一、农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立（论文文献综述）
袁冰,丁筠,曹含章,吕尊富,李飞飞[1]（2021）在《草甘膦为筛选标记的水稻高效遗传转化体系的建立》文中研究说明【目的】建立以日本晴愈伤组织为受体、草甘膦抗性基因CP4为选择标记基因的高效水稻遗传转化体系。【方法】以粳稻日本晴的成熟胚为试验材料,通过农杆菌介导法,将含有草甘膦抗性基因CP4的P1300载体转化日本晴的愈伤组织,分别用质量浓度为10、20和40 mg/L的草甘膦进行3轮抗性筛选,诱导分化和再生成苗;利用1 000 mg/L草甘膦对移栽成活的阳性苗进行抗性鉴定。【结果】获得145株转基因幼苗,PCR检测阳性株为128株,阳性率达88.27%;经过3轮抗性筛选后,转基因幼苗的阳性率提高;移栽成活的99株阳性苗中,65株表现为抗性,抗性率为65.66%。【结论】成功建立了以草甘膦为筛选标记的水稻转基因体系,该体系为水稻育种提供了材料,并对以抗草甘膦基因作为筛选标记的水稻转基因和一些基因功能验证提供了技术支持。
王慧杰[2]（2021）在《三元载体系统的构建及其应用于水稻农杆菌介导的遗传转化研究》文中研究表明水稻遗传转化技术已成为水稻分子生物学研究不可或缺的研究技术。农杆菌介导法是水稻遗传转化的主流方法,但农杆菌介导法转化水稻具有很强的基因型依赖性,一些顽拗型水稻品种的遗传转化仍然较为困难。本研究以粳稻品种日本晴,籼稻品种明恢86、9311作为遗传转化材料,探究了不同筛选标记基因、不同培养条件、两个胚形态建成基因和三元载体系统对水稻遗传转化效率的影响,建立了一种用于水稻遗传转化的三元载体系统。主要研究结果如下:以日本晴和明恢86成熟胚作为遗传转化材料,探究不同筛选标记基因Hpt、Bar对遗传转化效率的影响。结果显示,Hpt基因在两个品种中的筛选效率均优于Bar基因,且前者遗传转化周期明显短于后者。以明恢86成熟胚为遗传转化材料,探究形态调节基因BBM和WUS2对籼稻成胚效率和遗传转化效率的影响,但最终结果表明本实验中构建的含形态调节基因的载体与普通载体的遗传转化效率无明显差异。以日本晴成熟胚为遗传转化材料,比较含有相同目的基因RFP的双T-DNA载体（单质粒双T-DNA）和三元载体（双质粒双T-DNA）的转化效率。结果表明,目的基因的转化效率在双T-DNA载体系统中高于三元载体系统。而在三元载体系统中,p VS1相较于RK2更加适合作为辅助质粒的复制子。以明恢86、9311成熟胚为遗传转化材料,比较不同培养条件下籼稻遗传转化效率。结果显示,在预分化阶段之前,共培养、恢复、筛选等阶段共28天的连续黑暗培养更加适用于籼稻遗传转化。四种三元载体系统转化明恢86、9311成熟胚愈伤组织。结果表明,三元载体系统引入额外的毒力基因vir提高了农杆菌侵染效率。相较于双元载体,三元载体有效提高了明恢86的遗传转化效率。在9311中,三元载体转化效率仍是不高,最高转化率仅为2.6%,仍需进一步完善。
魏林艳,连玲,魏毅东,罗曦,何炜,谢鸿光,谢华安,张建福[3]（2019）在《籼稻明恢86多基因遗传转化体系的研究》文中指出【目的】探索适合籼稻明恢86多基因遗传转化的条件,为创制含高产、抗逆、抗虫、抗病等基因的水稻新材料奠定基础。【方法】以籼稻明恢86为受体材料,将构建好的含作物高产基因RRM2、耐旱基因HS1、抗除草剂基因EPSPS、抗虫基因Bt、细胞凋亡抑制基因iap和促细胞再生基因p35等多基因载体（载体分别命名为P5和P8）进行遗传转化。在此基础上,分别对多基因遗传转化体系的受体材料、农杆菌浓度、侵染时间、共培养方式、G418筛选浓度和草甘膦筛选浓度等主要影响因素进行试验,探讨其适宜的转化条件。【结果】受体材料的筛选结果表明,幼胚的出愈率显着高于成熟胚,且其愈伤组织状态相对较好;各转化条件的筛选结果,农杆菌侵染浓度OD600为0.4～0.6、侵染时间15～20 min、共培养2～3 d、培养基上添加无菌滤纸、G418筛选浓度150 mg·L-1和草甘膦筛选浓度800 mg·L-1是提高转化效率的优化条件; PCR分析结果,多基因载体P5中的GUS基因成功转入籼稻明恢86。【结论】通过对培养条件的优化,可使籼稻明恢86愈伤组织的诱导愈伤率和抗性愈伤率得到显着提高。
付健美[4]（2018）在《通过基因差异表达及蛋白互作研究抗虫转基因水稻在不同环境条件下的非预期效应》文中研究表明限制转基因水稻商业化种植的一个重要因素是其环境安全问题,其中转基因水稻逃逸出农田生态系统后,能否在自然生态系统中持续存在下去甚至进一步扩散,是转基因水稻商业化种植必须解决的环境安全问题之一。抗虫转基因水稻在农田生态系统中的适合度及转录组水平上的基因差异表达已有较多研究和报道,但是对其在自然生态系统中的适合度及其基因差异表达、蛋白互作尚未见报道。本研究以商业化潜力较大的转cry1Ab/c水稻华恢1号（HH1）、转cry1 C*/bar基因水稻TIC-19及其亲本水稻明恢63（MH63）为材料,模拟自然生态系统中的杂草竞争、荒地土壤、盐碱土壤条件:（1）研究了其在上述不同种植条件的适合度;（2）利用组学技术研究转cry1C*/bar基因水稻T1C-19在杂草竞争和荒地土壤条件下的基因差异表达;（3）探索了 HH1表达的外源蛋白Cry1Ab/c与水稻内源蛋白的相互作用、外源Cry1Ab/c蛋白的细胞膜定位及其与水稻内源膜蛋白的相互作用,以及外源Cry1Ab/c蛋白与水稻开花蛋白的互作。本研究结果可为抗虫转基因水稻华恢1号、TIC-19的商品化种植提供环境安全方面的科学依据。具体结果如下:1.模拟不同自然条件下抗虫转基因水稻华恢1号和T1C-19的适合度本研究以抗虫转基因水稻HH1、T1C-19为研究材料,模拟了其在不同自然条件下抗虫转基因水稻HH1和T1C-19的株高、分蘖数、地上干生物量等营养生长指标和单株饱粒数、单株饱粒重等生殖指标以及外源Bt蛋白的表达量:在模拟农田土壤和盐碱土壤条件下,盐碱土壤条件的2个外源Bt蛋白的表达量均较农田土壤条件更低。对于转基因水稻HH1,相同土壤条件下的分蘖数以及生物量等营养生长指标和单株饱粒数、单株饱粒重等生殖指标均显着低于亲本水稻MH63,呈现现出显着的适合度代价,同时这种适合度代价在盐碱土壤条件更为明显。对于转基因水稻T1C-19,其在农田土壤条件下的株高、分蘖数以及生物量等营养生长指标和单株饱粒数、单株饱粒重等生殖生长指标均显着低于亲本水稻MH63;盐碱土壤条件下,T1C-19仅分蘖数及生物量显着低于亲本水稻MH63,其余营养生长指标与亲本水稻MH63没有显着差异,但是单株饱粒数、单株饱粒重等生殖生长指标显着高于亲本水稻MH63。另外,在农田土壤条件和盐碱土壤条件下,HH1较MH63的抽穗期平均延迟了12d和25d,T1C-19与MH63的抽穗期相似。在模拟无杂草竞争的荒地土壤、杂草竞争的农田土壤和杂草竞争的荒地土壤3种胁迫种植条件下,转基因水稻HH1、T1C-19的外源Bt蛋白的表达量显着低于无杂草竞争的农田土壤条件。对于HH1,在无杂草竞争的农田和荒地土壤条件下,除株高外,分蘖数、叶面积、叶SPAD值以及生物量等营养生长指标和单株饱粒数、单株饱粒重等生殖指标均显着低于亲本水稻MH63,呈现出显着适合度成本。在杂草竞争的农田和荒地土壤条件下,HH1的株高、分蘖数、生物量等营养生长指标与MH63没有显着差异,但单株饱粒数、单株饱粒重以及结实率显着高于亲本水稻MH63。对于T1C-19,在无杂草竞争的农田和荒地土壤条件下,分蘖数、叶面积、叶SPAD值以及生物量等营养生长指标和单株饱粒数、单株饱粒重等生殖能力均显着低于亲本水稻MH63。然而在杂草竞争的农田和荒地土壤条件下,T1C-19的株高、分蘖数、地上部干生物量等营养生长指标及单株饱粒数、单株饱粒重以及结实率均与亲本MH63水稻没有显着差异。2.杂草竞争和荒地土壤种植条件下抗虫转基因水稻T1C-19的基因差异表达以转基因水稻T1C-19及其亲本水稻MH63为研究材料,在模拟无杂草竞争的农田和荒地土壤和杂草竞争的农田和荒地土壤4种种植条件下,通过测定水稻的转录组和蛋白组,研究了其基因差异表达:转录组测序结果表明:4种种植条件下,与MH63相比,T1C-19总计有3786个差异基因,其中150个为共有差异基因,占整个水稻转录组的0.4%,分析这些共有差异基因由外源基因插入引起。另外对于T1C-19和MH63,与无杂草竞争的农田土壤（对照）相比,无杂草竞争的荒地土壤条件的差异基因数量分别为1084个和1234个,杂草竞争的农田土壤条件的差异基因数量为963个和1226个,杂草竞争的荒地土壤条件的差异基因数量为1053个和1505个,总计有2743和2200个,占水稻整个转录组的8.50%和6.86%,该结果表明种植条件对水稻的基因表达有显着影响,且显着高于外源基因插入对水稻的基因表达影响。上述与外源基因插入相关的150个共有差异基因可以显着富集到植物的光合作用（Lhb1、Lhcb2、Lhcb3和Lhcb5）、光反应的节律变化（FKF1、PRR）、植物细胞内吞作用及植物细胞凋亡信号通路中（HSP70）。采用qPCR技术验证了显着富集在这4条通路中的7个共有差异基因在T1C-19和MH63中的mRNA表达量发现,在上述4种种植条件下T1C-19均较MH63显着下调,与转录组测序结果一致。采用双分子荧光互补技术证实了外源Cry1C*蛋白可与该4条通路上的光合天线蛋白Lhb1等6个共有差异基因表达的内源蛋白互作。另外,尽管转基因水稻T1C-19与亲本水稻MH63在3种不同胁迫种植条件下的差异表达基因数目和表达量均有一些差异,却能显着富集到相似的功能通路中,推测外源cry1C*/bar基因插入可能并不会显着改变转基因水稻T1C-19对胁迫种植条件的适应性。蛋白组测序结果显示:4种种植条件下,与MH63相比,T1C-19总计有2177个差异蛋白,其中121个为共有差异蛋白,占整个水稻蛋白组的1.7%,分析这些共有差异蛋白由外源基因插入引起。对于T1C-19和MH63,与无杂草竞争的农田土壤条件相比,无杂草竞争的荒地土壤条件的差异蛋白数量分别为411个和300个,杂草竞争的农田土壤条件的差异蛋白数量为662个和430个,杂草竞争和荒地土壤复合条件下的差异蛋白数量为309个和375个,总计有1028个和839个,占水稻整个蛋白组的15.52%和11.87%,该结果表明种植条件对水稻内源蛋白的表达有显着影响,且远远高于外源基因对水稻内源蛋白表达的影响。对这些共有的差异表达蛋白在生物学功能分类上进行KEGG通路分析,结果显示:T1C-19与MH63相比,121个差异表达蛋白仅显着富集到叶绿体的核糖体参与的信号通路中。另外,尽管转基因水稻T1C-19与亲本水稻MH63在3种不同胁迫种植条件下的差异表达蛋白数目和表达量均有一些差异,却能显着富集到相似的功能通路中,推测外源cry1C*/bar基因插入可能并不会显着改变转基因水稻T1C-19对胁迫种植条件的适应性。3.抗虫转基因水稻华恢1号外源Cry1Ab/c蛋白与水稻内源蛋白互作的研究以转基因水稻华恢1号为研究材料,用酵母双杂交技术筛选到了可能与Cry1Ab/c蛋白互作的抗逆反应类、氧化还原反应类（主要光合作用）、物质代谢类以及其他未知功能的水稻内源蛋白60个,并用亚细胞共定位、双分子荧光互补、免疫共沉淀技术验证了 6个光合作用内源蛋白、9个抗逆反应内源蛋白与外源Cry 1Ab/c蛋白发生互作的真实性。采用原位免疫组化、免疫荧光、细胞膜蛋白和细胞质蛋白分离的Western blot技术以及亚细胞定位技术,以水稻和烟草叶片为材料,发现外源Cry1Ab/c蛋白主要定位于细胞膜内膜上,并可以与细胞膜蛋白V-H+-ATPase和Ca2+-ATPase发生相互作用。采用酵母双杂交、亚细胞共定位、双分子荧光互补、免疫共沉淀技术研究了外源Cry1Ab/c蛋白与水稻5个抽穗期主效蛋白的互作,发现HH1外源Cry1Ab/c蛋白仅与水稻抽穗期核心主效蛋白成花素Hd3a间存在相互作用,且Hd3a的mRNA转录水平较MH63显着下调,均可能在转基因水稻HH1抽穗期推迟中起关键作用。
魏林艳[5]（2018）在《籼稻明恢86多基因遗传转化及再生体系的优化》文中研究说明水稻是我国重要的粮食作物之一,其稳定确保国家粮食的安全生产。但是土壤的干旱、水稻病虫害、除草剂等因素都会严重制约水稻的产量,同时也不同程度的影响着水稻的品质。为此,构建出一个多基因植物表达载体,通过多基因载体的遗传转化,获得包含高产、抗逆、抗虫、抗病等特性的水稻新材料是确保国家粮食安全生产的一种有效途径。本研究以实验室已有的遗传转化体系为基础,进一步通过改善和优化培养条件,期望获得一种更为快速且高效的多基因遗传转化体系。研究以籼稻明恢86为受体材料,将事先构建好的含作物高产基因RRM2,耐旱基因HS1,抗除草剂基因EPSPS,抗虫基因BT,凋亡抑制基因IAP和P35等基因的多基因载体（载体分别命名为P5和P8）,进行遗传转化。本研究主要结果如下:1、在相同的诱导培养条件下,通过对明恢86的幼胚和成熟胚进行诱导,结果表明:明恢86幼胚中诱导出的愈伤组织结构好,愈伤组织亮黄、硕大,生长旺盛,出愈率高。明恢86成熟胚中诱导出的愈伤组织质地、结构较小,愈伤组织生长较为缓慢,出愈率比较低。2、通过筛选剂草甘膦和筛选剂G418对愈伤组织进行不同的筛选浓度的梯度筛选,结果表明:明恢86愈伤组织在筛选培养过程中,对草甘膦和G418筛选浓度的敏感较弱,实验过程中需要添加高浓度的筛选剂,选择草甘磷筛选浓度为800mg/L较为合适;G418筛选浓度为150mg/L较为合适。3、农杆菌的菌液浓度、菌液侵染时间和共培养方式都是影响转化效果的主要因素。结果表明:菌液浓度太高、菌液侵染时间太长,共培养基上愈伤组织培养的时间太长,都会使农杆菌在侵染转化过的愈伤组织上大量繁殖,过度繁殖的农杆菌菌液会影响愈伤组织的正常生长,从而对愈伤组织造成毒害,降低转化效率。所以愈伤组织在侵染转化过程中,当OD值为600时,选择农杆菌侵染浓度为0.4-0.6,侵染时间控制在15-20min内,将侵染后的愈伤组织转接到共培养基上,放在26℃暗培养箱中培养2-3d。4、外源激素2,4-D是植物组织培养中最常用的生长调节激素。籼稻明恢86愈伤组织的形成和分化会受外源激素和内源激素的影响,但是如果要提高籼稻愈伤组织的生长状态,主要还是添加适量的外源激素2,4-D。研究结果表明,诱导明恢86愈伤组织的最佳2,4-D浓度是2 mg/L,这时诱导培养出的愈伤组织质量好,生长旺盛,有利于后续愈伤组织转化实验的使用。
童普国,欧阳解秀,阎新,李绍波,廖鹏飞[6]（2016）在《1个组培特性优良的籼稻品种的发现及其农杆菌转化体系的建立》文中研究表明对生产上广泛应用的4个优质籼型杂交水稻保持系中9B、金23B、Ⅱ–32B和川香29B,2个恢复系9311和明恢63的组培特性进行系统研究,发现川香29B愈伤组织的诱导率、继代培养增殖率、耐继代能力及分化再生能力均高于其他籼稻品种,其愈伤诱导率和分化再生率分别为96%和82%,说明川香29B是1个具有优良组培特性的籼稻品种;进一步对川香29B的农杆菌遗传转化体系进行优化,并初步建立了川香29B稳定的农杆菌介导的转化体系,即农杆菌EHA105菌液浓度OD600 nm为0.1,浸染液AAM中乙酰丁香酮浓度为200μmol/L,浸染时间30 min,黑暗条件下共培养72 h,共培养温度为19℃,抗性植株转化率为19.6%。
孙庆山[7]（2016）在《基因组编辑技术定向改良水稻几个产量相关性状》文中研究说明改良水稻产量相关性状、提高水稻产量仍是水稻育种研究的重要内容。传统的杂交育种方法改良水稻产量性状的不确定性及盲目性,大大限制了水稻产量育种水平的提高。随着大量水稻产量相关性状基因的克隆及相关生物技术的应用,特别是近几年发展起来的基因组编辑技术的应用,为定向改良水稻产量相关性状创造了条件。本论文拟利用基因组编辑技术定向突变几个水稻产量相关性状基因,创制一系列相关基因的突变体,观察其性状表型,探讨定点突变这些基因改良水稻相关性状的可能性及特点,为进一步筛选这些基因的优异突变等位基因新材料,开展育种利用创造条件。其主要研究结果如下:利用TALENs技术定点突变了水稻优良恢复系明恢86的株型调控关键基因IPA1。通过将抗性愈伤连续继代培养后分化,获得8种不同序列突变的IPA1突变体。自交结合PCR分析筛选到一些去除了 TALENs表达框的突变植株,已获得3种不含转基因的纯合突变体材料,其IPA1基因序列分别缺失2bp、4bp、23bp。表型分析发现,IPA1基因突变（缺失4bp）能够明显改变水稻株高及分蘖数,株高显着降低,纯合突变体平均矮化25.5cm;分蘖数明显增加,纯合突变体平均分蘖数增加4.7个。纯合突变体在明恢86遗传背景下的水稻株高平均为94.1cm,分蘖数平均为12.5 个。利用CRISPR/Cas9系统定点突变了水稻穗型调控基因DEP1、DEP3和OsLAC。在各基因编辑载体的转基因植株中,分别筛选到4种DEP1突变类型,28种DEP3突变类型和6种OsLAC突变类型。并分别获得了去除CRISPR/Cas9表达框成分的DEP1和DEP3突变体。对突变体的表型初步分析发现,DEP1突变后,穗着粒较密,穗长变短,粒型变小。在DEP3突变体中,只有缺失300bp的纯合突变体表型变化明显,穗粒数明显增多,穗着粒变密,粒长变长,粒宽变窄,长宽比达到3.2。有关OsLAC的突变体表型,DEP1和DEP3突变体的精细表型分析及DEP3不同突变体表型差异原因尚在分析中。
郭海花[8]（2016）在《利用基因组编辑技术创制新型水稻雄性不育系的研究》文中研究指明在水稻杂种优势利用中,“三系法”存在受恢保关系的制约而对种质资源利用率低的问题,而“两系法”受自然温光影响,在极端气候下又存在不育系的繁殖及杂交制种纯度不达标的风险。水稻存在一些不育特性稳定,且不受环境影响的隐性核雄性不育资源,任何育性正常的水稻品种均可作为其恢复系用来生产杂交种。这些优点可以克服目前“三系”和“两系”杂交水稻的不足之处。但是这些雄性不育自身不能保持,限制了其在生产上的应用。目前先锋公司开发的SPT（Seed production technology,SPT）技术及国内的智能不育系技术等解决了上述核雄性不育的保持问题,为水稻的杂种优势利用开辟了新的途径。本研究拟利用CRISPR/Cas9系统定点突变3个水稻雄性不育基因及1个水稻花药特异表达基因,构建用于保持雄性不育材料的工程载体,转化相应的不育突变体,以期创造一套利用隐性核雄性不育的智能不育系统,创制新材料,为水稻杂种优势的利用开辟新途径。具体研究结果如下:1、利用基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统,在水稻优良品种明恢86中分别定点突变了3个雄性不育基因CYP704B2、DPW及TIP2基因。通过对各编辑载体转基因植株的筛选,针对CYP704b2基因共获得了 13种突变类型,其中双等位纯合突变j3-1和双等位杂合突变j3-4、k2-2在T0代表现为花粉完全不育;针对DPW基因共获得了7种突变类型,其中纯合突变O1-4在T0代表现为花粉败育,双等位杂合突变1-1在T1后代中分离出不含转基因成分的完全花粉败育单株,且分离比符合3:1的孟德尔分离规律;针对TIP2基因获得了 14种突变类型,其中双等位杂合或纯合突变M1-1、M1-2、M2-7和M22-9在T0代表现为株型正常而花粉完全不育。2、利用CRISPR/Cas9技术对花药特异性表达基因OsIPK进行了定点突变。通过对转基因植株的筛选,针对1个靶位点,共获得了 16种突变类型,所有突变植株T0和T1并未观察到花粉败育。亚细胞定位显示OsIPK基因在细胞核中特异性表达,另外,还构建了过表达载体,目前已出苗,其基因功能还有待进一步分析。3、为保持经过定点突变获得的CYP704b2突变体的雄性不育特性,将花粉致死基因Dam、野生型CYP704B2基因和抗除草剂基因OsEPSP串联克隆到了植物表达载体pCAMBIA1300上,构建了cyp704b2突变材料的工程载体P1300-UEM-Dam-CYP704B2,为获得cyp 704b2突变材料的保持材料做了技术准备。
张欣,付亚萍,周君莉,郭秀平,刘文真,吴洁芳,吴传银,万建民[9]（2014）在《水稻规模化转基因技术体系构建与应用》文中研究表明水稻作为重要的粮食作物和遗传转化的模式植物,其遗传转化一直受到广泛重视。自世界首例转基因水稻于1988年获得成功以来,水稻遗传转化技术体系迅猛发展,尤其是1994年首次通过农杆菌介导实现对粳稻的高频转化,经过近20年的发展,水稻遗传转化技术体系已经比较完善。目前,应用于水稻中的转基因技术主要包括基因枪介导法和农杆菌介导法,一些实验室也采用花粉管通道法、电击法、PEG转化法等。其中,农杆菌介导的转基因方法以其低成本、易操作、转化效率高、单位点插入比例高、后代表达稳定等特点已经成为水稻转化的主流方法,约占水稻转基因报道总数的80%以上。虽然国内外刊物时有转基因方法改进的报道,但是由于种种原因,水稻的转化还受一些因素的限制,例如部分粳稻品种和籼稻受基因型的限制十分明显,转基因效率普遍较低,严重制约了转基因技术在水稻生产中的应用;某些转基因程序过于繁琐,耗时长,成本高,不但导致效率低,而且长时间的组织培养诱发逆转座子转座引起无性系变异干扰了功能研究和育种工作。因此,迫切需要建立高效、安全、规模化和标准化的水稻转基因技术体系。文章综述了国内外水稻转化技术的发展历程,重点回顾了近5年中国水稻规模化转基因技术研究进展,包括围绕不同水稻基因型高效转化体系优化及建立,对影响农杆菌转化效率及植株分化频率等诸多因素如水稻基因型、外植体类型、农杆菌菌株和质粒载体、培养基组分、共培养时间、侵染方式等方面的研究和探索。整合国内外已有研究结果进行技术集成创新,分别以粳稻和籼稻成熟胚、幼胚为外植体,采用农杆菌转化方法,通过优化受体材料和愈伤状态、农杆菌侵染浓度和分化温湿度、工艺流程标准化等多种组分,突破了成熟胚分化难的技术瓶颈,整合了无选择标记等安全转基因技术,实现了粳稻和部分籼稻转化技术的标准化和工厂化,初步建立了安全、高效、规模化水稻转基因技术体系。但与国际先进水平相比,尤其与一些跨国生物技术公司相比,在转化规模和转化效率方面仍然存在较大差距。认为安全、高效、规模化是转基因水稻新品种培育和产业化的重大技术瓶颈。建立水稻主栽品种快速、高效、稳定的转化系统,开发安全型转化技术,开展多基因、大片段基因转化,实现转基因的定点整合和时空控制表达等是水稻转基因技术的发展趋势,针对水稻规模化转基因技术体系存在的问题,提出了相应的对策,对于促进转基因水稻新品种培育和功能基因组学研究具有一定参考价值。
贾丽娥[10]（2012）在《农杆菌介导籼稻成熟胚高效转化体系的建立》文中指出水稻（Oryza sativa L.）是重要的粮食作物之一，籼稻和粳稻是水稻的两大亚种，全球80％的稻米生产基于籼稻。当前，利用转基因技术对水稻品种进行全面改良，培育优质、高产、多抗新品种在保障全球粮食安全的同时也是今后水稻育种的发展方向，可见籼稻的遗传转化在品种改良、基因功能检测、创造突变体中发挥着越来越重要的作用，而建立高效、稳定的籼稻遗传转化体系是分子育种和功能基因组学等领域研究的前提。近年来农杆菌介导法转化水稻技术已日渐成熟，并广泛应用于粳稻转化中。但对籼稻的转化相对困难，主要是其愈伤组织的诱导及分化率都很低。本研究在本实验室已有的粳稻成熟转化技术体系基础上，以籼型品种Q25（白丰B的突变体材料）、IR64、MH86、PA64S、N22和Q4041为材料，开展了影响籼稻遗传转化效率的研究工作，主要结果如下：1.通过包括基本培养基，脱落酸和生长素类物质三个因素四个水平的正交实验，明确了基因型对培养基的依赖关系，发现MS比较适合Q25、IR64、MH86、PA64S成熟胚愈伤组织的诱导，而N6比较适合N22和Q4041的诱导，通过适当添加外源激素2,4-D和ABA，诱导出了生长状态良好的胚性愈伤组织。2.通过比较三种常用的选择标记基因和相对应的筛选剂对不同基因型籼稻的抗性愈伤的筛选效果，得出BAR基因在6个籼稻品种的转化中最有应用价值，同时对NPTⅡ抗性基因的筛选剂比较中发现，庆大霉素衍生物（G418）的筛选效果优于硫酸巴龙霉素（P）。3.在抗性愈伤组织的再生环节上，通过对农杆菌浸泡的同时附加振荡的感染方式以及共培养后25min的干燥处理，提高了籼稻品种N22和Q4041遗传转化的再生频率。4.通过对籼稻遗传转化各阶段的影响因子的研究，改良了籼稻目标品种N22和Q4041成熟胚愈伤组织为受体材料的遗传转化体系，并将转化率由原来的29%提高到44%。5.基于本研究的一些结果及结合本实验室多年水稻转化工作的经验积累，对籼稻农杆菌介导的遗传转化中的问题及解决对策进行讨论，并对今后水稻转基因的发展方向提出了初浅的看法。
二、农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立（论文提纲范文）
（2）三元载体系统的构建及其应用于水稻农杆菌介导的遗传转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 农杆菌侵染机制 |
| 1.2 农杆菌介导水稻遗传转化研究进展 |
| 1.3 影响农杆菌转化水稻的几个关键因素 |
| 1.3.1 基因型 |
| 1.3.2 外植体 |
| 1.3.3 外源添加物 |
| 1.3.4 筛选标记 |
| 1.3.5 农杆菌菌株及载体系统 |
| 1.4 三元载体系统 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 受体植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.2 化学试剂与酶类 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌DH5α感受态制备及转化 |
| 2.3.2 农杆菌感受态的制备及转化 |
| 2.3.3 农杆菌Ti质粒的提取 |
| 2.3.4 质粒DNA酶切 |
| 2.3.5 DNA片段回收 |
| 2.3.6 PCR反应及产物电泳检测 |
| 2.3.7 连接反应 |
| 2.3.8 水稻遗传转化与筛选 |
| 2.3.9 水稻DNA的提取 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 水稻LAZY1基因敲除载体p1300Cas9-lazy1的构建 |
| 3.2 Bar基因为筛选标记的载体构建 |
| 3.3 形态调节基因载体的构建 |
| 3.4 双T-DNA与三元载体的构建 |
| 3.5 三元载体系统载体构建 |
| 3.6 不同筛选标记对水稻遗传转化的影响 |
| 3.7 形态调节基因的籼稻遗传转化 |
| 3.8 双T-DNA位于同一载体和不同载体的遗传转化效率比较 |
| 3.9 不同培养条件下的籼稻遗传转化 |
| 3.10 三元载体系统的籼稻遗传转化 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 水稻遗传转化效率的提升 |
| 4.2 三元载体系统中的辅助质粒 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 附录 C |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）籼稻明恢86多基因遗传转化体系的研究（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 水稻品种 |
| 1.1.2 农杆菌和载体 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 受体材料试验 |
| 1.2.2 农杆菌侵染浓度试验 |
| 1.2.3 侵染时间试验 |
| 1.2.4 共培养方式试验 |
| 1.2.5 共培养时间试验 |
| 1.2.6 标记草甘膦、G418筛选浓度试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 受体材料的选择 |
| 2.2 草甘膦对明恢86愈伤组织的致死浓度 |
| 2.3 G418对明恢86愈伤组织的致死浓度 |
| 2.4 农杆菌浓度对愈伤组织转化率的影响 |
| 2.5 侵染时间对愈伤组织转化率的影响 |
| 2.6 共培养方式对愈伤组织转化率的影响 |
| 2.7 共培养时间对愈伤组织转化率的影响 |
| 2.8 抗性植株的获得及检测 |
| 3 讨论与结论 |
（4）通过基因差异表达及蛋白互作研究抗虫转基因水稻在不同环境条件下的非预期效应（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 转基因作物的发展历史和现状 |
| 1.1 全球转基因作物商品化现状 |
| 1.2 我国转基因作物的研究现状 |
| 2 转Bt(Bacillus thuringiensis)基因抗虫水稻的研究现状 |
| 2.1 Bt基因的结构与功能 |
| 2.1.1 Cry毒素蛋白的三维模型(3D-Cry) |
| 2.1.2 Cry毒素蛋白的种类和防治对象 |
| 2.1.3 Cry毒素蛋白的作用模型 |
| 2.2 转Bt抗虫基因水稻的研究现状 |
| 2.2.1 第一代抗虫转基因水稻的释放和安全证书的获得 |
| 2.2.2 新型抗虫转基因水稻的发展 |
| 3 转Bt基因水稻的适合度评估 |
| 3.1 自身杂草化 |
| 3.2 外源基因漂移 |
| 3.3 杂交后代的适合度 |
| 4 转Bt基因水稻的非预期效应研究 |
| 4.1 非预期效应的定义 |
| 4.2 非预期效应产生的可能原因 |
| 4.2.1 转基因植株的构建过程 |
| 4.2.2 额外表达外源蛋白消耗的物质与能量 |
| 4.2.3 外源蛋白与亲本水稻内源蛋白的互作 |
| 5 非预期效应的检测评价技术 |
| 5.1 定向评价技术在转基因作物非预期效应检测中的应用 |
| 5.2 “组学”技术在转基因作物非预期效应检测中的应用 |
| 5.2.1 转录组学 |
| 5.2.2 蛋白组学 |
| 5.2.3 代谢组学 |
| 5.2.4 组学联用技术 |
| 5.3 蛋白互作技术在转基因作物非预期效应检测中的应用前景 |
| 6 本研究的目的与意义 |
| 第二部分 模拟不同自然条件下抗虫转基因水稻华恢1号和T1C-19的适合度 |
| 第1章 盐碱土壤和农田土壤条件下抗虫转基因水稻华恢1号和T1C-19的适合度 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 水稻 |
| 1.2 土壤 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 酶联免疫法测定外源Bt蛋白表达量 |
| 1.5 水稻营养生长和生殖生长的适合度指标测定 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 外源Bt蛋白表达 |
| 2.1.1 外源Cry1Ab/c蛋白 |
| 2.1.2 外源Cry1C~*抗虫蛋白表达 |
| 2.2 外源cry1Ab/c基因对水稻营养和生殖指标的影响 |
| 2.2.1 株高 |
| 2.2.2 分蘖数 |
| 2.2.3 剑叶SPAD值 |
| 2.2.4 生物量 |
| 2.2.5 生殖生长指标 |
| 2.3 外源cry1C~*/bar基因对水稻营养和生殖生长指标的影响 |
| 2.3.1 株高 |
| 2.3.2 分蘖数 |
| 2.3.3 剑叶叶长、叶宽和叶面积 |
| 2.3.4 剑叶SPAD值 |
| 2.3.5 生物量 |
| 2.3.6 生殖生长指标 |
| 3 讨论 |
| 3.1 外源Bt蛋白表达 |
| 3.2 2个土壤条件对转Bt基因水稻营养生长的影响 |
| 3.3 2个土壤条件对转Bt基因水稻生殖生长的影响 |
| 第2章 杂草竞争和荒地土壤种植条件下抗虫转基因水稻华恢1号和T1C-19的适合度 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.1.1 水稻 |
| 1.1.2 土壤 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 试验设计 |
| 1.2.2 ELISA测定外源蛋白表达量 |
| 1.2.3 水稻营养生长和生殖生长的适合度指标测定 |
| 1.2.4 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 外源Bt蛋白表达 |
| 2.1.1 外源Cry1Ab/c蛋白的表达 |
| 2.1.2 外源Cry1C~*蛋白的表达 |
| 2.2 外源cry1Ab/c基因对水稻营养和生殖生长指标的影响 |
| 2.2.1 株高 |
| 2.2.2 分蘖数 |
| 2.2.3 剑叶长、宽和面积 |
| 2.2.4 剑叶SPAD值 |
| 2.2.5 生物量 |
| 2.2.6 生殖生长指标 |
| 2.3 外源cry1C~*/bar基因对水稻营养与生殖生长指标的影响 |
| 2.3.1 株高 |
| 2.3.2 分蘖数 |
| 2.3.3 剑叶长、宽和叶面积 |
| 2.3.4 剑叶SPAD值 |
| 2.3.5 生物量 |
| 2.3.6 生殖生长指标 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 杂草竞争和荒地土壤条件下抗虫转基因水稻T1C-19的基因差异表达 |
| 第3章 杂草竞争和荒地土壤条件下抗虫转基因水稻T1C-19的基因差异表达-转录组水平 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 供试材料和种植条件 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 转基因水稻T1C-19外源基因转录水平的检测 |
| 1.2.2 差异基因的筛选和分析 |
| 1.2.3 RT-QPCR检测T1C-19和MH63差异基因的表达量 |
| 1.2.4 双分子荧光互补技术验证外源Cry1Ab/c蛋白与共有差异基因表达蛋白的互作 |
| 1.2.5 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 转基因水稻T1C-19外源基因转录水平的检测 |
| 2.2 外源基因插入对水稻差异基因表达的影响 |
| 2.2.1 共有差异基因数目 |
| 2.2.2 共有差异基因表达量的层次聚类分析 |
| 2.2.3 共有差异基因的GO富集分析 |
| 2.2.4 共有差异基因的KEGG富集分析 |
| 2.3 胁迫种植条件对水稻差异基因表达的影响 |
| 2.3.1 差异基因数目 |
| 2.3.2 KEGG功能富集分析 |
| 2.4 定量PCR检测T1C-19和MH63差异基因的表达量 |
| 2.5 外源Cry1C~*蛋白与共有差异基因表达蛋白的互作 |
| 3 讨论 |
| 3.1 外源基因对转基因水稻转录组的影响 |
| 3.2 逆境条件对转基因水稻差异基因表达的影响 |
| 3.3 表型差异与转录组结果的相关性分析 |
| 第4章 杂草竞争和荒地土壤条件下抗虫转基因水稻T1C-19的基因差异表达-蛋白组水平 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 供试材料和种植条件 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 转基因水稻T1C-19外源蛋白表达水平的检测 |
| 1.2.2 蛋白提取及质量检测 |
| 1.2.3 差异蛋白的筛选和分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 转基因水稻T1C-19外源Cry1C~*蛋白和Bar蛋白表达水平的检测 |
| 2.2 外源基因对水稻差异蛋白表达的影响 |
| 2.2.1 共有差异蛋白数目 |
| 2.2.2 共有差异蛋白表达量的层次聚类分析 |
| 2.2.3 共有差异蛋白GO富集分析 |
| 2.2.4 共有差异蛋白的KEGG富集分析 |
| 2.3 3种胁迫种植条件对水稻差异蛋白表达的影响 |
| 2.3.1 差异蛋白数目 |
| 2.3.2 差异蛋白的KEGG富集分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 外源基因对转基因水稻T1C-19蛋白组的影响 |
| 3.2 逆境条件对转基因水稻T1C-19蛋白组的影响 |
| 第四部分 抗虫转基因水稻华恢1号外源Cry1Ab/c蛋白与水稻内源蛋白互作的研究 |
| 第5章 抗虫转基因水稻华恢1号外源Cry1Ab/c蛋白与水稻内源蛋白组的相互作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料及种植条件 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 主要试验菌株、载体及试剂 |
| 1.1.3 所用引物 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 酵母双杂初筛与外源Cry1Ab/c蛋白互作的水稻内源蛋白 |
| 1.2.2 农杆菌介导的外源Cry1Ab/c蛋白和内源蛋白在烟草细胞中表达的瞬时表达体系构建 |
| 1.2.3 外源Cry1Ab/c蛋白与内源蛋白的亚细胞共定位 |
| 1.2.4 外源Cry1Ab/c蛋白与内源蛋白的双分子荧光互补 |
| 1.2.5 外源Cry1Ab/c蛋白与内源蛋白免疫共沉淀 |
| 2 结果 |
| 2.1 酵母双杂初筛与外源Cry1Ab/c蛋白互作的水稻内源蛋白 |
| 2.1.1 截断的Cry1Ab/c诱饵菌株的自激活验证图 |
| 2.1.2 Y2H Gold共转化系统对文库的筛选结果 |
| 2.1.3 Y2H Gold-Y187双杂系统对文库的筛选结果 |
| 2.1.4 初筛与外源Cry1Ab/c蛋白互作的内源蛋白数目统计结果 |
| 2.1.5 外源Cry1Ab/c蛋白筛选的互作内源蛋白统计结果 |
| 2.2 外源Cry1Ab/c蛋白与功能明确内源蛋白互作真实性的验证 |
| 2.2.1 外源Cry1Ab/c蛋白与水稻内源蛋白的亚细胞定位 |
| 2.2.2 亚细胞共定位技术检测外源Cry1Ab/c蛋白与水稻内源蛋白的互作可能性 |
| 2.2.3 双分子荧光互补技术检测外源Cry1Ab/c蛋白与水稻内源蛋白的互作 |
| 2.2.4 免疫共沉淀技术检测外源Cry1Ab/c蛋白与水稻内源蛋白的互作 |
| 3 讨论 |
| 3.1 蛋白互作在转Bt基因水稻非预期效应产生机制探索中的应用 |
| 3.2 与光合作用候选蛋白的互作及可能的生物学功能 |
| 3.3 与抗逆反应候选蛋白的互作及可能的生物学功能 |
| 第6章 常规栽培条件下抗虫转基因水稻华恢1号外源Cry1Ab/c蛋白的细胞膜定位及其与水稻内源膜蛋白的相互作用 |
| 1 试验材料和方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 主要试验菌株、载体及试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 外源Cry1Ab/c蛋白在水稻叶肉细胞中的定位 |
| 1.2.2 外源Cry1Ab/c蛋白的亚细胞定位 |
| 1.2.3 Western blot技术验证外源Cry1Ab/c蛋白在细胞质和细胞膜中表达量 |
| 1.2.4 外源Cry1Ab/c蛋白与水稻细胞膜蛋白的相互作用 |
| 2 结果 |
| 2.1 外源Cry1Ab/c蛋白的细胞定位 |
| 2.1.1 水稻叶肉细胞中的定位 |
| 2.1.2 外源Cry1Ab/c蛋白的亚细胞定位 |
| 2.1.3 Western blot技术验证外源Cry1Ab/c蛋白在细胞质和细胞膜中表达量 |
| 2.2 外源Cry1Ab/c蛋白与水稻细胞膜蛋白的相互作用 |
| 2.2.1 酵母双杂点对点验证 |
| 2.2.2 V-H~+-ATPase和Ca~(2+)-ATPase的亚细胞定位 |
| 2.2.3 双分子荧光互补 |
| 2.2.4 免疫共沉淀技术 |
| 3 讨论 |
| 第7章 盐碱土壤条件下抗虫转基因水稻华恢1号外源Cry1Ab/c蛋白与水稻开花蛋白的互作 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.1.1 植物材料和生长条件 |
| 1.1.2 主要试验菌株、载体及试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 HH1外源cry1Ab/c基因转录水平和蛋白表达水平的检测 |
| 1.2.2 HH1外源Cry1Ab/c蛋白与5个抽穗期主效蛋白的互作 |
| 1.2.3 外源Cry1Ab/c蛋白与Hd3a主效蛋白互作后Hd3a蛋白表达水平的检测 |
| 1.2.4 水稻5个抽穗期主效基因mRNA转录水平的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 HH1外源cry1Ab/c基因转录和蛋白表达水平的检测 |
| 2.2 外源Cry1Ab/c蛋白与抽穗期主效蛋白的亚细胞共定位 |
| 2.3 外源Cry1Ab/c蛋白与5个抽穗期主效蛋白的互作 |
| 2.3.1 酵母双杂技术检测外源Cry1Ab/c蛋白与5个抽穗期主效蛋白互作 |
| 2.3.2 双分子荧光互补技术检测外源蛋白与5个抽穗期主效蛋白互作 |
| 2.3.3 免疫共沉淀技术检测外源Cry1Ab/c蛋白与Hd3a主效蛋白互作 |
| 2.4 外源Cry1Ab/c蛋白与Hd3a主效蛋白互作后Hd3a蛋白表达水平的检测 |
| 2.5 抽穗期主效基因mRNA表达量的分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）籼稻明恢86多基因遗传转化及再生体系的优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1. 文献综述 |
| 1.1 本论文的立题意义 |
| 1.2 水稻遗传转化的研究 |
| 1.3 水稻遗传转化方法 |
| 1.3.1 直接转化方法 |
| 1.3.1.1 聚乙二醇法 |
| 1.3.1.2 电击法 |
| 1.3.1.3 基因枪法 |
| 1.3.1.4 花粉管通道法 |
| 1.3.2 农杆菌介导法 |
| 1.4 影响水稻遗传转化的因素 |
| 1.4.1 外植体 |
| 1.4.2 培养条件 |
| 1.4.3 继代时间和继代次数 |
| 1.4.4 菌液浓度和菌液侵染转化方法 |
| 1.4.5 外源植物激素 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 水稻品种 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.2 实验仪器和药品 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 主要药品 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 多基因遗传转化载体构建 |
| 2.3.2 水稻遗传转化与筛选 |
| 2.3.2.1 培养基 |
| 2.3.2.2 愈伤组织的诱导及继代 |
| 2.3.2.2.1 准备材料 |
| 2.3.2.2.2 消毒 |
| 2.3.2.2.3 愈伤组织的诱导与继代 |
| 2.3.2.3 农杆菌转化水稻 |
| 2.3.2.3.1 菌株活化 |
| 2.3.2.3.2 农杆菌侵染 |
| 2.3.2.3.3 洗菌 |
| 2.3.2.3.4 抗性愈伤组织的筛选及分化成苗 |
| 2.3.2.3.5 炼苗 |
| 2.3.3 转基因植株的分子检测 |
| 2.3.3.1 CTAB法微量提取水稻基因组DNA |
| 2.3.3.2 抗性植株的PCR分析 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 不同外植体对愈伤组织诱导的影响 |
| 3.2 不同培养条件对筛选愈伤组织的影响 |
| 3.3 草甘磷对明恢86愈伤组织的致死浓度 |
| 3.4 G418对明恢86愈伤组织的致死浓度 |
| 3.5 多基因的遗传转化 |
| 3.6 影响农杆菌介导转化的因素 |
| 3.6.1 菌液浓度对愈伤组织转化率的影响 |
| 3.6.2 侵染时间对愈伤组织转化率的影响 |
| 3.6.3 共培养方式对愈伤组织转化率的影响 |
| 3.6.4 共培养时间对愈伤组织转化率的影响 |
| 3.6.5 2,4-D浓度对愈伤组织诱导的影响 |
| 3.7 抗性植株的获得及检测 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 外植体的选择 |
| 4.2 筛选浓度的确定 |
| 4.3 菌液浓度对转化效率的影响 |
| 4.4 侵染时间对转化率的影响 |
| 4.5 共培养时间和方式对转化效率的影响 |
| 4.6 2,4-D对诱导愈伤组织的影响 |
| 4.7 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 主要缩写词 |
| 附录B |
| 致谢 |
（7）基因组编辑技术定向改良水稻几个产量相关性状（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 水稻高产育种的发展 |
| 1.2 几个水稻产量性状相关基因及其调控机制研究 |
| 1.3 基因组编辑技术 |
| 1.3.1 SSNs的结构和产生DSB的原理 |
| 1.3.2 依靠DNA修复机制实现基因组编辑的原理 |
| 1.3.3 三种主要SSNs技术及其发展 |
| 1.3.4 基因组编辑技术在植物中的应用 |
| 1.3.5 基因组编辑技术在水稻育种上的应用前景 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第2章 利用TALENs技术定点编辑水稻株型调控关键基因IPA1 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 IPA1基因序列和结构分析 |
| 2.2.2 靶位点的选择 |
| 2.2.3 IPA1-TALENS载体构建 |
| 2.2.4 农杆菌介导转化和阳性再生克隆的筛选 |
| 2.2.5 TALENs-IPA1突变体的获得和分析 |
| 2.2.6 TALENs-IPA1转基因植株T_0代的遗传分离分析 |
| 2.2.7 IPA1-TALENs转基因植株后代表型观察和分析 |
| 2.3 小结 |
| 第3章 利用CRISPR/Cas9系统定点突变水稻穗型调控基因创制新型水稻育种材料 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 创制DEP1定点突变新材料 |
| 3.2.2 创制DEP3定点突变新材料 |
| 3.2.3 创制LAC定点突变的新材料 |
| 3.2.4 CRISPR/Cas9转基因植株后代(T_1)遗传分离分析 |
| 3.3 小结 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 基因组编辑技术将为水稻产量相关性状的改良开辟新途径 |
| 4.2 基因组编辑技术突变类型特点 |
| 4.3 水稻株型改良的新思路 |
| 4.4 本研究的后续试验 |
| 参考文献 |
| 附录1 主要试剂与仪器 |
| 附录2 实验方法 |
| 附录3 基因序列测序比对结果 |
| 附录4 TALE蛋白对应模块组合表 |
| 致谢 |
（8）利用基因组编辑技术创制新型水稻雄性不育系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 水稻花粉的发育及雄性不育的产生 |
| 1.2 基于雄性不育的水稻杂种优势育种 |
| 1.2.1 水稻雄性不育资源的类型 |
| 1.2.2 三系法杂种优势利用 |
| 1.2.3 两系法杂种优势利用 |
| 1.3 水稻隐性核雄性不育的研究进展 |
| 1.3.1 水稻花药发育过程中的分子调控 |
| 1.3.2 水稻花药发育相关基因 |
| 1.3.3 水稻隐性核雄性不育资源的应用 |
| 1.4 基因组编辑技术的发展 |
| 1.4.1 锌指核酸酶(ZFNs) |
| 1.4.2 类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs) |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9系统 |
| 1.4.4 三种基因组编辑技术的比较 |
| 1.5 本研究的目的意义 |
| 第二章 利用CRISPR/Cas9系统创制水稻隐性核雄性不育材料 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 试剂和仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 靶位点设计 |
| 2.2.2 CRISPR/Cas9载体构建 |
| 2.2.3 农杆菌介导的水稻遗传转化 |
| 2.2.4 转基因植株的检测 |
| 2.2.5 转基因植株的表型分析 |
| 2.2.6 构建亚细胞定位载体和过表达载体 |
| 2.2.7 水稻原生质体的制备及转化观察 |
| 2.2.8 进化树分析 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 水稻CYP704b2突变材料的创制结果 |
| 2.3.2 水稻DPW突变材料的创制结果 |
| 2.3.3 水稻TIP2突变材料的创制结果 |
| 2.3.4 水稻RTS突变材料的创制结果 |
| 2.3.5 OsIPK基因突变材料的获得及OsIPK基因功能的初步分析 |
| 2.3.6 小结 |
| 第三章 水稻雄性不育保持材料的初步创制 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株和质粒 |
| 3.1.3 试剂和仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 目的基因的克隆 |
| 3.2.2 保持系工程载体的构建方法 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 花粉致死基因的分子检测 |
| 3.3.2 育性恢复基因的分子检测 |
| 3.3.3 水稻雄性不育的保持材料工程载体构建 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录1 实验试剂及仪器 |
| 附录2 实验方法 |
| 附录3 测序比对结果 |
| 致谢 |
（9）水稻规模化转基因技术体系构建与应用（论文提纲范文）
| 1 构建规模化水稻转基因技术体系的必要性 |
| 2 国内外水稻转基因技术体系研究进展 |
| 3 中国近期水稻规模化转基因技术体系构建的进展 |
| 3.1 粳稻规模化转基因技术体系构建 |
| 3.1.1 基于成熟胚的转化技术优化及集成创新 |
| 3.1.2 基于幼胚的转化技术改进 |
| 3.2 籼稻规模化转基因技术体系的构建 |
| 3.2.1 基于成熟胚再生体系及转化体系的改进 |
| 3.2.2 基于幼胚转化技术创新 |
| 3.3 安全转基因技术研究 |
| 3.3.1 建立高效水稻无选择标记转化体系 |
| 3.3.2 安全标记基因转化体系的建立 |
| 3.3.3 水稻规模化转基因技术体系的应用 |
| 3.4 水稻转基因技术发展趋势 |
| 4 问题与展望 |
（10）农杆菌介导籼稻成熟胚高效转化体系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 农杆菌介导法 |
| 1.2 农杆菌介导籼稻遗传转化的研究历程 |
| 1.3 农杆菌介导籼稻转化的主要影响因素 |
| 1.3.1 受体材料的基因型、外植体类型及状态 |
| 1.3.2 农杆菌菌株、载体和侵染方式的选择 |
| 1.3.3 转化各阶段培养基和外源植物激素的影响 |
| 1.3.4 标记基因和选择剂 |
| 1.3.5 抗性愈伤组织的再生 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 籼稻成熟胚愈伤组织的高效诱导 |
| 2.1 供试水稻品种 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 诱导阶段所需要的培养基设计 |
| 2.3.2 高质量水稻成熟胚愈伤组织的诱导 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 不同基因型籼稻不同培养基中愈伤组织的诱导效果 |
| 2.4.2 确定籼稻成熟胚愈伤诱导的影响因素和水平 |
| 2.4.3 讨论 |
| 第三章 籼稻农杆菌转化过程中各参数的优化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 受体品种 |
| 3.1.2 菌株和质粒 |
| 3.1.3 转化各步所用的培养基 |
| 3.1.4 药品 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 农杆菌与愈伤组织共培养 |
| 3.2.2 转化体的筛选方式设计 |
| 3.2.3 筛选标记基因和筛选剂选择的实验设计 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 筛选方式的确定 |
| 3.3.2 标记基因和筛选剂的选择 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 转化体筛选的影响因素 |
| 3.4.2 抗性愈伤的再分化影响因素 |
| 第四章 农杆菌介导籼稻成熟胚高效遗传转化体系的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 质粒载体 |
| 4.1.3 工具酶和药品 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 农杆菌侵染方式、时间的设计 |
| 4.2.2 干燥处理时间的安排 |
| 4.2.3 荧光信号检测及分子验证方法 |
| 4.3 N22 和 Q4041 的遗传转化 |
| 4.3.1 农杆菌浸染方式、时间对籼稻转化率的确定 |
| 4.3.2 干燥处理的结果 |
| 4.3.3 转基因植株的抗除草剂分子鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 共培养前影响农杆菌侵染愈伤组织效果的因素 |
| 4.4.2 干燥处理对愈伤组织分化的影响 |
| 4.5 通过以上部分转化参数的优化．建立了新的农杆菌转化体系 |
| 4.6 目前对提高籼稻遗传转化效率的策略总结 |
| 4.6.1 改良转基因受体品种，创制一批适于高效遗传转化的籼稻受体基因型 |
| 4.6.2 建立良好的籼稻品种胚性细胞系 |
| 4.6.3 优化愈伤组织与农杆菌共培养条件，提高转化效率 |
| 4.6.4 转化体的高效筛选及分化 |
| 4.6.5 水稻遗传转化的发展方向 |
| 第五章 全文结论 |
| 5.1 籼稻成熟胚愈伤组织的高频诱导 |
| 5.2 侵染方式的改进 |
| 5.3 确定干燥处理的时间 |
| 5.4 抗性愈伤组织的有效筛选 |
| 5.5 N22 和 Q4041 遗传转化体系的建立 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立（论文参考文献）
- [1]草甘膦为筛选标记的水稻高效遗传转化体系的建立[J]. 袁冰,丁筠,曹含章,吕尊富,李飞飞. 云南农业大学学报(自然科学), 2021(04)
- [2]三元载体系统的构建及其应用于水稻农杆菌介导的遗传转化研究[D]. 王慧杰. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]籼稻明恢86多基因遗传转化体系的研究[J]. 魏林艳,连玲,魏毅东,罗曦,何炜,谢鸿光,谢华安,张建福. 福建农业学报, 2019(06)
- [4]通过基因差异表达及蛋白互作研究抗虫转基因水稻在不同环境条件下的非预期效应[D]. 付健美. 南京农业大学, 2018
- [5]籼稻明恢86多基因遗传转化及再生体系的优化[D]. 魏林艳. 福建农林大学, 2018(01)
- [6]1个组培特性优良的籼稻品种的发现及其农杆菌转化体系的建立[J]. 童普国,欧阳解秀,阎新,李绍波,廖鹏飞. 湖南农业大学学报(自然科学版), 2016(03)
- [7]基因组编辑技术定向改良水稻几个产量相关性状[D]. 孙庆山. 福建农林大学, 2016(04)
- [8]利用基因组编辑技术创制新型水稻雄性不育系的研究[D]. 郭海花. 福建农林大学, 2016(04)
- [9]水稻规模化转基因技术体系构建与应用[J]. 张欣,付亚萍,周君莉,郭秀平,刘文真,吴洁芳,吴传银,万建民. 中国农业科学, 2014(21)
- [10]农杆菌介导籼稻成熟胚高效转化体系的建立[D]. 贾丽娥. 中国农业科学院, 2012(10)