS青花菜资源创新与利用。3.转基因技术途径获得Rfo阳性单株。对Ogura CMS青花菜优良资源18-NH、18-YX进行转化研究,将萝卜Rfo基因插入p BWA（V）BII载体骨架构建p BWA（V）BII-Rfo表达载体,采用冻融法将重组质粒转入根癌农杆菌菌株EHA105中,使用农杆菌介导法获得转基因植株。经鉴定获得46株Rfo阳性株,定植后目前有33株表现出无花粉,为假阳性株,其余转基因阳性株有待进一步观察和鉴定。
刘旭垚[3]（2020）在《适合抗根肿病研究的大白菜遗传转化体系的构建》文中进行了进一步梳理大白菜（Brassica rapa L.ssp.pekinensis）属于十字花科芸薹属芸薹种的蔬菜作物,由于其含有丰富的营养物质如:粗纤维、蛋白质、多种矿物质以及多种维生素,得以在中国乃至亚洲广受欢迎与喜爱。因此,大白菜在中国乃至亚洲都有广泛的种植面积和供需市场,是我国最受国民喜爱的蔬菜之一。但大白菜却深受根肿病的侵害,严重影响了大白菜的产量。随着抗病相关基因陆续被挖掘,大多数抗根肿病基因的功能还没被验证,究其原因主要是受限于大白菜抗根肿病相关基因研究的遗传转化体系尚未建立完全。大白菜的遗传转化体系的建立已有一些报道,但由于基因型对大白菜遗传转化影响较大,不同大白菜品种其遗传转化效率都不尽相同,本文重点筛选了大白菜根肿病抗/感材料,并对其中再生能力较强的材料进行了遗传转化体系优化的系统研究,获得了较为稳定的转化效率较高的大白菜遗传转化体系,为后续抗病基因的功能验证提供了重要的技术支持。得到如下结果:1.为进行遗传转化体系的基因型筛选,我们调查了九个对根肿病有不同抗性的大白菜品种的再生能力,结果发现,易感根肿病品种‘SN157’的离体再生分化率最高,达到89.2%。2.为探索高效的大白菜离体再生体系,我们以‘SN157’为试材,探索了带柄子叶和下胚轴两种外植体类型、以3-7 d大的无菌幼苗筛选植物苗龄、并分别以0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/L等不同配比的NAA与TDZ组合优化了外源激素浓度。结果表明:以5 d苗龄的带柄子叶大白菜品种‘SN157’为外植体,添加外源激素NAA 0.5 mg/L+TDZ 0.5mg/L的培养基,为较佳的大白菜离体再生体系,植物材料大白菜‘SN157’的不定芽分化率达到了45%以上。3.在优化的大白菜离体再生体系的基础上,对遗传转化体系进行探讨。分别以OD600=0.5、0.8、1.2筛选用于侵染植物材料外植体的农杆菌菌液浓度,结果发现:OD600=0.5的农杆菌菌液浓度时污染率低,而不定芽诱导率较高,约为74.23%;以OD600=0.5的农杆菌菌液侵染带柄子叶后,用含有0、100、200、300、400、500 mg/L不同特美汀（Tim）抗生素的培养基进行培养,筛选合适的抗生素的浓度。结果发现,200 mg/L的特美汀（Tim）也表现出较高的抗性,不定芽率也最高,约为71.33%。4.综上所述,较佳的大白菜遗传转化体系为:以大白菜品种‘SN157’为植物材料,不经过预培养阶段,5 d苗龄的带柄子叶为外植体,使用OD600=0.5的农杆菌菌液侵染外植体,再转入200 mg/L抗生素特美汀浓度的分化培养基进行分化培养。经过继代培养得到足够大的植株时,进行生根培养。以上有利条件的筛选,提高了以农杆菌为介导的大白菜遗传转化体系建立的效率,并得到了重复试验的验证。5.对得到的转基因植株进行PCR检测、GFP检测和q RT-PCR检测,均得到转基因阳性验证,表明成功建立了高效稳定的大白菜遗传转化体系并成功获得了转基因植株,平均转化率约为2.13%。
姜明亮[4]（2020）在《芸薹种孤基因的鉴定及其转基因库的构建和评价》文中研究说明孤基因（Orphan genes）和之前已经鉴定出来的基因没有显着序列相似性,广泛存在于各种生物中。孤基因被证实参与物质代谢、响应生物和非生物胁迫、影响物种特异性进化进程和物种特异性性状,并且在某些组织、器官或发育时期中表现出高度特异性。随着测序技术不断升级,许多物种的遗传信息被揭示,学者对孤基因的研究高度重视。白菜及其芸薹属内其他基因组信息的释放与更新为白菜孤基因鉴定提供了重要前提。本研究利用白菜参考基因组首次对孤基因进行筛选和鉴定,对孤基因类别、基因特征、特异性验证和表达模式进行了系统分析;在拟南芥中构建了芸薹种孤基因过表达转基因库,全面调查转基因植株表型;筛选与胁迫响应、可溶性糖含量变异的转基因植株;并以其中一个转基因植株为例,初步探索孤基因影响可溶性糖变异的作用机制。本研究为深入研究芸薹种孤基因功能奠定良好基础,同时为芸薹种作物遗传改良提供良好材料与基因源。主要研究结果如下:1.孤基因筛选及分类本研究首次系统地对白菜基因组（v2.5）中的孤基因进行筛选,鉴定到1540个芸薹属特异基因（Brassica-specific genes,BSGs）、1824个十字花科特异基因（Cruciferae-specific genes,CSGs）和45462个进化保守基因（evolutionary-conserved genes,ECGs）。BSGs和CSGs相比于ECGs具有更少数量的多外显子基因、更高的GC含量和更短的基因长度。对BSGs进一步分类获得529个Real A subgenome-specific、474个A subgenome-specific、130个A/B subgenome-specific、229个A/C subgenome-specific和178个A/B/C subgenome-specific类型孤基因。2.孤基因验证利用51份来自芸薹属和十字花科的纯合自交材料对529个Real A subgenome-specific类型BSGs中的145个进行PCR验证。结果表明145个BSGs不存在于野生型拟南芥中,52个BSGs在白菜参考基因组测序材料‘Chiifu’中被成功扩增。用芸薹属6个基因组49份材料对这52个BSGs进行验证,表明A/B/C subgenome-specific类型占比最多,Real A subgenome-specific类型占比最少。3.孤基因表达模式分析利用重新组装的转录组数据对1540个BSGs进行表达验证,结果发现73个BSGs在大白菜不同组织中存在表达,180个BSGs在根肿菌处理后的大白菜中表达。对52个在‘Chiifu’中成功验证的Real A subgenome-specific类型BSGs进行半定量PCR验证,结果表明20个BSGs在大白菜不同发育阶段或不同组织中存在表达;41个基因在根肿菌侵染10天的易感病大白菜材料中存在表达,且39个为上调表达。BSGs表现出组织、器官和时期特异性表达,且一些基因能被根肿菌诱导。4.芸薹种孤基因转基因库构建利用浸花法将128个芸薹种孤基因成功转化到拟南芥中,构建了芸薹种孤基因过表达转基因库,并将这些基因命名为Brassica rapa Orphan Genes（BrOGs）。在DNA和表达水平上对随机选择的10个拟南芥转基因植株进行验证,结果表明转基因植株中基因和编码序列都能成功扩增,测序结果进一步验证了转基因的正确性,且野生型中未出现目的条带。5.芸薹种孤基因转基因植株表型调查对转基因库T2代纯合植株表型进行系统调查,结果表明73%的BrGOsOE转基因植株存在表型变异,表型包括叶形、开花时间、茎高、莲座半径、叶色、角果长度和角果种子数等。近50%的转基因植株表现为延迟开花,且这些转基因植株附带着许多其他表型变异。转基因植株叶形变化包括波状叶、锯齿状边缘、多毛叶、向上或向下弯曲的叶片和莲座叶增多等,表明这些转基因植株叶形与大白菜叶片形状有明显相关性。6.胁迫响应转基因植株的筛选随机选择无显着变异表型BrOGsOE转基因植株中的24个进行胁迫处理,包括病菌（Pseudomonas syringae pv.tomato（Pst）strain DC3000）胁迫,盐胁迫与热胁迫。结果表明3个转基因植株对Pst DC3000的侵染具有抗性,转基因植株中检测到高转录水平的AtPR1和更少的细菌数量;12个转基因植株对盐胁迫不敏感,5个转基因植株表现为盐敏感,7个转基因植株表现出较强耐盐性;11个转基因植株对热胁迫响应与野生型无显着差异,13个转基因植株在热胁迫下存活率显着降低。7.可溶性糖变异转基因植株的筛选随机选择43个BrOGsOE转基因植株进行了可溶性糖含量分析。结果表明42个转基因植株的可溶性糖含量出现不同程度变化,其中果糖、葡萄糖、蔗糖和总可溶性糖含量显着增加的转基因植株分别有17、29、20和34个,含量显着下降的转基因植株分别有4、1、10和1个,含量未出现明显变化的转基因植株分别有22、13、13和8个。8.BrOG1的功能分析利用CRISPR/Cas9技术对BrOG1A（BraA08002322）及其高度同源基因BrOG1B（BraSca000221）进行敲除,获得‘brog1’纯合转基因植株。T2代‘brog1’转基因植株和野生型‘GT-24’无明显表型变异,‘BrOG1AOE’转基因植株和拟南芥野生型无显着表型差异。‘BrOG1AOE’转基因植株的Fru、Glc和总可溶性糖含量显着增加,Suc含量显着减少;‘brog1’转基因植株中Fru、Glc和总可溶性糖含量相对于野生型均显着降低,Suc含量显着增加。‘BrOG1AOE’突变体SUS活性和AtSUSs表达相对于WT均显着下降、INV活性无显着差异;‘brog1’转基因植株的INV活性与野生型无显着差异,而SUS活性显着高于野生型,BrSUS1b、BrSUS3和BrSUS5的表达相对于野生型显着增加。结果证实‘brog1’转基因植株互补了‘BrOG1AOE’突变体表型,表明BrOG1可能以依赖于SUS的方式影响可溶性糖代谢。
刘保利[5]（2020）在《CRISPR/Cas9系统在甘蓝中的应用及单碱基编辑器VQR-BE3在烟草中的初步研究》文中研究表明甘蓝（Brassica oleracea L.）是十字花科芸薹属的二年生蔬菜作物,是我国重要的秋冬季蔬菜作物之一。目前,在甘蓝类蔬菜雄性不育杂交育种中,几乎完全使用单一的ogura CMS细胞质不育资源,该现状形成了甘蓝类蔬菜胞质成分的遗传脆弱性,存在较大的遗传风险。另外,针对甘蓝类蔬菜ogura CMS细胞质不育利用基因工程或远缘杂交方式已获得恢复系,导致基于ogura CMS细胞质不育的种质资源技术保护被打破,优异种质资源流失的可能性加大。因此,针对上述问题,有必要挖掘或创制新的甘蓝类蔬菜CMS细胞质雄性不育资源投入甘蓝杂种优势育种。另外,在甘蓝类蔬菜生产中,霜霉病、软腐病、菌核病、灰霉病等病害时有发生。加上植株叶片的衰老使上述病害的发生以及危害程度被进一步加剧。因此,针对甘蓝抗病防御系统以及衰老相关基因进行协同改良,有望实现甘蓝对多种病害的水平抗性。自然存在的细胞质雄性不育性状大多是由于线粒体基因组异常造成的。MSH1基因是维持线粒体基因组稳定性的重要基因,在拟南芥、烟草和番茄中均报道了该基因的缺失使植物线粒体基因组紊乱而出现雄性不育现象。DMR6（霜霉病抗性6）基因属于病原体易感性相关基因,其编码的蛋白参与了病原体-植物相容机制,对植物的病原体防御起负作用,在拟南芥和番茄中报道了DMR6的缺失赋予植物对多种病原体的水平抗性。SGR/HG基因作为调控叶绿素降解过程的相关基因,其编码的脱镁螯合酶可从游离叶绿素和叶绿素复合物中提取镁,参与叶绿素降解过程。水稻和白菜中发现SGR基因的缺陷,使得植物叶绿素分解途径受阻,导致植物出现滞绿、耐衰老表型。CRISPR/Cas9基因编辑技术通过sgRNA引导Cas9蛋白对基因组的靶位点进行准确切割并激活NHEJ修复途径,造成靶位点碱基的缺失、替换和插入,成为目前创制农作物突变体的理想工具,但是该系统无法实现目标基因的精确编辑。在CRISPR/Cas9技术的基础上发展而来的单碱基编辑技术,利用脱氨酶活性可在基因组的指定位置上进行精确的单个碱基的替换。VQR-BE3是在BE3的基础上用VQR代替原SpCas9形成的单碱基编辑系统,PAM识别序列为NGA,可以将编辑窗口中的碱基C替换为碱基T。该系统对于拓宽植物基因编辑的范围,实现多性状的堆叠具有重要的价值。本实验利用CRISPR/Cas9技术敲除与线粒体基因稳定性相关的基因BoMSH1和自交不亲和关键基因BoSRK;建立基于表型辅助筛选的CRISPR/Cas9基因编辑系统,针对甘蓝抗病相关基因BoDMR6以及叶片滞绿基因BoHG进行敲除,获得相应的甘蓝突变材料。另外,同时直接将一个在人类细胞中成功实现碱基编辑的VQR-BE3碱基编辑器应用于模式植物烟草,检测其在缺少植物密码子优化的情况下的单碱基编辑效率,为能否将该单碱基编辑器直接应用于后续的甘蓝基因突变奠定基础。本实验结果如下:1.构建甘蓝BoMSH1、Bo SRK基因的CRISPR/Cas9双敲除载体pCas-tBoMSH1-ABCD/tBoSRK-ABCD,通过农杆菌介导的侵染法转化甘蓝自交不亲和系F416,获得转基因植株34株。经突变分析发现,BoMSH1基因的突变频率是2.94%,而BoSRK基因的突变频率为81.82%,双基因的突变频率为2.41%。本试验仅获得1株msh/srk双突变体,通过单克隆测序发现该植株的BoMSH1基因和BoSRK基因均为杂合突变,而仅有srk突变体中有4株为纯合突变。与野生型F416对照株相比,msh1/srk突变植株的叶边缘呈锯齿状。花粉活力检测结果显示,msh1/srk突变植株的花粉活力与野生型基本相同。msh1/srk突变植株蕾期和花期自交形成的种荚在初期可以正常的伸长生长,但后期干瘪不膨大,内部胚胎不发育,无法获得后代种子,其原因有待于进一步研究。2.构建BoDMR6、BoHG基因的甘蓝敲除载体pCas-MC-tBoDMR6-ABC/tBoHG-ABCD,MYB和mCherry基因为表型辅助筛选基因。通过农杆菌介导的侵染法转化自交不亲和的甘蓝F416,获得12株具有紫红色表型的甘蓝转基因幼苗。经突变分析发现,BoDMR6基因的突变频率是0%,而BoHG基因的突变频率为25%。仅获得3株甘hg突变体,其中1株为纯合突变,其余为杂合突变。3.构建烟草NtPDS基因的VQR-BE3单碱基编辑载体pCA-VQR-BE3-tNtPDS-ABCD,经农杆菌转化法获得41株转基因烟草。通过测序发现所有转基因烟草的NtPDS基因各靶位点均未发生单碱基C-T替换,碱基替换效率为0%。为简便转基因阳性植株的筛选,检测是否靶向位点影响VQR-BE3的碱基替换率,选取3个新的NtPDS基因靶向位点,构建了基于MYB色素基因辅助筛选的VQR-BE3单碱基编辑载体pCA-VQR-BE3-MYB-tNtPDS-EFG,经农杆菌侵染转化和标记基因辅助筛选获得23株呈紫红色的转基因烟草植株。经测序检测发现,23株转基因烟草中NtPDS基因各靶位点均未检测到相应的C-T替换,碱基替换效率仍为0%。推测本研究中所采用的VQR-BE3单碱基编辑系统未能成功实现烟草C-T碱基替换的原因可能与缺少植物密码子偏好性优化、在5’端缺少核定位信息等有关,详细的原因有待进一步研究。
王小荟[6]（2018）在《黄瓜白粉病和霜霉病相关感病基因遗传转化与功能验证》文中进行了进一步梳理在黄瓜（Cucumis sativus L.）生产中,白粉病和霜霉病是两种严重的病害。种植抗病品种是控制白粉病和霜霉病最经济有效的方法。一直以来,国内外研究重点主要集中在对抗性遗传规律的研究,然而对感病基因（Susceptible Genes）及感病机理的研究有限。实践证明,对感病基因的研究为植物抗病育种开辟了新的思路。本实验室与荷兰瓦赫宁根大学植物育种系合作,根据已报道的拟南芥Mlo、Pmr和Dmr基因序列,利用黄瓜全基因组序列信息,通过同源序列比对寻找到黄瓜中潜在的白粉病和霜霉病候选感病基因,构建白粉病感病基因CAD1（Csa4M332620）、PMR4-9（Csa6M128000）和霜霉病候选感病基因DMR1（Csa7M025730）、DMR6-2（Csa5M146870）的RNAi表达载体,对感病基因CAD1、PMR4-9和DMR1构建了CRISPR载体,以农杆菌介导的遗传转化方法将两种载体转导黄瓜植株,验证了四个候选基因的功能,具体结果如下:1、通过对同一目的基因的RNAi载体和CRISPR载体再生频率的比较分析,每个目的基因在两种载体上的再生能力差异不大,RNAi载体较CRISPR载体容易得到再生芽,从而得到更多的再生植株。2、采用农杆菌转化方法将RNAi载体和CRISPR载体转导黄瓜植株,共得到189株T0代转基因植株,其中,RNAi载体转基因苗共166株;CRISPR载体转基因苗共23株。3、利用根癌农杆菌介导法将白粉病候选感病基因CAD1和PMR4-9的RNAi载体转导黄瓜,经驯化培养分别得到CAD1的转基因植株49株、PMR4-9转基因植株32株。经PCR分子检测、田间抗白粉病抗病性调查和荧光定量表达分析,最终获得具有白粉病抗性的CAD1转基因植株12株,具有白粉病抗性的PMR4-9转基因植株7株。4、利用根癌农杆菌介导法将候选霜霉病感病基因DMR1和DMR6-2的RNAi载体转导黄瓜,经驯化培养分别得到DMR1的转基因植株38株、DMR6-2转基因植株47株。对T0代和T1代转基因植株进行PCR分子检测、田间抗白粉病抗病性调查,DMR1的转基因植株有8个家系具有白粉病抗性,DMR6-2转基因植株有12个家系具有白粉病抗性,证明白粉病与霜霉病有一定的相关性。5、对T1代植株进行田间抗病性调查,发现24个T1代家系的T0代与T1代都抗白粉病,这些家系保持较高的遗传稳定性。6、对霜霉病候选感病基因DMR1、DMR6-2的T1代38个家系进行苗期霜霉病接种试验,结果显示38个家系中有9个家系对霜霉病有很强的抵抗力,且这些家系大部分植株保持抗病性。9个家系中有5个家系的T0代植株经q RT-PCR分析表达量下调,这5个家系是具有稳定遗传的黄瓜抗霜霉病的新材料。
谭国飞[7]（2017）在《芹菜花青素和芹菜素的代谢机理研究》文中研究说明芹菜（Apium graveolens L.）,为伞形科（Apiaceae）二年生草本植物,是世界上重要的叶菜类蔬菜作物之一。芹菜主要食用部位是幼嫩的叶片及其叶柄。叶用芹菜按照芹菜叶柄颜色,可划分为白色、绿色、浅黄色、红色和紫色芹菜。富含花青素的农产品,具有良好的食用价值和经济价值。因此,研究和培育紫色芹菜具有重要的意义。本论文从南京地方品种‘六合黄心芹’中,筛选到紫色芹菜材料（命名为‘南选六合紫芹’）。利用人工自交和杂交的方法,分别对紫色芹菜进行种质提纯和紫色性状遗传规律研究;对紫色芹菜花青素和芹菜素合成代谢途径相关基因,进行基因序列的组装、克隆和鉴定;利用转基因方法进一步对控制紫色性状的关键基因Ag3GT和芹菜素合成关键基因AgFNS,进行转基因功能验证。具体研究内容和结果如下:1.从南京地方品种‘六合黄心芹’中,发现一株具有紫色花青素积累的芹菜植株。通过连续自交的方法,获得纯合的紫色芹菜材料,命名为‘南选六合紫芹’。将获得的紫色芹菜材料与非紫色芹菜品种‘六合黄心芹’和‘津南实芹’杂交,获得F1代和F2代种子。结果表明紫色芹菜的紫色性状为单基因控制的紫色性状。利用紫外分光光度计和高效液相色谱,对‘南选六合紫芹’叶柄的花青素进行鉴定。结果表明紫色芹菜中的花青素物质主要为矢车菊类型花青素。2.利用‘六合黄心芹’和‘白芹,为材料,研究芹菜组培相关因素,建立高效芹菜组培体系。结果表明,芹菜种子用20%次氯酸钠处理30 min后,感染率为0.1%,芹菜种子发芽所需时间缩短。1/2MS、MS、1/2 B5和B5培养基相比,不含任何激素的MS培养基最适合芹菜苗生长。采用下胚轴为组培外植体,结果表明激素浓度为1.5 mg·L-1 IAA和1.0 mg·L-1的6-BA的B5培养基,最适合芹菜愈伤形成和愈伤保存,最大愈伤诱导率为88.2%。在50 μmol×（m2·s）-1的光密度诱导下,每一个愈伤能产生3～7个不定芽,其愈伤分化率为93.5%。在光密度为200～300μmol×（m2·s）-1条件下,芹菜组培苗玻璃化减少,同时芹菜组培苗生有大量的根。该组培方法,获得芹菜组培苗需要45～60 d。3.通过芹菜转录组数据库,对芹菜花青素和芹菜素合成相关基因进行鉴定和拼接,并在‘南选六合紫芹’中进行克隆。AgPAL、AgC4H、AgCHS、AgCHI、AgFNS、AgF3H、AgF3’H、AgDFR、AgANS和Ag3GT基因被成功克隆,且在进化过程中与其它伞形科物种具有高度的相似性。荧光定量PCR分析表明,AgPAL、AgC4H、AgCHS、AgCHI、AgF3H、AgF3’H、AgDFR、AgANS和Ag3GT基因在紫色芹菜叶柄中的表达水平显着高于‘六合黄心芹’叶柄中的表达量,而AgFNS在‘六合黄心芹’叶柄中的表达量高于在紫色芹菜叶柄中的表达量。4.将克隆得到的花青素合成关键基因Ag3GT转化到‘六合黄心芹’中,获得转基因植株。结果表明过表达Ag3GT基因,能使‘六合黄心芹’植株叶柄积累花青素。AgPAL、AgC4H、AgCHS、AgCHI、AgF3H、AgF3’H、AgDFR 和 AgANS基因,在转Ag3GT基因植株的叶柄中,表达量高于非转基因植株叶柄。但在转Ag3GT基因植株叶柄中,芹菜素的含量和AgFNS基因的表达水平,却低于非转基因芹菜叶柄。5.将克隆得到的芹菜素合成关键基因AgFNS转化到‘南选六合紫芹’中,获得转基因植株。AgFNS基因在转基因植株中的过表达,使得‘南选六合紫芹’叶柄花青素含量显着下降,芹菜素含量显着升高。荧光定量PCR表明,AgPAL、AgC4H、AgCHS和AgCHI基因,在转AgFNS基因植株叶柄中表达上调,AgF3H、AgF3’H、AgDFR、AgANS和Ag3GT基因,在转基因植株叶柄中表达下调。
蒋春号[8]（2016）在《蜡质芽胞杆菌AR156诱导植物对丁香假单胞菌及南方根结线虫抗性机理研究》文中指出蜡质芽胞杆菌AR156（缩写为Bc AR156）是本实验室前期从森林树木根围土壤中分离的一株植物根围促生细菌（PGPR）,可广谱性防治茄劳尔氏菌引起的蔬菜青枯病、辣椒疫霉引起的疫病、尖孢镰刀菌引起的枯萎病和南方根结线虫引起的根结线虫病。目前该菌株已经获得相关专利,完成全基因组解析,获得防治番茄根结线虫病害的生物农药正式登记证。前期研究发现Bc AR156能够诱导拟南芥产生对丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonassyringae pv.tomato,以下简称Pst）DC3000系统抗性;机理研究表明,Bc AR156诱导拟南芥产生的系统抗性是通过同时激活水杨酸以及茉莉酸/乙烯两条信号通路,同时具有NPR1依赖性。为什么Bc AR156能同时激活拟南芥体内这两条信号通路,而其他生防因子如荧光假单胞菌、部分芽胞杆菌只能激活其中的某一条信号途径?Bc AR156如何被植物体识别,从而激活植物体的系统抗性?在Bc AR156诱导抗性过程中植物内源small RNA的调控作用是什么?除了上述广谱抗病机理外,既然根结线虫与其他病原物的致病机理完全不同,Bc AR156又是如何高效特异性地防治蔬菜根结线虫病害的?这些关于Bc AR156的生防机理问题的解决,将能更有效地推广使用生物农药活菌制剂,推动微生物农药产业的发展。本研究以Bc AR156为生防菌,以拟南芥、番茄为模式植物,以Pst DC3000、南方根结线虫为模式病原,进行三者互作研究,探究生防菌防病机理。本研究首先从转录因子角度出发,清楚地解析了 Bc AR156诱导抗病性机理,最终筛选发现Bc AR156分泌的胞外多糖（EPS）能够作为一种微生物相关分子模式（MAMPs）,被植物体表面模式识别受体识别,进而激活植物体自身防卫反应;同时发现植物内源miRNA:miR472和miR825/825*也参与调控Bc AR156诱导系统抗性过程。针对根结线虫的特异性生防机理研究发现,Bc AR156一方面能够改变番茄根系结构,促进番茄根系的快速成熟,从而降低根结线虫对番茄根系的侵染概率;另一方面Bc AR156还能抑制根结线虫某些效应因子编码基因的表达,降低其对番茄的致病力,最终达到高效防治番茄根结线虫的效果。1.转录因子WRKY70和WRKY11在调控蜡质芽胞杆菌AR156诱导系统抗性过程中的作用机理研究以拟南芥为模式植物探寻转录因子WRKY70和WRKY11在Bc AR156诱导系统抗性过程中所起作用。结果表明,Bc AR156处理拟南芥后,能够显着提升植物体内转录因子WRKY70的表达量,同时显着抑制WRKY11的表达。研究还发现转录因子WRKY70和WRKY11为Bc AR156诱导细胞防卫反应以及防卫相关基因的表达所必须。过量表达转录因子WRKY70和WRKY11能够影响Bc AR156诱导拟南芥产生对Pst DC3000的抗性。突变体验证结果显示:Bc AR156诱导抗性的能力在转录因子WRKY70和WRKY11单突变体拟南芥植株中能够保留,但抗性能力略微下降,然而在WRKY70和WRKY11双突变体植株中则完全丧失。以上结果表明,转录因子WRKY70和WRKY11是通过两条不同途径调控Bc AR156诱导系统抗性的,并且这两条途径之间具有协调作用。转录因子WRKY70和WRKY11靶标分析结果表明:WRKY70通过水杨酸信号通路,WRKY11通过茉莉酸信号通路来调控Bc AR156诱导的系统抗性,而且这两条调控通路之间具有NPR1的依赖性。综合上述结果,发现转录因子WRKY70和WRKY11在调控Bc AR156诱导系统抗性过程中起着重要的作用。本研究也是首次从转录因子角度出发,阐明根围有益微生物如何同时激活水杨酸、茉莉酸/乙烯两条信号通路,来诱导寄主植物对病原菌的抗性。2.蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖作为一类MAMPs激活植物系统免疫在诱导系统抗性过程中,植物体对Bc AR156的早期识别起着重要作用。本研究结果表明,Bc AR156分泌的胞外多糖能够诱导拟南芥产生对Pst DC3000的系统抗性;在此过程中,能够提升防卫相关基因PR1、PR2、PR5以及MAPK激酶MPK6的上调表达;另外,也能够激活植物体细胞防卫反应如活性氧爆发、胼胝质沉积以及防卫相关酶活性的提升。基因上位性分析结果显示,Bc AR156胞外多糖仍能够在信号通路突变体jar1、etr1中诱导对Pst DC3000的系统抗性,与野生型Col-0相比,其在突变体jar1、etr1中诱导抗性能力略有降低;在NahG转基因植物以及npr1突变体中,Bc AR156胞外多糖的诱导抗性能力丧失。以上结果表明,Bc AR156胞外多糖诱导的系统抗性依赖MAMPs信号识别和水杨酸信号通路转导,并且具有NPR1依赖性。综上所述,Bc AR156胞外多糖在Bc AR156诱导系统抗性过程中,作为一类MAMPs,发挥着重要的作用。3.Sma11 RNAs在生防菌诱导植物抗病中的调节作用为研究植物内源small RNA在调控植物诱导抗性的机理,本研究利用deep sequencing以及生物信息学技术,筛选获得一些参与调控植物诱导抗性的miRNA。Northern Blot验证试验结果显示,在Bc AR156诱导拟南芥产生对Pst DC3000的抗性过程中,miR472,miR825和miR825*三种miRNA在Bc AR156处理的拟南芥叶片内被显着下调。对上述miRNA靶标预测结果显示,miR472,miR825和miR825*的靶标主要参与植物基础免疫,其中miR825靶标主要一些泛素蛋白连接酶;miR472和miR825*的靶标主要是一些参与ETI途径的R基因。研究发现上述预测的靶基因的表达受到miRNA负向调控。另外,miRNA缺失突变体表现出对病原细菌Pst DC3000的抗性。与此相反,miRNA过表达转基因植株对病原菌更敏感。综上所述,BcAR156通过抑制miR472、miR825和miR825*三种miRNA的表达,引起其靶标基因的上调,从而激活植物体自身的防卫反应,诱使植物产生系统抗性。4.蜡质芽胞杆菌AR156调控植物根系发育防治根结线虫病害的机理研究本研究发现,Bc AR156处理番茄根系能够诱导其结构变化;加速根系的成熟化（如根毛增多,根毛区比例显着增加）,从而降低根结线虫进入植物体内的概率;减少植物根系内根结线虫的虫口数,从而获得防治根结线虫的效果。为探究Bc AR156防治根结线虫的机理,我们从植物根系结构发育角度出发,利用转录组学分析技术,探究Bc AR156改变植物根系结构防治根结线虫的分子机理。转录组结果显示,Bc AR156能够引起植物体内一系列与发育相关基因的表达,其中最为显着的是与脱落酸、乙烯、热激蛋白相关的基因,定量PCR验证结果与预测结果相同。综上所述,Bc AR156能够调控一些与脱落酸、乙烯、热激蛋白相关的基因,来调控植物根系的发育;加速根系的成熟化,进而诱导植物抵抗根结线虫的侵染。5.蜡质芽胞杆菌AR156调控根结线虫效应因子表达防治病害的机理研究研究发现利用Bc AR156预处理植物后接种根结线虫,能够显着降低线虫的侵染,为深入探究其生防机理,本研究利用转录组学分析技术进行研究。结果显示,Bc AR156处理能够抑制根结线虫效应因子编码基因的下调表达;Q-RT-PCR验证发现有11个效应因子的表达受到Bc AR156的抑制。本研究首次发现,生防菌能够通过抑制根结线虫效应因子的表达而降低根结线虫的致病力,以达到防治目的。
高丽,崔崇士,屈淑平[9]（2010）在《白菜类蔬菜转基因研究进展》文中指出综述了白菜类蔬菜的抗虫、抗病、抗逆、抗除草剂、雄性不育、品质改良和筛选标记转基因育种研究现状,分析了转基因白菜研究中存在的问题,并指出未来一段时间对白菜类蔬菜转基因的研究重点仍会停留在建立高频再生体系和摸索其他有效方法上,转基因白菜类蔬菜的基因漂移和对其他非靶生物的影响以及对人类健康有无影响也会是热点研究问题。
韩伟,刘娥娥,王亚琴,何晓明[10]（2010）在《瓜类蔬菜转基因研究进展》文中指出综述了瓜类蔬菜再生系统的建立、转基因的方法以及目的基因的转化和表达的研究进展,讨论了瓜类蔬菜转基因存在的问题和研究前景。
二、蔬菜转基因研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蔬菜转基因研究进展（论文提纲范文）
（1）转录因子BoaMYB51和BoaBIM1调控芥蓝吲哚族芥子油苷代谢机理及其功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 芥子油苷生物合成和代谢调控研究进展 |
| 1.1.1 芥子油苷的生物合成与降解 |
| 1.1.2 芥子油苷的代谢调控网络 |
| 1.1.3 芥子油苷在调节植物抗性中的作用机制研究进展 |
| 1.2 芸薹属蔬菜中芥子油苷代谢及功能研究进展 |
| 1.2.1 芥子油苷对芸薹属蔬菜风味的贡献 |
| 1.2.2 芥子油苷在芸薹属蔬菜抗性中的作用研究进展 |
| 1.2.3 化学调控和基因工程调节芸薹属蔬菜中芥子油苷代谢研究进展 |
| 1.3 黑斑病病原真菌及其致病机制研究进展 |
| 1.3.1 黑斑病病原真菌的种类及生物学特性 |
| 1.3.2 黑斑病病原真菌的致病机理 |
| 1.3.3 芸薹属蔬菜对黑斑病病原真菌抗性机制研究进展 |
| 1.4 R2R3-MYB类转录因子及其功能研究进展 |
| 1.4.1 MYB转录因子的结构 |
| 1.4.2 R2R3-MYB类转录因子功能研究进展 |
| 1.5 bHLH类转录因子BIM1研究进展 |
| 1.6 立题依据和研究目标 |
| 2 BoaMYB51在芥蓝黑斑病抗性中的作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 菌株与载体 |
| 2.2.3 生物信息学分析网站 |
| 2.2.4 相关生化试剂 |
| 2.2.5 芥蓝培养 |
| 2.2.6 VIGS材料构建 |
| 2.2.7 芸薹链格孢的培养和接种 |
| 2.2.8 RNA的提取和表达分析 |
| 2.2.9 芥子油苷的提取和含量分析 |
| 2.2.10 数据统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 BoaMYB51-VIGS芥蓝植株黑斑病抗性分析 |
| 2.3.2 BoaMYB51-VIGS芥蓝植株IGS含量分析 |
| 2.3.3 BoaMYB51-VIGS芥蓝植株IGS合成基因表达分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 BoaMYB51正向调控芥蓝对黑斑病的抗性 |
| 2.4.2 BoaMYB51在芥蓝IGS合成中是重要的转录因子 |
| 3 BoaMYB51在芥蓝中IGS生物合成中的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 植物材料 |
| 3.2.2 相关生化试剂 |
| 3.2.3 芥蓝培养 |
| 3.2.4 载体构建 |
| 3.2.5 芥蓝的遗传转化 |
| 3.2.6 RNA的提取和表达分析 |
| 3.2.7 芥蓝基因组DNA的提取 |
| 3.2.8 芥子油苷提取和分析 |
| 3.2.9 数据统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 芥蓝遗传转化过表达植株的获得和鉴定 |
| 3.3.2 CRISPR/Cas9系统产生BoaMYB51基因编辑材料 |
| 3.3.3 BoaMYB51过表达材料中黑斑病抗性分析 |
| 3.3.4 BoaMYB51过表达材料中IGS组分和含量分析 |
| 3.3.5 BoaMYB51过表达材料中IGS合成基因表达分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 4 酵母双杂交系统筛选BoaMYB51互作蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料及生化试剂 |
| 4.2.2 酵母自激活验证 |
| 4.2.3 酵母双杂交筛选芥蓝cDNA文库 |
| 4.2.4 酵母双杂交点对点验证蛋白互作 |
| 4.2.5 蛋白免疫印迹(western blot) |
| 4.2.6 原核蛋白诱导表达和蛋白纯化 |
| 4.2.7 Pull-down验证蛋白互作 |
| 4.2.8 烟草培养 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 BoaMYB51的转录激活域的确定 |
| 4.3.2 酵母双杂交筛选BoaMYB51互作蛋白 |
| 4.3.3 BoaMYB51与筛选到蛋白的互作验证 |
| 4.3.4 BoaMYB51与Bol043819的蛋白互作结构域 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 碳末端是BoaMYB51的转录激活区域 |
| 4.4.2 Bol043819可能是IGS生物合成的调控蛋白 |
| 5 芥蓝中bHLH类转录因子BoaBIM1的鉴定与分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 植物材料 |
| 5.2.2 菌株与载体 |
| 5.2.3 生物信息学分析网站及数据库网站 |
| 5.2.4 相关生化试剂 |
| 5.2.5 芥蓝培养 |
| 5.2.6 RNA的提取和表达分析 |
| 5.2.7 芥子油苷的提取和含量分析 |
| 5.2.8 数据统计分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 芥蓝中BoaBIM1的蛋白序列比对 |
| 5.3.2 芥蓝中BoaBIM1的进化分析 |
| 5.3.3 芥蓝中BoaBIM1的亚细胞定位 |
| 5.3.4 芥蓝中BoaBIM1的基因表达分析 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 6 BoaBIM1转录调控IGS生物合成基因表达 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 植物材料 |
| 6.2.2 菌株与载体 |
| 6.2.3 生物信息学分析网站及数据库网站 |
| 6.2.4 相关生化试剂 |
| 6.2.5 芥蓝培养 |
| 6.2.6 VIGS材料构建 |
| 6.2.7 拟南芥转化(浸花法) |
| 6.2.8 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 6.2.9 RNA的提取和表达分析 |
| 6.2.10 芥子油苷的提取和含量分析 |
| 6.2.11 数据统计分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 BoaBIM1-VIGS芥蓝植株中IGS含量分析 |
| 6.3.2 BoaBIM1-VIGS芥蓝植株中IGS合成基因表达分析 |
| 6.3.3 拟南芥BoaBIM1异源过表达植株中IGS含量和相关基因表达分析 |
| 6.3.4 BoaBIM1转录调控IGS生物合成相关基因 |
| 6.3.5 BoaBIM1提高寄主植物对芸薹链格孢的抗性 |
| 6.3.6 BoaBIM1对植物根长有显着的促进作用 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 6.4.1 BoaBIM1正向调控芥蓝中IGS的合成 |
| 6.4.2 BoaBIM1直接转录调控芥蓝中IGS合成基因 |
| 6.4.3 BoaBIM1可能协同促进植物生长与抗性 |
| 7 讨论 |
| 7.1 转录因子MYB51是调控IGS生物合成和改善芸薹属蔬菜抗性的重要靶点 |
| 7.2 bHLH类转录因子BIM1协同促进植物生长与抗性 |
| 7.3 从模式植物中的基础研究到作物中的研究 |
| 7.3.1 模式植物拟南芥的基础研究在作物中的运用 |
| 7.3.2 作物研究中的模式体系 |
| 7.3.3 作物研究潜在的困难 |
| 8 结论、创新点与后续研究展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 后续研究展望 |
| 8.3.1 BoaMYB51基因功能的研究 |
| 8.3.2 BoaBIM1与BoaMYB51蛋白互作调控IGS代谢的分子机制 |
| 8.3.3 BIM1协同调控植物生长与抗性的机制 |
| 8.3.4 BIM1在提高芸薹属蔬菜优质安全高效生产中的应用 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（2）Ogura CMS青花菜育性恢复材料的创制及其遗传背景解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 青花菜起源与引进 |
| 1.2 青花菜育种技术研究 |
| 1.2.1 自交不亲和研究 |
| 1.2.2 雄性不育研究与利用 |
| 1.2.3 小孢子培养技术研究与应用 |
| 1.2.4 转基因技术研究 |
| 1.3 十字花科Ogura胞质雄性不育类型与应用 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 第二章 Rfo育性恢复基因在Ogura CMS青花菜杂交转育后代中的响应 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 育性恢复株系、杂交后代(F_1代)的获得 |
| 2.2.2 Rfo阳性单株分子鉴定 |
| 2.2.3 Rfo阳性单株农艺性状观察 |
| 2.2.4 Ogura CMS青花菜Rfo转育后代花粉活力和染色体表现 |
| 2.2.5 Ogura CMS青花菜Rfo转育后代倍性分析 |
| 2.2.6 Ogura CMS青花菜Rfo转育后代遗传背景分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 远缘杂交创制Ogura CMS恢复材料 |
| 2.3.2 Ogura CMS恢复材料的遗传背景解析 |
| 第三章 F_(1-2)和BC_1阳性后代阳性株的获得及其遗传背景分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 青花菜各世代恢复材料的获得 |
| 3.2.2 各世代Rfo阳性株分子鉴定 |
| 3.2.3 各世代Rfo阳性株农艺性状观察 |
| 3.2.4 Rfo阳性株自交、杂交后花粉管生长观察 |
| 3.2.5 19B711与18B592-1恢复后代优良单株农艺性状观察和花粉活力测定 |
| 3.2.6 19B711与18B592-1恢复后代Rfo阳性株倍性分析 |
| 3.2.7 19B711与18B592-1恢复后代Rfo阳性株遗传背景分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 杂交转育技术在十字花科作物育种中的应用 |
| 3.3.2 Ogura CMS在十字花科芸薹属蔬菜作物中的应用 |
| 第四章 小孢子培养途径获得育性恢复材料DH系及其遗传背景分析 |
| 4.1 试验材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 DH单株的获得 |
| 4.2.2 DH单株育性分析 |
| 4.2.3 DH单株农艺性状观察 |
| 4.2.4 DH单株形态观察和花粉活力测定 |
| 4.2.5 DH单株倍性分析 |
| 4.2.6 DH单株遗传背景分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 小孢子培养在甘蓝类蔬菜材料创新中的应用 |
| 4.3.2 DH材料在分子遗传学中的应用研究 |
| 第五章 转基因途径获得Ogura CMS青花菜Rfo阳性株 |
| 5.1 试验材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 Rfo表达载体启动子PCR扩增与序列分析 |
| 5.2.2 转基因材料的获得和阳性株PCR检测 |
| 5.2.3 Rfo阳性株农艺性状观察 |
| 5.2.4 Rfo阳性株倍性分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 转基因育性恢复材料的创制与研究 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 回交转育途径创制Ogura CMS青花菜恢复材料及其遗传背景分析 |
| 6.2 小孢子培养途径创制Ogura CMS青花菜恢复材料及其遗传背景分析 |
| 6.3 遗传转化途径创制Ogura CMS青花菜恢复材料 |
| 参考文献 |
| 附录A 胚挽救、花粉活力划分、样品制备及电泳检测等 |
| 附录B pBWA(V)BII-Rfo表达载体的启动子序列和Rfo基因序列 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）适合抗根肿病研究的大白菜遗传转化体系的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 前言 |
| 1.1 大白菜抗根肿病研究进展 |
| 1.2 芸薹属植物基因工程技术的研究进展 |
| 1.2.1 芸薹属植物转基因的方法和原理 |
| 1.2.2 芸薹属植物转基因的研究进展 |
| 1.3 芸薹属作物再生体系的研究进展 |
| 1.3.1 再生体系的研究进展 |
| 1.3.2 芸薹属植物离体组织再生的影响因素 |
| 1.4 芸薹属植物的遗传转化的研究进展 |
| 1.4.1 芸薹属植物的遗传转化的意义 |
| 1.4.2 芸薹属植物遗传转化的影响因素 |
| 1.5 大白菜转基因体系的研究现状 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 无菌苗的培养 |
| 2.3 大白菜离体再生体系 |
| 2.3.1 基因型的筛选 |
| 2.3.2 外植体类型的筛选 |
| 2.3.3 苗龄的筛选 |
| 2.3.4 外源激素浓度的筛选 |
| 2.4 p BWA(V)BS-Bra003466-gfp载体构建 |
| 2.5 大白菜离体再生体系 |
| 2.5.1 农杆菌菌液浓度 |
| 2.5.2 农杆菌菌液的制备 |
| 2.5.3 农杆菌菌液的活化 |
| 2.5.4 侵染用农杆菌菌液的制备 |
| 2.5.5 抗生素浓度的筛选 |
| 2.6 大白菜遗传转化体系建立流程 |
| 2.7 转基因植株的鉴定 |
| 2.7.1 PCR检测 |
| 2.7.2 荧光标记GFP鉴定 |
| 2.7.3 荧光定量q RT-PCR检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 大白菜离体再生体系的构建 |
| 3.1.1 基因型对大白菜离体再生体系的影响 |
| 3.1.2 外植体类型对大白菜离体再生体系的影响 |
| 3.1.3 外植体的苗龄对大白菜离体再生体系的影响 |
| 3.1.4 外源激素浓度的筛选 |
| 3.2 目标基因的载体构建 |
| 3.3 大白菜遗传转化体系的构建 |
| 3.3.1 农杆菌菌液浓度 |
| 3.3.2 抗生素的浓度筛选 |
| 3.3.3 优化的大白菜遗传转化流程 |
| 3.4 遗传转化体系的重复性试验 |
| 3.5 转基因植株的鉴定 |
| 3.5.1 PCR检测 |
| 3.5.2 荧光标记GFP观察 |
| 3.5.3 荧光定量q RT-PCR检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 再生体系的影响因素之植物材料的基因型 |
| 4.2 植物材料的外植体类型对再生体系的影响 |
| 4.3 苗龄对大白菜再生体系的影响 |
| 4.4 外源激素浓度组合对再生体系的影响 |
| 4.5 农杆菌菌液浓度对大白菜遗传转化的影响 |
| 4.6 抗生素浓度对大白菜遗传转化的影响 |
| 5 结论 |
| 5.1 大白菜离体再生体系的优化 |
| 5.2 建立稳定高效的大白菜遗传转化体系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）芸薹种孤基因的鉴定及其转基因库的构建和评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 孤基因研究进展 |
| 1.1.1 孤基因起源与进化 |
| 1.1.2 孤基因筛选与鉴定 |
| 1.1.3 孤基因序列特征 |
| 1.1.4 孤基因功能 |
| 1.1.5 孤基因研究面临的挑战 |
| 1.2 反向遗传学在基因功能研究中的应用 |
| 1.2.1 突变体库功能 |
| 1.2.2 突变体库构建方法 |
| 1.2.3 存在问题与展望 |
| 1.3 可溶性糖的生理功能及其代谢途径研究进展 |
| 1.3.1 可溶性糖生理功能 |
| 1.3.2 可溶性糖合成与代谢途径 |
| 1.4 CRISPR/Cas9 在植物中的应用 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas系统成分与工作原理 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9 系统优势 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9 在植物基因编辑中的应用 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 孤基因的筛选及其表达模式 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 基因组数据集和软件 |
| 2.1.2 同源搜索 |
| 2.1.3 孤基因序列特征分析和物理图谱构建 |
| 2.1.4 孤基因验证 |
| 2.1.5 孤基因表达模式分析 |
| 2.1.6 大白菜不同发育阶段样品的采集 |
| 2.1.7 根肿菌处理 |
| 2.1.8 总RNA提取和cDNA合成 |
| 2.1.9 半定量PCR |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 孤基因鉴定 |
| 2.2.2 孤基因序列特征 |
| 2.2.3 孤基因类别 |
| 2.2.4 大白菜不同发育阶段孤基因表达模式 |
| 2.2.5 根肿菌胁迫下孤基因表达模式 |
| 2.2.6 孤基因表达模式综合分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 孤基因筛选和鉴定 |
| 2.3.2 不同类别孤基因序列特征 |
| 2.3.3 孤基因特异性 |
| 2.3.4 孤基因表达模式 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 芸薹种孤基因转基因库构建及表型调查 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料及生长条件 |
| 3.1.2 载体构建和转基因 |
| 3.1.3 转基因植株验证 |
| 3.1.4 转基因植株表型调查 |
| 3.1.5 生物及非生物胁迫处理 |
| 3.1.6 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 转基因库构建 |
| 3.2.2 转基因植株验证 |
| 3.2.3 转基因植株表型特征 |
| 3.2.4 转基因植株对胁迫的响应 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 芸薹种孤基因转基因库的应用 |
| 3.3.2 芸薹种孤基因转基因植株的丰富表型 |
| 3.3.3 芸薹种孤基因对生物和非生物胁迫的响应 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 可溶性糖含量变异转基因植株的筛选 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料和生长条件 |
| 4.1.2 可溶性糖含量测定 |
| 4.1.3 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 拟南芥转基因植株的果糖含量 |
| 4.2.2 拟南芥转基因植株的葡萄糖含量 |
| 4.2.3 拟南芥转基因植株的蔗糖含量 |
| 4.2.4 拟南芥转基因植株的总可溶性糖含量 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 BrOG1 的功能分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料及生长条件 |
| 5.1.2 拟南芥转基因植株‘BrOG1AOE’表型调查 |
| 5.1.3 BrOG1 基因序列分析 |
| 5.1.4 BrOG1 基因编辑载体构建 |
| 5.1.5 基于CRISPR/Cas9 的大白菜遗传转化 |
| 5.1.6 基因编辑植株‘brog1’的鉴定和脱靶效应 |
| 5.1.7 ‘brog1’基因编辑植株的可溶性糖含量和酶活性测定 |
| 5.1.8 可溶性糖代谢相关基因的表达分析 |
| 5.1.9 数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 BrOG1A和 BrOG1B基因的序列特征及验证 |
| 5.2.2 拟南芥‘BrOG1AOE’转基因植株的表型特征 |
| 5.2.3 BrOG1 靶点体外活性 |
| 5.2.4 ‘brog1’转基因植株的获得 |
| 5.2.5 大白菜‘brog1’转基因植株的遗传和脱靶效应 |
| 5.2.6 ‘brog1’突变体互补‘BrOG1AOE’转基因植株表型 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 大白菜CRISPR/Cas9 系统的高效靶向效应 |
| 5.3.2 芸薹种孤基因BrOG1 的功能 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（5）CRISPR/Cas9系统在甘蓝中的应用及单碱基编辑器VQR-BE3在烟草中的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 CRISPR/Cas9 基因编辑技术 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas9 的技术原理与作用机制 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas9 系统的优化 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas9 在植物中的应用 |
| 1.2 单碱基编辑技术 |
| 1.2.1 单碱基编辑技术的发展历程 |
| 1.2.2 单碱基编辑技术的原理及特点 |
| 1.2.3 CBE碱基编辑技术的发展及优化 |
| 1.2.4 CBE碱基编辑技术在植物中的应用 |
| 1.2.5 VQR在 CRISPR/Cas9 及单碱基编辑系统中的应用 |
| 1.3 植物雄性不育育种 |
| 1.3.1 雄性不育概述 |
| 1.3.2 雄性不育类型及遗传机制 |
| 1.3.3 甘蓝类蔬菜雄性不育 |
| 1.3.4 植物细胞质雄性不育基因MSH1的相关研究 |
| 1.4 植物自交不亲和性 |
| 1.5 植物感病相关基因的研究 |
| 1.6 植物滞绿相关基因的研究 |
| 1.7 转基因植物可视标记基因的应用 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究的目的及意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 甘蓝msh1/srk突变材料的创制 |
| 2.2.2 甘蓝dmr6/hg突变材料的创制 |
| 2.2.3 VQR-BE3单碱基编辑系统编辑烟草基因的初步研究 |
| 2.3 技术路线 |
| 第3章 msh1/srk甘蓝突变体的创制 |
| 3.1 试验材料与仪器 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 载体与菌株 |
| 3.1.3 试验试剂 |
| 3.1.4 细菌和植物培养基 |
| 3.1.5 试验溶液 |
| 3.1.6 试验仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 CRISPR/Cas9 敲除载体的构建 |
| 3.2.2 转基因甘蓝植株的获得 |
| 3.2.3 转基因甘蓝植株的突变检测 |
| 3.2.4 甘蓝msh1突变体的形态学观察 |
| 3.2.5 甘蓝msh1突变体的花粉活力鉴定 |
| 3.2.6 甘蓝msh1突变体的自交结籽情况调查 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 p Cas-t Bo SRK-ABCD/t Bo MSH1-ABCD载体构建与验证 |
| 3.3.2 p Cas-t Bo SRK-ABCD/t Bo MSH1-ABCD转基因甘蓝的获得 |
| 3.3.3 p Cas-t Bo SRK-ABCD/t Bo MSH1-ABCD转基因甘蓝PCR鉴定 |
| 3.3.4 p Cas-t Bo SRK-ABCD/t Bo MSH1-ABCD转基因甘蓝突变分析 |
| 3.3.5 甘蓝msh1突变体植株的形态学观察 |
| 3.3.6 甘蓝msh1突变体植株的花粉活力测试 |
| 3.3.7 甘蓝msh1突变体植株的蕾期和花期自交 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 dmr6/hg抗病及耐衰老甘蓝突变体的创制 |
| 4.1 试验材料与仪器 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 载体与菌株 |
| 4.1.3 试验试剂 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.1.5 试验溶液 |
| 4.1.6 试验仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 Cas9敲除载体构建 |
| 4.2.2 转基因甘蓝植株的获得 |
| 4.2.3 转基因甘蓝的突变检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 p Cas-MC-t Bo DMR6-ABC/t Bo HG-ABCD载体构建与验证 |
| 4.3.2 p Cas-MC-t Bo DMR6-ABC/t Bo HG-ABCD转基因甘蓝获得 |
| 4.3.3 p Cas-MC-t Bo DMR6-ABC/t Bo HG-ABCD转基因甘蓝PCR鉴定 |
| 4.3.4 p Cas-MC-t Bo DMR6-ABC/t Bo HG-ABCD转基因甘蓝突变分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 VQR-BE3系统编辑烟草基因的初步研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 菌株与载体 |
| 5.1.3 试验试剂 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.1.5 试验溶液 |
| 5.1.6 试验仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 VQR-BE3碱基编辑载体构建 |
| 5.2.2 转基因烟草植株的获得 |
| 5.2.3 突变检测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 p CA-VQR-BE3-t Nt PDS-ABCD单碱基编辑载体的构建与验证 |
| 5.3.2 p CA-VQR-BE3-t Nt PDS-ABCD介导的转基因烟草植株的获得 |
| 5.3.3 p CA-VQR-BE3-t Nt PDS-ABCD转基因烟草植株的PCR鉴定 |
| 5.3.4 p CA-VQR-BE3-t Nt PDS-ABCD转基因烟草植株的突变分析 |
| 5.3.5 p CA-VQR-BE3-MYB-t Nt PDS-EFG单碱基编辑载体构建与验证 |
| 5.3.6 p CA-VQR-BE3-MYB-t Nt PDS-EFG介导的转基因烟草的获得 |
| 5.3.7 p CA-VQR-BE3-MYB-t Nt PDS-EFG转基因烟草的PCR鉴定 |
| 5.3.8 p CA-VQR-BE3-MYB-t Nt PDS-EFG转基因烟草的突变分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 结论及后续研究 |
| 6.1 总结 |
| 6.1.1 获得甘蓝msh1/srk突变材料 |
| 6.1.2 获得甘蓝hg突变材料 |
| 6.1.3 VQR-BE3系统编辑烟草基因的初步研究 |
| 6.2 后续研究 |
| 6.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 各引物序列 |
| 附录2 烟草NtPDS基因的基因组序列 |
| 附录3 BoDMR6基因组序列 |
| 附录4 Bo MSH1、Bo SRK及 Bo HG各基因突变详情 |
| 附录5 VQR-BE3核酸序列 |
| 致谢 |
（6）黄瓜白粉病和霜霉病相关感病基因遗传转化与功能验证（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 英文缩略表 |
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 黄瓜白粉病和霜霉病的研究概况 |
| 1.1.1 黄瓜白粉病的研究进展 |
| 1.1.1.1 白粉病菌及其特点 |
| 1.1.1.2 黄瓜白粉病症状及发病规律 |
| 1.1.1.3 黄瓜白粉病抗性遗传规律 |
| 1.1.2 黄瓜霜霉病的研究进展 |
| 1.1.2.1 霜霉病菌及其特点 |
| 1.1.2.2 黄瓜霜霉病为害症状和发病特点 |
| 1.1.2.3 黄瓜霜霉病抗病性鉴定方法 |
| 1.1.2.4 黄瓜霜霉病抗性遗传规律 |
| 1.1.3 黄瓜白粉病与霜霉病的相关性 |
| 1.2 植物中的感病基因 |
| 1.2.1 感病基因的介绍 |
| 1.2.2 黄瓜感病基因的研究 |
| 1.3 黄瓜遗传转化研究进展 |
| 1.4 CRISPR/Cas系统的研究进展 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas9 系统 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9 的应用 |
| 1.5 本研究的目的、意义和技术路线 |
| 1.5.1 研究目的与意义 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 根癌农杆菌介导的黄瓜遗传转化 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 化学试剂 |
| 2.1.4 基本培养基 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 农杆菌转化 |
| 2.2.2 重组质粒提取与检测 |
| 2.2.3 引物信息 |
| 2.2.4 PCR扩增体系及程序 |
| 2.2.5 黄瓜遗传转化 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 质粒的检测 |
| 2.3.2 同一转化方式不同载体子叶再生频率比较 |
| 2.3.3 转化植株的获得 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 RNAi载体和CRISPR载体再生频率比较分析 |
| 2.4.2 遗传转化植株的获得 |
| 第三章 转基因植株的分子检测及抗病性鉴定 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 转化植株总DNA提取 |
| 3.2.2 DNA浓度质量检测 |
| 3.2.3 转化植株PCR检测 |
| 3.2.4 转化植株田间表型调查 |
| 3.2.5 荧光定量PCR检测转化植株沉默效率 |
| 3.2.5.1 总RNA提取和c DNA合成 |
| 3.2.5.2 荧光定量PCR引物设计 |
| 3.2.5.3 荧光定量PCR反应 |
| 3.2.6 黄瓜霜霉病苗期抗病性鉴定 |
| 3.2.6.1 材料准备 |
| 3.2.6.2 菌源制备 |
| 3.2.6.3 接种和管理方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 DNA浓度质量检测 |
| 3.3.2 T0代植株PCR检测 |
| 3.3.3 T0代植株田间性状调查 |
| 3.3.4 RNA质量检测与荧光定量PCR引物特异性检测 |
| 3.3.5 不同目的基因在转基因黄瓜的相对定量PCR分析 |
| 3.3.6 T1代PCR检测及田间白粉病抗病性调查 |
| 3.3.7 T1代转基因植株霜霉病苗期抗病性鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 应用感病基因创制抗白粉病和霜霉病的黄瓜新材料 |
| 3.4.2 遗传转化中的位置效应 |
| 3.4.3 黄瓜白粉病与霜霉病的相关性 |
| 3.4.4 候选感病基因的功能验证 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| ABSTRACT |
（7）芹菜花青素和芹菜素的代谢机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 芹菜种质资源及类型 |
| 1.1 芹菜简介 |
| 1.2 芹菜的形态特征 |
| 1.3 芹菜种质资源的主要分类 |
| 1.4 芹菜生长发育特征 |
| 2 芹菜与其它伞形科蔬菜的比较 |
| 2.1 重要的伞形科蔬菜 |
| 2.2 芹菜与其它伞形科蔬菜生物学特性比较 |
| 3 花青素的发现及作用 |
| 3.1 花青素的发现 |
| 3.2 花青素在植物中的作用 |
| 3.3 花青素对人类的作用 |
| 4 影响花青素合成的因素 |
| 4.1 遗传因素 |
| 4.2 光 |
| 4.3 温度 |
| 4.4 病虫害 |
| 4.5 pH值 |
| 4.6 激素 |
| 4.7 营养水平 |
| 4.8 其它因素 |
| 5 芹菜素的研究进展 |
| 5.1 芹菜素提取 |
| 5.2 芹菜素化学合成 |
| 5.3 芹菜素人工生物合成 |
| 5.4 芹菜素对疾病的预防和治疗 |
| 6 花青素和芹菜素之间的关系 |
| 7 植物组培 |
| 7.1 组培关键问题 |
| 7.2 芹菜组培研究 |
| 8 本研究的内容和意义 |
| 8.1 本研究内容 |
| 8.2 本研究的意义 |
| 第二章 紫色芹菜‘南选六合紫芹’的获得和利用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料来源 |
| 2.2 芹菜自交 |
| 2.3 芹菜杂交方法 |
| 2.4 紫色芹菜提纯及其与非紫色芹菜杂交过程 |
| 2.5 数据统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 获得的紫色芹菜遗传规律 |
| 3.2 获得的紫色芹菜植株性状 |
| 3.3 利用获得的紫色芹菜培育实心紫色芹菜 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 芹菜试管再生体系的建立 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料 |
| 2.2 芹菜种子预处理 |
| 2.3 芹菜种子消毒与播种 |
| 2.4 培养基选择 |
| 2.5 IAA和6-BA对芹菜愈伤诱导和分化的影响 |
| 2.6 光对芹菜组培苗玻璃化的影响 |
| 2.7 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 次氯酸钠对芹菜种子消毒和发芽的影响 |
| 3.2 培养基对芹菜种子发芽的影响 |
| 3.3 IAA和6-BA增加到不同的培养基对芹菜愈伤诱导的影响 |
| 3.4 芹菜愈伤诱导分化 |
| 3.5 光密度对芹菜组培苗玻璃化的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 芹菜花青素和芹菜素合成相关基因的克隆和表达分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料、菌株和载体 |
| 2.2 总RNA的提取与cDNA的合成 |
| 2.3 基因的鉴定和克隆引物设计 |
| 2.4 基因克隆测序 |
| 2.5 序列比对分析 |
| 2.6 荧光定量PCR |
| 2.7 芹菜花青素的提取和含量测定 |
| 2.8 芹菜中芹菜素的提取和含量测定 |
| 2.9 数据分析 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 芹菜花青素和芹菜素代谢合成基因组装和克隆 |
| 3.2 两种芹菜叶柄花青素和芹菜素含量比较 |
| 3.3 花青素和芹菜素合成相关基因在芹菜叶柄中的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第五章 Ag3GT基因过表达对芹菜叶柄花青素和芹菜素含量的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料 |
| 2.2 分光光度计和高效液相色谱测定芹菜花青素 |
| 2.3 芹菜叶柄中芹菜素含量测定 |
| 2.4 总RNA提取和cDNA合成 |
| 2.5 基因的克隆和鉴定 |
| 2.6 荧光定量PCR分析 |
| 2.7 Ag3GT植物表达载体的构建 |
| 2.8 Ag3GT植物表达载体转化农杆菌 |
| 2.9 Ag3GT植物表达载体转化到芹菜中 |
| 2.10 芹菜转基因植株的鉴定 |
| 2.11 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1‘六合黄心芹’与‘南选六合紫芹’形态比较 |
| 3.2 鉴定芹菜叶柄花青素的主要成分 |
| 3.3 两种芹菜Ag3GT基因及其氨基酸序列比对 |
| 3.4 Ag3GT基因在两种芹菜中的表达分析 |
| 3.5 转基因验证紫色芹菜Ag3GT基因功能 |
| 3.6 转Ag3GT基因对花青素代谢途径其它基因的影响 |
| 3.7 转Ag3GT基因对芹菜素含量和AgFNS基因的表达影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第六章 AgFNS基因过表达对紫色芹菜叶柄花青素和芹菜素含量的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料和生长条件 |
| 2.2 RNA提取和cDNA合成 |
| 2.3 AgFNS基因从紫色芹菜中分离 |
| 2.4 序列比对和进化分析 |
| 2.5 pYN7736-AgFNS植物表达载体的构建 |
| 2.6 pYN7736-AgFNS转化到农杆菌和芹菜转基因 |
| 2.7 转基因植株的鉴定 |
| 2.8 芹菜中花青素和芹菜素的提取和含量测定 |
| 2.9 实时荧光定量PCR |
| 2.10 数据统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 紫色芹菜AgFNS基因的克隆和鉴定 |
| 3.2 AgFNS的进化分析 |
| 3.3 芹菜转基因植株的鉴定和比较 |
| 3.4 转AgFNS基因芹菜中芹菜素和花青素合成相关基因的表达分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 附录Ⅰ 胡萝卜雄性不育材料‘武野一不育’的特征及利用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 附录Ⅱ 线粒体atp6基因在不育与可育胡萝卜中的长度、拷贝数和表达研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 硕博连读期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（8）蜡质芽胞杆菌AR156诱导植物对丁香假单胞菌及南方根结线虫抗性机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 上篇 文献综述 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 微生物防治植物病害的机理研究进展 |
| 第一节 |
| 1 国内外芽胞杆菌的研究及其应用现状 |
| 1.1 国内芽胞杆菌的生防研究概况 |
| 1.2 国外芽胞杆菌的生防研究进展 |
| 2 芽胞杆菌生防机理研究 |
| 2.1 抗菌作用 |
| 2.2 溶菌作用 |
| 2.3 竞争作用 |
| 2.4 诱导系统抗病性 |
| 3 芽胞杆菌在农业生产应用中面临的问题及解决途径 |
| 3.1 芽胞杆菌生物农药面临的问题 |
| 3.2 针对芽胞杆菌生物农药问题的解决方法 |
| 3.3 芽胞杆菌生物农药未来发展展望 |
| 第二节 蜡质芽胞杆菌生防机理研究进展 |
| 1 国内外芽胞杆菌的研究及应用现状 |
| 2 蜡质芽胞杆菌生防机理研究 |
| 2.1 竞争作用 |
| 2.2 拮抗作用 |
| 2.3 诱导系统抗病性 |
| 3 问题与展望 |
| 第二章 植物防卫系统与诱导抗性 |
| 第一节 植物防卫系统与诱导抗性概述 |
| 1 根围免疫信号 |
| 2 植物系统获得性抗性(SAR) |
| 3 诱导系统抗病性(ISR) |
| 4 关键调控因子 |
| 4.1 NPR1调节因子 |
| 4.2 WRKY转录因子 |
| 4.3 植物诱导抗病过程中的Priming |
| 第二节 微生物胞外多糖的功能研究概述 |
| 1 多糖的种类 |
| 1.1 按照多糖的来源 |
| 1.2 按照微生物分泌的多糖部位 |
| 2 微生物胞外多糖的生物活性 |
| 2.1 保护作用 |
| 2.2 识别作用 |
| 2.3 储存能量 |
| 2.4 粘合作用 |
| 2.5 提升机体免疫力 |
| 2.6 抑制肿瘤细胞生长 |
| 3 微生物胞外多糖的应用 |
| 3.1 微生物胞外多糖在农业领域内的应用 |
| 4 总结 |
| 第三节 Small RNAs在植物内源免疫中的调控作用 |
| 1. 参与small RNAs合成的基本成分及作用 |
| 1.1 Dicer酶 |
| 1.2 AGO蛋白 |
| 1.3 RNA依赖性RNA聚合酶 |
| 2 Small RNAs的种类及生物合成 |
| 2.1 microRNAs的生物合成 |
| 2.2 siRNAs的生物合成 |
| 3. Small RNAs的作用机制 |
| 4. Small RNAs在植物内源免疫中的抗病作用 |
| 5. 总结 |
| 第三章 蔬菜根结线虫病害综合防治研究进展 |
| 1 根结线虫的分类学地位 |
| 2 根结线虫的发生规律 |
| 3 根结线虫的寄主范围和传播途径 |
| 4 根结线虫的为害特点及症状 |
| 5 根结线虫病害的防治策略 |
| 5.1 农业防治措施 |
| 5.2 物理防治措施 |
| 5.3 化学防治措施 |
| 5.4 生物防治措施 |
| 6 目前根结线虫防治中存在的问题及发展前景 |
| 第四章 根结线虫病害的生防机理研究进展 |
| 1 根结线虫病害的生防机理 |
| 1.1 寄生作用 |
| 1.2 捕食作用 |
| 1.3 毒杀作用 |
| 1.4 诱导植物产生系统抗病性 |
| 2 问题和展望 |
| 第五章 植物线虫效应因子在调控病害防治过程中的作用研究 |
| 1 线虫效应因子注入寄主植物细胞的调控 |
| 2 线虫效应因子作为植物细胞生物学的探针 |
| 2.1 细胞周期与骨架 |
| 2.2 细胞壁结构 |
| 2.3 新陈代谢 |
| 3 效应因子的功能性研究 |
| 3.1 基因沉默 |
| 3.2 寄主靶标识别 |
| 4 线虫效应因子分类 |
| 5. 线虫效应因子的识别研究 |
| 6 线虫效应因子在全球范围内的研究进展 |
| 参考文献 |
| 下篇 研究内容 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 转录因子WRKY70和WRKY11在调控蜡质芽胞杆菌AR156诱导系统抗性过程中的作用机理研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 转录因子WRKY11与WRKY70基因克隆及过表达载体构建过程 |
| 1.5 转录因子WRKY11与WRKY70基因过表达拟南芥以及转录因子WRKY11,WRKY70双突变体植株的构建 |
| 1.6 植物内源水杨酸、茉莉酸含量检测 |
| 1.7 引物信息 |
| 1.8 转录因子WRKY11与WRKY70亚细胞定位 |
| 1.9 Bc AR156对拟南芥促生作用表型测定 |
| 1.10 Bc AR156诱导拟南芥对Pst DC3000抗病性表型测定 |
| 1.11 Bc AR156诱导拟南芥对Pst DC3000抗病性的分子水平检测 |
| 1.12 Bc AR156诱导拟南芥对Pst DC3000抗病性的细胞水平检测 |
| 1.13 Western blot |
| 1.14 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录因子WRKY11和WRKY70参与调控Bc AR156诱导系统抗性 |
| 2.2 转录因子WRKY11和WRKY70都定位于细胞核 |
| 2.3 转录因子WRKY11和WRKY70参与调控Bc AR156诱导拟南芥产生的系统抗性 |
| 2.4 转录因子WRKY11和WRKY70参与调控Bc AR156诱导拟南芥内细胞防卫反应 |
| 2.5 转录因子WRKY11和WRKY70是Bc AR156诱导拟南芥内防卫相关基因的上调表达所必需的 |
| 2.6 转录因子WRKY11和WRKY70靶标基因在Bc AR156诱导拟南芥产生的系统抗性过程中的表达情况 |
| 2.7 水杨酸、茉莉酸/乙烯信号通路,以及NPR1参与转录因子WRKY11和WRKY70调控Bc AR156诱导的系统抗性 |
| 2.8 Bc AR156诱导拟南芥产生的系统抗性并非通过影响植物内源激素的合成 |
| 3 讨论 |
| 第二章 蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖作为一类MAMPS激活植物系统免疫 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 Bc AR156胞外多糖的提取与纯化 |
| 1.5 过敏性反应（HR)分析 |
| 1.6 Bc AR156各组分对Pst DC3000的平板拮抗试验 |
| 1.7 蜡质芽胞杆菌胞外多糖诱导抗性表型验证试验 |
| 1.8 Pst DC3000在拟南芥上的定殖量测定 |
| 1.9 Bc AR156胞外多糖诱导拟南芥对Pst DC3000抗病性的细胞水平的检测 |
| 1.10 拟南芥总RNA提取与Q-RT-PCR分析 |
| 1.11 拟南芥叶片总蛋白的提取与Western blotting分析 |
| 1.12 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bc AR156胞外多糖能够诱导植物产生过敏性反应 |
| 2.2 Bc AR156胞外多糖诱导拟南芥产生对Pst DC3000的系统抗性 |
| 2.3 Bc AR156胞外多糖诱导拟南芥防卫相关基因的表达 |
| 2.4 Bc AR156胞外多糖激活植物体免疫诱导活性氧的积累、胼胝质的沉积以及防卫相关酶活性增加 |
| 2.5 AR156胞外多糖在拟南芥中诱导的系统抗性通过SA信号途径,并依赖NPR1 |
| 2.6 Bc AR156胞外多糖在拟南芥中诱使的系统抗性通过MAPK信号途径。 |
| 2.7 Bc AR156胞外多糖的化学分析及结构鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 SMALL RNAS在生防菌诱导植物抗病中的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 转基因植物的构建 |
| 1.5 Bc AR156诱导拟南芥对Pst DC3000抗病性表型测定 |
| 1.6 miRNA靶基因的预测 |
| 1.7 拟南芥总RNA提取与Q-RT-PCR分析 |
| 1.8 Northern Blot |
| 1.9 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miRNA参与调控Bc AR156诱导拟南芥产生对Pst DC3000系统抗性 |
| 2.2 miR472,miR825/825*参与调控Bc AR156激活的ISR |
| 2.3 miR472、miR825/825*过表达或者缺失能够影响植物基础免疫 |
| 2.4 miR472、miR825/825* target植物内源R基因,调控植物基础免疫 |
| 3 讨论 |
| 第四章 蜡质芽胞杆菌AR156调控植物根系发育防治根结线虫病害的机理研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 根结线虫二龄幼虫(J2)悬浮液的制备 |
| 1.5 蜡质芽胞杆菌引起番茄根系变化观察 |
| 1.6 线虫对番茄根系侵染率检测 |
| 1.7 温室防效实验 |
| 1.8 转录组测序与分析 |
| 1.9 番茄根组织总RNA提取与Q-RT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bc AR156高效防治番茄根结线虫病 |
| 2.2 Bc AR156诱导番茄根系结构变化,加速番茄根系得成熟化 |
| 2.3 Bc AR156诱导番茄根系结构变化,降低根结线虫侵染 |
| 2.4 Bc AR156调控番茄根系相关基因的表达 |
| 2.5 转录组学预测相关调控基因Q-RT-PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 第五章 蜡质芽胞杆菌AR156调控根结线虫效应因子表达防治病害的机理研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 根结线虫二龄幼虫(J2)悬浮液的制备 |
| 1.5 转录组测序与分析 |
| 1.6 效应因子分析和预测 |
| 1.7 番茄根组织总RNA提取与Q-RT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组测序结果分析 |
| 2.2 Q-RT-PCR结果验证 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结及展望 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与专利 |
| 致谢 |
（9）白菜类蔬菜转基因研究进展（论文提纲范文）
| 1 导入的外源基因和转基因植株的获得 |
| 1.1 抗虫基因 |
| 1.2 抗病基因 |
| 1.3 抗逆基因 |
| 1.4 雄性不育基因 |
| 1.5 抗除草剂基因 |
| 1.6 筛选基因 |
| 1.7 改良品质 |
| 2 转化方法 |
| 2.1 借助组织培养的农杆菌转化法 |
| 2.2 其他转化方法 |
| 3 存在问题 |
| 3.1 转基因技术问题 |
| 3.2 转基因检测问题 |
| 3.3 转基因白菜类蔬菜安全性问题 |
| 3.3.1 食用安全性 |
| 3.3.2 环境安全性 |
| 4 展望 |
（10）瓜类蔬菜转基因研究进展（论文提纲范文）
| 1 再生系统的建立 |
| 1.1 器官分化途径 |
| 1.2 体细胞胚胎发生途径 |
| 2 转基因的方法 |
| 2.1 农杆菌介导法 |
| 2.2 Floral-dip法 |
| 2.3 花粉管通道法 |
| 2.4 DNA浸胚法 |
| 2.5 基因枪法 |
| 3 目的基因的转化和表达研究 |
| 3.1 抗病毒病基因的转化 |
| 3.2 抗真菌病害基因的转化 |
| 3.3 抗逆基因的转化 |
| 3.4 品质改良基因的转化 |
| 4 存在的问题 |
| 4.1 再生系统不完善 |
| 4.2 转化率和成苗率低 |
| 4.3 基因沉默和转基因植株的性状变异 |
| 4.4 转基因植物的安全性 |
| 5 展望 |
四、蔬菜转基因研究进展（论文参考文献）
- [1]转录因子BoaMYB51和BoaBIM1调控芥蓝吲哚族芥子油苷代谢机理及其功能研究[D]. 王梦雨. 浙江大学, 2021
- [2]Ogura CMS青花菜育性恢复材料的创制及其遗传背景解析[D]. 黄静静. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]适合抗根肿病研究的大白菜遗传转化体系的构建[D]. 刘旭垚. 沈阳农业大学, 2020(05)
- [4]芸薹种孤基因的鉴定及其转基因库的构建和评价[D]. 姜明亮. 沈阳农业大学, 2020(08)
- [5]CRISPR/Cas9系统在甘蓝中的应用及单碱基编辑器VQR-BE3在烟草中的初步研究[D]. 刘保利. 西南大学, 2020(01)
- [6]黄瓜白粉病和霜霉病相关感病基因遗传转化与功能验证[D]. 王小荟. 河南农业大学, 2018(02)
- [7]芹菜花青素和芹菜素的代谢机理研究[D]. 谭国飞. 南京农业大学, 2017(07)
- [8]蜡质芽胞杆菌AR156诱导植物对丁香假单胞菌及南方根结线虫抗性机理研究[D]. 蒋春号. 南京农业大学, 2016(05)
- [9]白菜类蔬菜转基因研究进展[J]. 高丽,崔崇士,屈淑平. 中国蔬菜, 2010(12)
- [10]瓜类蔬菜转基因研究进展[J]. 韩伟,刘娥娥,王亚琴,何晓明. 中国蔬菜, 2010(04)