一、蛋白酶抑制剂对肺炎性损伤的保护作用（论文文献综述）
张轩[1]（2021）在《产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选及其在发酵乳中的应用》文中进行了进一步梳理枯草芽孢杆菌广泛存在于传统发酵食品内,可产生多种对人体有益的生物活性物质。枯草芽孢杆菌发酵的纳豆因其富含具有抗血栓功能的纳豆激酶（Nattokinase）,作为一种风味食品受到部分消费者的青睐。枯草芽孢杆菌液体发酵生产的纳豆激酶也已被用于抗血栓功能食品或药品的制备。另外,也有报道,口服枯草芽孢杆菌可调节机体肠道菌群和免疫功能,发挥抗炎、抗肿瘤以及延缓衰老等作用。目前,纳豆激酶口服产品的剂型单一,且耐胃酸和肠道缓释能力较差;枯草芽孢杆菌益生菌制剂主要为冻干菌粉,食用人群局限。上述产品的局限性,限制了其应用范围。本研究针对上述产品的不足,利用筛选的同时产生纳豆激酶和凝乳酶的枯草芽孢杆菌菌株,研制了一种新型的枯草芽孢杆菌功能发酵乳和一种纳豆激酶口服缓释制剂,对其制备工艺和相关功能进行了系统研究。主要研究内容和结果如下:首先,用从自然界采集的稻草作为发酵菌种的来源制作纳豆,从自制纳豆浸出液中分离、筛选出产双酶（纤维蛋白溶解酶和凝乳酶）的菌株。通过对菌株形态观察和生化特性检测,结合16S rDNA基因序列测定结果,确定此菌株为枯草芽孢杆菌,命名为B.subtilis JNFE0126。在优化后的培养条件下,该菌株产纳豆激酶活性最高达14512.4IU/mL,产凝乳酶活性最高达875.5 SU/mL,可以满足中性条件下制备凝固型发酵乳的要求。酶抑制剂试验结果表明,发酵液纤溶活性来源于丝氨酸蛋白酶,凝乳活性来源于金属蛋白酶。提取该菌株的DNA,根据基因库中已经报道的纳豆激酶和凝乳酶（金属蛋白酶M4）的基因序列设计引物进行PCR基因调取扩增后测序,结果表明该菌株具有上述两种酶的基因,其序列分别与已经报道的纳豆激酶和金属蛋白酶M4具有高度相似性（同源性分别为99.1%和97.6%）。其次,分别收集B.subtilis JNFE0126纳豆激酶和凝乳酶最高产酶期的发酵液,采用硫酸铵沉淀、离子交换色谱及凝胶过滤色谱分别对纳豆激酶和凝乳酶进行分离纯化,然后用SDS-PAGE检验样品纯度及测定其相对分子质量。结果表明,纯化的纳豆激酶和凝乳酶的相对分子质量分别为27 KD和42 KD左右。纳豆激酶最适温度为40℃,最适pH为7.0,pH 6.0-9.0条件下具有较高的酶活和较好的稳定性。凝乳酶的最适作用温度为55℃,最适pH值为6.5,在pH 6.0-8.0条件下具有较高的酶活,在pH 5-10条件下有较好的的稳定性。在此基础上,研究并优化了B.subtilis JNFE0126发酵鲜牛乳制作凝固型发酵乳的配方和发酵条件,评价了所得产品的品质特性和抗血栓功能。优化的配方和发酵条件为:鲜牛乳,大豆蛋白2%,蔗糖4%,羟丙基二淀粉磷酸酯1.5%,果胶0.1%,藻酸丙二醇酯（PGA）0.1%,发酵温度41℃,发酵时间8 h。得到发酵乳为软嫩的乳白色凝乳块,奶香浓郁,口感爽滑,无明显不良风味。扫描电镜观察表明,凝乳块内部呈现海绵状微观结构,酪蛋白胶束及亚胶束相互交联形成整体的三维结构,胶束间仍然存在大量微细孔隙,这些孔隙起着保持水分的作用。发酵乳的纤溶活性达215.1 U/mL,4℃储藏14天酶活性可保留66%,储藏60天活性仍保留43%;小鼠黑尾试验表明,口服该发酵乳具有显着的体内抗血栓效果。应用Dextran sulfate sodium salt（DSS）诱导性炎症性肠病动物模型评价了上述发酵乳对肠道菌群的调节作用和对炎症性肠病的防治效果,并探讨了其作用机制和实际应用前景。动物疾病症状观察和肠道组织病理分析结果表明,口服B.subtilis JNFE0126发酵乳可明显减轻DSS诱导性炎症性肠病动物的疾病严重程度,减轻动物的肠道粘膜的出血、炎症和溃疡等病理损伤;动物肠道菌群的检测分析和和肠粘膜内炎症相关因子和上皮再生相关蛋白表达水平的测定结果表明,口服B.subtilis JNFE0126菌株发酵乳可调节动物的肠道菌群,增加菌群的多样性,抑制有害菌生长;该发酵乳可抑制肠道粘膜内炎症因子表达水平,提高炎症抑制因子表达水平,因而减轻肠粘膜的炎症性损伤。与此同时,B.subtilis JNFE0126发酵乳可促进肠粘膜上皮干细胞的增殖分化,促进粘膜细胞的粘液蛋白和上皮连接蛋白的表达,加速肠粘膜屏障和上皮屏障的修复,从而抵御有害菌和炎症因子的侵入。最后,研制了一种具有双层壳-核结构（壳聚糖核-纳豆激酶-酪蛋白）的纳豆激酶口服缓释颗粒,并通过动物试验评价其在体内抗血栓作用。采用壳聚糖为核心,京尼平为壳聚糖核-纳豆激酶交联剂,牛乳酪蛋白为颗粒外层保护材料,TG酶为保护层的交联剂,按照分步交联的程序制备纳豆激酶缓释颗粒。用扫描电子显微镜对获得的缓释颗粒进行形态学分析,并使用纳米金交联的IgG作为模型药物验证了酪蛋白保护层的包埋效果,确定其形成了双层壳-核结构。通过体外模拟胃、肠液消化试验测定了该缓释颗粒的释放动力学特征,结果表明该颗粒在胃酸中能有效保护纳豆激酶活性,并在肠液中缓释达12小时。最终对该缓释颗粒进行动物口服试验,动态观察颗粒内纳豆激酶的体内缓释过程及其抗血栓效果。结果表明,上述纳豆激酶口服缓释颗粒具有很强的抗胃酸能力,并在肠道内可缓慢释放出纳豆激酶及其不同大小相对分子质量的具有纤维蛋白溶解活性的降解产物,缓释过程超过12小时。小鼠黑尾模型动物口服该颗粒,可明显抑制小鼠尾部血管内的血栓形成并促进血栓溶解,效果显着优于口服游离纳豆激酶。综上所述,本研究利用筛选的B.subtilis JNFE0126制备的发酵乳具有抗血栓和调节肠道功能的作用,有良好的应用前景。本研究开发的纳豆激酶口服缓释颗粒具有耐胃酸能力和肠道缓释功能,可提高纳豆激酶的口服利用度,有望作为功能食品添加剂用于研制抗血栓功能食品。
钟林[2]（2021）在《Fosl1调控脊髓损伤自噬、炎症和凋亡及其分子机制》文中提出脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是一种常见的以神经损害导致相应节段出现各种运动、感觉和括约肌功能障碍,肌张力异常及病理反射等改变的疾病。因神经损伤后的不可恢复性,时至今日依然缺乏有效的治疗措施。它给病人身心带来巨大压力的同时,也给社会和家庭带来了沉重的负担。损伤后的过程分为原发性损伤和继发性损伤。因原发性损伤通常具有突发性和不可预见性,因此很难避免。而干预继发性损伤,减少继发性损伤的严重程度及其危害成为我们研究的方向。Fosl1（Fos like antigen 1）作为一种转录因子,是一开始在研究肿瘤时被发现的,并被证明在多种肿瘤发病及发展中起重要作用。近年来随着研究的广泛,其作用在越来越多的疾病中被发现。研究表明其神经元细胞损伤以及脑损伤中表达明显,而数据库中的数据亦证明其在SCI中高表达,但在SCI中的功能及其作用机制方面的研究没有报道。当脊髓受到损伤时,AMPK信号通路会被磷酸化激活,参与到修复损伤神经的过程中。并且发挥着促进自噬、抑制炎症和细胞凋亡的作用。因此本研究从Fosl1在脊髓继发性损伤中的功能及其信号通路进行探讨及深入研究。一、Fosl1与AMPK在损伤的脊髓组织及神经元细胞中的表达情况我们挖掘Gene Expression Omnibus数据库,通过生物信息技术对其差异基因进行分析,得出Fosl1在早期SCI的脊髓中表达明显升高。同时,我们构建了大鼠的SCI模型,参考数据库中高表达的时间点,在1天时,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）、蛋白质印记（western blotting,WB）、免疫组织化学染色（immunohistochemistry,IHC）对脊髓组织中Fosl1及AMPK表达情况进行检测。以及运用免疫荧光（Immunofluorescence,IF）对神经元进行双染检测神经元细胞中Fosl1表达情况。结果表明:Fosl1和AMPK在损伤组的脊髓组织表达均明显升高,其表达明显高于其它两组。同时免疫荧光双染也证明了在损伤后,神经元中Fosl1与其它两组比较同样表达明显。这些结果反映了Fosl1和AMPK在损伤后的脊髓组织中高表达,同时说明Fosl1在神经元细胞中表达明显升高。二、Fosl1和AMPK在损伤的PC-12细胞中的表达情况,以及Fosl1对其凋亡、炎症、自噬的调控为了进一步了解Fosl1和AMPK在损伤的神经元细胞中的表达情况,我们应用了PC-12这个经典的细胞系来构建损伤的神经元细胞模型,通过q RT-PCR和WB技术对其m RNA和蛋白质两个水平进行检测,得出在损伤的PC-12细胞中,Fosl1和AMPK均呈现出高水平表达的情况。同时为了验证Fosl1的功能及其对AMPK、炎症、凋亡、自噬及细胞活性等的影响,我们运用了小干扰RNA技术对损伤的神经元模型进行Fosl1敲低,结果表明:敲低Fosl1可以明显激活AMPK信号通路。同时ELISA结果显示:敲低Fosl1后的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α明显下降,而与炎症负相关的IL-10却明显上升。为了了解细胞凋亡的情况,我们同时用WB和流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）对其进行检测。FCM结果显示通过抑制Fosl1表达可以降低细胞诱导损伤后的凋亡率。同时,WB结果也显示凋亡正相关蛋白caspase 3、bax明显下降,而凋亡负相关蛋白bcl-2明显升高。对细胞活性的检测结果表明通过抑制Fosl1的表达,细胞活性得到明显提高。而对自噬的检测表明通过敲低Fosl1可以明显增强自噬的活性。三、Fosl1通过AMPK信号通路调控损伤PC-12细胞的自噬、炎症及凋亡为了对其作用机制进行进一步探索,了解Fosl1的作用是不是通过AMPK信号通路进行调控。我们运用了AMPK特异性抑制剂与激动剂对si-Fosl1+H2O2的PC-12细胞进行抑制和激动。我们发现在抑制剂组中,抑制剂明显逆转si-Fosl1的正效应。结果显示:AMPK及p-AMPK的蛋白表达是明显下降的。细胞的促炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）明显上升,而抗炎因子IL-10明显下降。同时细胞的凋亡率及caspase 3、bax明显上升,凋亡保护性蛋白bcl-2却明显下降。对细胞活性及自噬检测也表明:细胞活性表现出显着下降,而自噬活性标志性蛋白Beclin 1、LC3 II/I表达亦明显下降,负相关蛋白p62表达明显升高。四、Fosl1对大鼠脊髓继发性损伤的炎症、凋亡及神经功能的影响以上结果提示Fosl1的促神经元损伤是通过抑制AMPK信号通路,从而发挥抑制自噬、促炎症、促凋亡的作用。为了验证动物体内的情况,我们构建大鼠SCI模型,通过鞘内注射si-Fosl1敲低脊髓组织中Fosl1表达。然后通过WB、BBB评分、免疫荧光、Nissl及TUNEL染色对其各个指标进行检测。结果显示:si-Fosl1组的Fosl1的表达明显受到抑制,而AMPK却显着增强。SCI大鼠的后肢运动功能恢复明显优于其它非敲低组。Nissl及TUNEL染色结果显示:si-Fosl1组的运动神经元要多于其它组,而细胞凋亡情况也比其它组好。同时我们还运用了免疫荧光对炎症因子进行检测,结果表明促炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）明显下降,而抗炎症因子IL-10明显上升。综合以上几个部分实验,我们在体内外分别探索了Fosl1在SCI中的功能及其作用机制。研究发现Fosl1是通过AMPK信号通路来实现对SCI后神经元细胞活性、炎症、凋亡及自噬等的调控。因此我们对Fosl1功能及其作用机制的研究,为了了解脊髓继发性损伤的机制提供了新的思路,同时为治疗SCI提供了新的靶点。
王君宇[3]（2020）在《鹰嘴豆芽素A基于PI3K/AKT信号通路缓解PM10致急性肺细胞损伤机制研究》文中研究指明流行病学研究表明,大气中PM10浓度升高与人群心肺疾病风险增加密切相关。PM10携带的大量有毒有害物质,极易通过上呼吸道纤毛和粘膜物理阻隔,在支气管和肺泡中直接加深和沉积,引发或加重各类心肺系统疾病,严重影响人体健康。鹰嘴豆芽素A（Biochanin A,BCA）作为一种豆科植物中的天然异黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗菌等多种生物活性,在干预PM10诱导的急性肺细胞损伤中的作用越来越受到关注,但其分子作用机制尚不完全清楚。本论文采集天津市大气PM10颗粒物并分析其粒径、成分、形态,结果表明PM10颗粒物的当量直径集中在10μm左右,总体动力学直径在0～100μm范围内。PM10来源广泛,生物、化学成分组成较为复杂,主要由可溶性盐离子(F-、Cl-、NO2-、SO42-、NO3-、PO4-)、重金属以及放射性等元素、有机物（芳香烃及其含氧衍生物、支链/正构烷烃、硅烷衍生物、酮类等）和生物组分组成。通过使用美国动物研究数据库（Tox Ref DB）、体外高通量筛选数据库（Tox Cast DB）和文献检索-生物信息学系统分析明确了PM10中致毒成分与呼吸系统损伤/潜在的关键分子靶点之间的显着相关性;揭示了PM10中致毒成分和预防与治疗PM10致呼吸系统损伤的信号途径及分子靶点:钙离子、丝裂原活化蛋白激酶、磷酸肌醇信号通路为PM10致呼吸系统损伤的主要途径,提示这些通路中的核心蛋白有极大可能性可作为预防与治疗PM10所致损伤的分子靶点。以BCA为研究对象,基于人源支气管正常上皮细胞,构建PM10暴露-BCA保护作用体外细胞模型,通过测定炎症反应、氧化应激等相关生理指标发现,PM10极显着诱发胞内ROS激增,降低胞内CAT水平,引发胞内LDH外流以及脂质过氧化作用现象,极显着上调炎症因子IL-6,IL-8,TNFα基因表达及其释放,促进炎症介质NO的合成及其对应的关键合成酶基因i NOS的转录,而BCA（5、10、20、40μM）和PI3K/AKT靶蛋白抑制剂LY294002（10μM）均可有效干预PM10引起的上述变化,表现出良好的抗炎抗氧化活性。此外,围绕PI3K/AKT信号通路,利用Western Blot和q RT-PCR等分子生物学手段初步揭示了BCA在缓解PM10致急性肺细胞损伤中的调节PI3K/AKT进程作用机制:PM10暴露会极显着影响到胞内生物标记蛋白、PI3K/AKT、DNA碱基修复通路的正常运作,而BCA则可能通过靶向作用于PI3K蛋白在细胞内膜的活化过程,干预XRCC1和PTEN蛋白对PI3K/AKT的调控及PI3K对下游AKT蛋白表达及其磷酸化,进而对下游信号分子产生一定程度的调控以发挥抗损伤功能活性。
李玉美[4]（2020）在《外膜蛋白A-Caspase-1通路在鲍曼不动杆菌肺炎免疫机制的研究》文中研究指明目的:鲍曼不动杆菌（baumannii,A.baumannii）是医院内主要的条件致病菌,免疫功能低下尤其是重症监护病房的患者容易感染。因多重和泛耐药A.baumannii的不断增多且感染后死亡率高达35%,A.baumannii感染的治疗是全世界面临的难题。外膜蛋白A（Outer membrane protein A,Omp A）是A.baumannii主要的毒力因子,可影响病菌生物膜的形成与成熟、对上皮细胞的侵袭与粘附且主要在早期发挥作用,因而探索Omp A的致病机制,是控制A.baumannii早期感染的一个关键因素。宿主先天免疫系统是抵抗细菌感染的第一道防线,探讨Omp A与先天免疫系统的关系可能为A.baumannii感染的治疗提供一种新的策略。方法:第一部分:鲍曼不动杆菌依赖外膜蛋白A增强NLRP3炎症小体的激活（1）利用同源重组法构建Omp A基因敲除/回补突变菌株,通过测序、聚合酶链式反应（PCR）及蛋白免疫印迹（Western blot）鉴定敲除/回补结果。（2）将肺泡上皮细胞按5×104个/ml细胞浓度接种于六孔板培养,直至融合达60-70%时,分为:正常对照组（正常肺泡上皮细胞培养并加入与培养基等量的0.9%生理盐水干预）;Omp A敲除菌株感染组（正常肺泡上皮细胞培养至60-70%融合时加入敲除Omp A的菌株干预,MOI=1）;Omp A回补与野生菌株（WT）感染组（正常肺泡上皮细胞培养至60-70%融合时分别加入回补Omp A的菌株和野生菌株干预,MOI=1）,3h后收集细胞蛋白及RNA样本。Western blot和实时荧光定量（q RT-PCR）检测NLRP3（NOD-Like receptor protein 3,NLRP3）炎症小体相关蛋白IL-1β、IL-18、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、Caspase-1P10/P20及NLRP3、IL-1β、Caspase-1m RNA的表达。（3）自气管注射0.4ml（5×108CFU/ml,OD600约0.1）各型菌液以建立大鼠肺炎感染模型,HE染色等观察肺的病理改变评估模型构建是否成功;髓过氧化物酶（M PO）及肺组织湿/干比重评估肺急性炎性损伤;ELISA及免疫组织化学染色、West ern blot与q RT-PCR检测肺组织NLRP3炎症小体相关蛋白和基因的表达以评判O mp A突变对NLRP3炎症小体激活的影响;流式细胞仪检测CD11b/c-PE+Ly-6G-FI TC的双阳性表达评估中性粒细胞的募集能力变化。第二部分:敲低NLRP3-ASC-Caspase-1炎症小体轴相应蛋白的表达对鲍曼不动杆菌感染的影响正常肺泡上皮细胞按5×104个/ml的浓度接种于六孔板直至融合60-70%,以3μg质粒与9μl PEI/孔的比例分别转染阴性对照质粒（Negative）、NLRP3、ASC及C aspase-1敲低质粒（NLRP3/ASC/Caspase-1-sh RNA）,转染6-8h后更换2%FBS的低血清培养液继续培养至45h,将转染成功的实验细胞分为4组:（1）正常对照组（不做任何处理）,（2）细胞+敲低质粒+Omp A-/-A.baumannii感染组（敲除Omp A的A.baum annii菌株感染,MOI=1）,（3）细胞+敲低质粒+WT A.baumannii感染组（野生型A.b aumannii菌株感染,MOI=1）,（4）细胞+阴性对照质粒（Negative）+WT A.baumanni i感染组（野生型A.baumannii菌株感染,MOI=1）,持续感染3h收集细胞蛋白及RN A样本,Western blot及免疫组织化学法与q RT-PCR检测NLRP3炎症小体相关蛋白和基因的表达评判A.baumannii致病能力变化。第三部分:MG-132抑制蛋白酶体的泛素化降解对鲍曼不动杆菌感染的影响（1）正常肺泡上皮细胞按5×104个/ml细胞浓度接种于六孔板直至融合60-70%,将实验细胞随机分为3组:（1）正常对照组（不做任何处理）,（2）细胞+Omp A-/-A.baumannii感染组（敲除Omp A的A.baumannii菌株感染,MOI=1）,（3）细胞+Omp A-/-A.baumannii组（敲除Omp A的A.baumannii菌株感染,MOI=1）+MG-132（浓度10 m M）,持续感染3 h,探索蛋白酶抑制剂对敲除Omp A后A.baumannii感染的影响。（2）再将感染菌株更换为野生型菌液构建体外感染模型,分组同前,持续感染3h收集样本,Western blot、免疫组织化学和q RT-PCR检测NLRP3炎症小体相关蛋白和基因的表达,探索MG-132对野生型A.baumannii感染的影响,推断Om p A与Caspase-1的关系。（3）气管注射0.4ml（5×108CFU/ml,OD600大约0.1）敲除菌液构建大鼠体内肺炎感染模型,实验动物随机分为3组（1）正常对照组（气管慢慢注入0.4毫升0.9%的生理盐水构建对照组,n=10）;（2）Omp A-/-模型组（等量的敲除菌株菌液构建感染模型,每天以0.4毫升0.9%的生理盐水持续腹腔注射3天构建阳性对照组,n=10）;（3）Omp A-/-+MG-132模型组（等量的敲除菌株菌液构建感染模型,每天MG-132以0.1 mg/kg/d持续腹腔注射3天,n=10）,注意腹部保护;同样将感染菌株更换为野生型A.baumannii菌液构建感染模型。至模型构建完成后,按照贵州医科大学伦理委员会的要求处理动物。HE染色观察肺的病理改变;MPO及肺组织湿/干比重评判肺急性损伤的炎性程度;ELISA、免疫组织化学染色、Western blot和q RT-PCR检测肺组织NLRP3炎症小体相关蛋白和基因以及泛素相关蛋白K48/K63/PD41的表达以判定MG-132与NLRP3炎症小体激活的关系和Omp A的可能作用。结果:第一部分:鲍曼不动杆菌依赖外膜蛋白A增强NLRP3炎症小体的激活（1）成功构建Omp A突变菌株:测序、PCR及Western blot结果均显示同源重组法成功构建敲除/回补突变菌株。（2）体外感染模型证实A.baumannii感染后Omp A增强NLRP3炎症小体的激活:感染组NLRP3炎症小体相关蛋白IL-1β、IL-18、ASC、Caspase-1P10/P20的表达显着高于正常对照组（p<0.05）;与敲除组相比,回补与野生组NLRP3炎症小体相关蛋白的表达增高（p<0.05）,但回补与野生型两组相比差异无统计学意义（p>0.05）;NLRP3、IL-1β、Caspase-1的m RNA水平变化趋势与蛋白表达结果一致。（3）体内感染模型影响NLRP3炎症小体的激活趋势与体外一致:成功复制大鼠肺炎模型,感染组HE染色结果为进行性加重的重症弥漫性间质肺炎,其中回补组与野生型两组病理变化相似,两组病理损伤程度均比敲除组显着。所有感染组的MPO及肺组织湿/干比重的比值均显着高于正常对照组（p<0.05）,与敲除组相比,回补与野生两组比值增高的更明显（p<0.05）;流式细胞仪检测CD11b/c-PE+Ly-6G-FITC双阳性表达率为敲除组43.88%,明显低于野生型组的83.32%（p<0.05）,回补基因片段后阳性率提高到73.6%,提示敲除Omp A基因后中性粒细胞的募集能力减弱,回补基因片段后募集能力提高,均明显高于敲除组（p<0.05）;NLRP3炎症小体相关蛋白的表达及m RNA的表达和IL-1β、IL-18的水平均在回补与野生型两组表达最高,敲除组中表达降低（p<0.05）,所有感染组的表达均高于正常组（p<0.05）,但回补与野生型组之间差异无统计学意义（p>0.05）。第二部分:敲低NLRP3-ASC-Caspase-1炎症小体轴相应蛋白的表达对鲍曼不动杆菌感染的影响（1）特异性的敲低NLRP3与Caspase-1的表达后,敲低组内NLRP3炎症小体相关蛋白IL-1β、IL-18、ASC、Caspase-1P10/P20及m RNA的表达与阴性对照组相比均明显降低（p<0.05）,敲低组内敲除株感染组中NLRP3炎症小体相关蛋白及m RNA的表达均低于敲低野生型株感染组（p<0.05）。（2）特异性的敲低ASC的表达后,敲低组中敲除株感染组与敲低野生型株感染组内NLRP3炎症小体相关蛋白及基因m RNA的表达量变化小（p>0.05）,敲低组与阴性对照之间的差异无统计学意义（p>0.05）。第三部分:MG-132抑制蛋白酶体的泛素化降解对鲍曼不动杆菌感染的影响（1）敲除菌株构建的体内/体外感染模型均显示:MG-132处理后各组内Caspase-1m RNA的水平变化不大即Caspase-1m RNA的合成没有增多（p>0.05）,但Caspase-1P10/P20蛋白的表达明显升高（p<0.05）,这种现象可能是MG-132抑制蛋白酶体对Caspase-1的降解所致。体内模型的病理结果显示在MG-132干预后炎症损伤加重,同时体内/体外MG-132干预模型组NLRP3炎症小体相关蛋白IL-1β、IL-18、ASC和泛素蛋白PD41/K48/K63及ELISA检测的IL-1β、IL-18和NLRP3、IL-1βm RNA的表达量均显着高于对照及敲除株感染组（p<0.05）;体内MG-132干预模型组MPO及组织湿/干比重的比值与其蛋白等表达的结果一致。（2）成功复制野生型菌株构建体内/体外感染模型,体内模型的病理改变在MG-132干预后炎症损伤加重,MG-132干预组NLRP3炎症小体相关蛋白IL-1β、IL-18、ASC、Caspase-1P10/P20和泛素蛋白PD41/K48/K63及ELISA检测的IL-1β、IL-18和NLRP3、IL-1βm RNA的表达量均显着高于对照及野生型株感染组（p<0.05）,而Caspase-1m RNA的合成无明显变化,体内MG-132干预模型组MPO及组织湿/干比重的比值与其蛋白等表达的结果一致,故推断Omp A依赖Caspase-1途径加剧对机体的损伤。结论:（1）鲍曼不动杆菌可以经Omp A激活NLRP3炎症小体通路,引起炎性损伤,且可能与NLRP3/Caspase-1途径相关。（2）MG-132可通过抑制Caspase-1降解,加剧鲍曼不动杆菌感染后炎性损伤,为临床寻找有效治疗靶点提供一定的理论依据。
郭咏梅[5]（2020）在《硒通过TrxR1/MAPK信号通路缓解奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的机理研究》文中提出围产期和泌乳前期的高产奶牛由于生理的变化和高的代谢水平,抗氧化功能显着降低,容易诱发氧化应激,导致疾病易感性增加。奶牛乳腺上皮细胞（BMEC）是乳脂和乳蛋白合成与分泌的重要场所,其细胞的生物合成能力决定了奶牛乳腺的产奶能力。因此,深入研究硒（Se）减缓BMEC氧化应激的机理对科学合理的补加Se,缓解奶牛氧化应激,优化奶牛抗氧化防御能力具有重要的理论与实际意义。本论文以BMEC为细胞模型,分别以外源性一氧化氮（NO）诱导细胞氧化损伤、以二硝基氯苯（DNCB）抑制硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性并诱导细胞氧化损伤、以白介素1受体拮抗剂（IL-1Ra）抑制白介素-1（IL-1）生物活性、以丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路抑制剂抑制其磷酸化水平、并结合过表达技术对TrxR1进行过表达,从TrxR1/MAPK/NO途径深入研究了 Se缓解BMEC氧化损伤的可能机制。本论文共分为6个试验。试验1采用单因子完全随机试验设计,研究不同剂量的Se（0、10、20、50、100、150、200 nmol/L）对BMEC抗氧化功能的调节作用,初探正常生理条件下Se对TrxR活性和NO合成的影响,为进一步探讨其促进机理提供基础。结果表明,Se对BMEC的相对增殖率（RGR）、TrxR、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性及其基因表达、超氧化物歧化酶（SOD）活性与总抗氧化能力（T-AOC）的促进作用,以及对丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的抑制作用呈显着的剂量依赖效应,即Se对BMEC的抗氧化功能的促进作用呈剂量依赖性。综合多项指标得出,以50 nmol/L处理组较好,100～200nmol/L处理组促进作用削弱。然而,Se的添加对正常BMEC的炎症细胞因子IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及诱导性一氧化氮合酶（iNOS）活性及其基因表达、NO含量、核转录因子E2相关因子2（Nrf2）的基因表达无显着影响。试验2采用完全随机试验设计,以RGR、抗氧化及炎症因子等指标为判断指标,研究不同浓度的 NO（0、250、500、750、1000、1250、1500μmol/L）,分别作用 2、4、6、8、12和24 h,筛选出适宜的NO氧化损伤建模浓度及作用时间。结果显示,过量的NO可诱导BMEC的氧化应激,以二乙烯三胺/一氧化氮聚合物（DETA/NO）作为外源性NO,处理浓度为1000 μmol/L作用时间为6h,RGR降低至76.61%,引起SOD、CAT、GPx活性降低,MDA含量、炎症因子及NO含量、iNOS活性升高,可以作为建立BMEC氧化损伤模型的适宜条件。试验3以试验2为基础,以NO诱导BMEC的氧化损伤,采用完全随机试验设计,研究不同剂量的Se（0、10、20、50、100、150及200 nmol/L）对BMEC氧化损伤的保护和可能的调节作用机制,并筛选出Se的适宜添加剂量。结果表明,NO过量诱导BMEC发生了氧化应激,引起RGR与SOD、T-AOC、CAT活性显着下降,GPx、TrxR的活性及其基因与蛋白表达、Nrf2的基因表达呈现相似的变化;而ROS活性、MDA含量呈现相反的变化趋势;p38丝裂原激活蛋白激酶（p38MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的基因表达也显着升高,并增加了其下游IL-1等炎症因子、iNOS的表达。Se的添加显着逆转了上述指标的变化,说明Se对NO诱发的氧化应激具有显着的减缓效果,减少了 IL-1的生成,降低了 iNOS的活性与NO的释放。这可能与增高的TrxR活性及其基因与蛋白表达,进而抑制了 MAPK信号通路的激活有关。Se对过量NO诱导的细胞损伤的保护作用呈剂量依赖性,其中以20～100 nmol/L的Se保护组保护作用较好,尤其以50 nmol/L的Se保护组的保护效果更好,然而,过高浓度的Se则未能逆转NO诱导的细胞损伤,甚至会对细胞造成一定的损伤作用。试验4以试验3为基础,采用完全随机试验设计,以DNCB抑制TrxR活性并诱导BMEC氧化应激,以IL-Ra抑制IL-1生物活性,从TrxR/IL-1/NO途径探究Se缓解NO诱导BMEC氧化应激的机理。将BMEC随机分为8组,分别是:对照组（CON）、Se 处理组（Se）、DNCB 损伤组（DNCB）、IL-1Ra 处理组（IL-1Ra）、Se+DNCB预保护组（S+D）、Se+IL-1Ra 处理组（S+I）、DNCB+IL-1Ra 保护组（D+I）、Se+DNCB+IL-1Ra处理组（S-D+I）。结果表明,DNCB抑制了 TrxR的活性及其基因与蛋白质的表达,导致凋亡信号调节激酶-1（ASK-1）活性升高,激活了 p38MAPK及JNK信号通路,增加了下游因子IL-1及NO浓度,诱导BMEC发生了氧化应激。IL-1Ra抑制了 IL-1的生物活性,降低了 NO过量生成,减缓了 DNCB引起的氧化应激,说明IL-1是诱发NO大量产生引起细胞氧化应激的关键因子。Se对DNCB引起的BMEC氧化损伤具有缓解作用,Se的添加促进了 TrxR的活性及其基因与蛋白质的表达;可逆转DNCB引起的p38MAPK及JNK信号通路的激活,进而抑制IL-1的生成、iNOS活性及NO的过量产生。这说明Se通过TrxR抑制IL-1的活性发挥其对BMEC氧化应激的减缓作用。试验5采用完全随机试验设计,以DNCB抑制TrxR活性并诱导BMEC氧化应激,以 SB203580、SP600125、PD98059 分别抑制 p38MAPK、JNK、ERK1/2 信号通路,将第三代贴壁生长的BMEC随机分为7个处理组,分别是:对照组、DNCB损伤组、Se 处理组、DNCB+Se 预保护组、DNCB+SB203580、DNCB+SP600125、DNCB+PD98059,从TrxR/MAPK/NO途径探究Se缓解NO诱导BMEC氧化应激的机理。结果表明,DNCB抑制了 TrxR活性,ASK-1活性增加,下游p38MAPK及JNK通路被激活,并导致IL-1过量释放,诱发BMEC氧化应激,Se的预保护作用逆转了 BMEC内的氧化损伤,增强了 TrxR的表达,ASK-1活性及p38MAPK及JNK通路磷酸化水平受到抑制,逆转了 IL-1的过量释放及其下游iNOS-NO级联。当p38MAPK及JNK通路分别受到SB203580、SP600125抑制后,DNCB诱导的细胞氧化损伤被抑制,MAPK信号通路下游因子IL-1含量、iNOS活性及其基因和蛋白表达受到显着抑制,进而保护细胞免受NO蓄积的损伤,这提示Se通过TrxR抑制p38MAPK及JNK通路的激活缓解BMEC的氧化损伤。试验6采用完全随机试验设计,以NO诱导BMEC氧化损伤,采用基因过表达技术对TrxR1进行过表达,将BMEC随机分为4个组,分别是:对照组、NO损伤组、NO+Se预保护组、NO+TrxR1 OE组,进一步研究TrxR1对细胞中iNOS、IL-1β等炎症因子及p38MAPK及JNK信号通路相关因子的表达的影响,验证TrxR1基因是否是Se缓解BMEC氧化损伤的关键基因。结果表明,过表达TrxR1基因显着降低了 p38MAPK及JNK信号通路的基因表达及磷酸化水平,及其下游IL-1β和iNOS的基因与蛋白表达,减缓了 NO诱导的氧化损伤,进一步验证了 TrxR1是Se缓解BMEC氧化应激损伤的关键基因。综上所述,本研究从TrxR1/MAPK/NO途径探讨了 Se促进BMEC抗氧化功能、缓解NO诱导BMEC氧化应激的保护机制,即Se通过促进TrxR1的基因和蛋白表达,抑制了 p38MAPK/JNK信号通路的磷酸化水平,进而降低了 IL-1β和iNOS的基因与蛋白质表达,抑制了 NO的过量释放,保护了 BMEC免受氧化应激的损伤。
刘凯雄[6]（2020）在《巨噬细胞诱导型C型凝集素受体在肺纤维化中的机制研究》文中研究说明研究背景特发性肺间质纤维化（Idiopathoic pulmonary fibrosis,IPF）是一种病因不明的肺间质疾病。相关研究显示巨噬细胞极化和损伤模式识别在肺纤维化中起重要的作用。巨噬细胞诱导型C型凝集素受体（Macrophage-inducible C-type lectin,Mincle）作为模式识别受体参与无菌性炎症。本课题拟研究Mincle介导信号通路在肺纤维化中的机制。研究目的研究Mincle在肺纤维化肺组织的表达,以及识别特定配体介导相关信号通路,影响肺纤维化的机制。研究方法1、研究IPF患者以及博莱霉素（Bleomycin,BLM）诱导的肺纤维化小鼠肺Mincle的表达。体外研究BLM刺激MHS细胞Mincle的表达。2、研究IPF患者以及BLM诱导的肺纤维化小鼠肺剪接体相关蛋白130（Spliceosome-associated protein 130,SAP130）的表达。明确纤维化肺组织Mincle能否识别和结合SAP130。3、采用功能获得或缺失策略,研究Mincle基因敲除和Mincle激活对博莱霉素（Belomycin,BLM）诱导肺纤维化的影响。4、研究Mincle敲除对肺纤维化小鼠肺部M2型巨噬细胞极化的影响。通过肺泡巨噬细胞消除和过继方法研究Mincle+/+的肺泡巨噬细胞对小鼠肺纤维化的影响。5、应用RNA芯片对BLM诱导的肺纤维化的C57小鼠和Mincle KO小鼠肺组织进行差异性基因筛选。通过抑制脾脏酪氨酸蛋白激酶（spleen tyrosine kinase,Syk）和Caspase召集区域9（Caspase recruitment domain 9,CARD9）基因缺失手段研究6、Mincle/Syk/CARD9信号通路对肺纤维化影响。研究结果1、IPF患者肺组织和BALF,以及肺纤维化小鼠肺组织Mincle的表达升高。BLM可刺激MHS细胞Mincle表达增加。2、IPF患者肺组织、BALF和血清,以及肺纤维化小鼠肺组织SAP130升高。IPF患者和小鼠肺纤维化肺巨噬细胞上Mincle可识别SAP130。3、Mincle基因敲除减轻肺纤维化。Mincle激动剂TDB和配体SAP130可以加重BLM诱导的肺纤维化。4、Mincle基因敲除可减少肺巨噬细胞M2极化。转输Mincle+/+肺泡巨噬细胞可加重Mincle KO小鼠肺纤维化。5、RNA芯片显示Mincle KO肺纤维小鼠CARD9基因表达下调。Mincle基因缺失可通过下调Syk/Card9信号通路表达减少肺巨噬细胞M2极化,减轻BLM诱导的肺纤维化。研究结论Mincle识别SAP130介导Syk/Card9信号通路影响肺M2型巨噬细胞极化进而影响肺纤维化。
刘慧[7]（2020）在《小檗碱诱导线粒体自噬干预流感病毒激活的ROS-NLRP3炎性体通路的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景与目的病毒性肺炎是由多种呼吸道病毒引起的临床常见病、多发病,流感病毒为其最常见的病原体。流感病毒性肺炎作为流感病毒感染引起的严重并发症,具有较高的死亡率。目前认为流感病毒性肺炎的主要发病机制是病毒入侵后与机体相互作用导致的过度炎症反应和免疫病理损伤,这也是新冠肺炎、SARS等临床重症病毒性肺炎的共有发病机制。现今临床对于流感病毒性肺炎的治疗,尚缺乏专属的特效治疗药物。中医药具有多靶点、多机制及多环节的作用特点,在抗炎及免疫调节方面疗效显着,对防治病毒性肺炎具显着优势。小檗碱（Berberine,BBR）是从黄连、黄柏等清热解毒药物中提取的异喹啉生物碱,是目前公认的具有广泛抗炎和免疫调节作用的药物。课题组前期研究表明,小檗碱可显着减轻流感病毒性肺炎小鼠肺组织炎性损伤,降低病毒性肺炎小鼠的死亡率,还可明显降低流感病毒感染的巨噬细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的水平,但其具体作用机制尚不明确。近年来,细胞自噬限制炎性体活化,抑制炎症反应的研究引起广泛关注。且相关研究表明细胞自噬参与肺部炎性反应,NLRP3炎性体过度活化在甲型流感病毒性肺炎的炎性反应中也发挥重要作用。细胞内的累积的ROS主要来源于损伤线粒体,且被认为是NLRP3炎性体激活调控的中心,而线粒体自噬是清除损伤线粒体,防止ROS累积的主要方式。因此,本研究从线粒体自噬-ROS-NLRP3炎性体这一新的角度,探究小檗碱是否可通过诱导线粒体自噬,清除流感病毒感染的组织或细胞内累积的ROS,进而使NLRP3炎性体激活受限,遏制流感病毒引起的炎性损伤,以进一步探讨小檗碱抑制流感病毒诱发过度炎症反应的机制,为小檗碱治疗流感病毒性肺炎的机制研究提供新的理论和实验依据,同时为抑制流感病毒性肺炎过度炎症反应的发生寻找新途径。研究方法1.细胞实验:构建流感病毒PR8感染小鼠J774A.1巨噬细胞模型（1）设置正常组、模型组（PR8,MOI=1）、MSU（150μg/mL）组、BBR（16.8μM）组、PR8+BBR 组、PR8+MSU 组及 PR8+MSU+BBR 组。Western blot 检测 NLRP3 蛋白表达,流式细胞术检测Caspase1活性,ELISA检测IL-1β分泌水平。（2）设置BBR组及Mito-TEMPO（线粒体特异性抗氧化剂,500μM）组,流式细胞术检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）、线粒体 ROS（mitochondrial ROS,mtROS）水平及Caspase1活性,同时检测NLRP3蛋白表达及IL-1β分泌水平。（3）设置正常组、模型组、PR8+BBR 组、PR8+3-MA（5 mM）组及 PR8+3-MA+BBR组,同时设置BBR对照组与3-MA对照组。Western blot检测LC3Ⅱ、P62蛋白表达;免疫荧光检测自噬体-线粒体共定位;透射电镜观察细胞自噬结构。（4）实验分组同（3）,流式细胞术检测MMP、mtROS释放水平及Caspase1活性;同时检测NLRP3蛋白表达及IL-1β分泌水平。（5）设置正常组、模型组、PR8+BBR组、PR8+CsA（5mM）组及 PR8+CsA+BBR 组,同时设置BBR对照组与CsA对照组。Western blot检测各组细胞LC3Ⅱ、BNIP3蛋白表达,免疫荧光检测自噬体-线粒体-BNIP3共定位;同时J774A.1巨噬细胞转染BNIP3siRNA,检测LC3Ⅱ、BNIP3 蛋白表达。2.动物实验构建小鼠流感病毒性肺炎模型,分为正常组、模型组、BBR（10mg/kg/d）治疗组、BBR+3-MA（15mg/kg/d）治疗组。观察各组小鼠肺大体病变、肺指数,Western blot检测小鼠肺组织LC3Ⅱ、P62及BNIP3蛋白表达,流式细胞术检测各组小鼠肺组织ROS释放水平,Western blot检测Caspase1p20、NLRP3蛋白表达,流式细胞术检测MMP、mtROS释放水平及Caspase1活性;同时检测NLRP3蛋白表达及IL-1β分泌水平。研究结果1.流感病毒感染可显着提高巨噬细胞内NLRP3蛋白表达、Caspase1活性及IL-1β分泌水平,导致NLRP3炎性体活化;小檗碱可降低流感病毒感染的巨噬细胞NLRP3蛋白表达、Caspase1活性及IL-1β分泌水平,抑制NLRP3炎性体活化。2.流感病毒可导致巨噬细胞线粒体损伤,mtROS累积及NLRP3炎性体活化;小檗碱和Mito-TEMPO均可减轻流感病毒导致的线粒体损伤,减少mtROS释放,抑制NLRP3炎性体激活。表明mtROS在NLRP3炎性体活化中的重要作用,而小檗碱抑制NLRP3炎性体活化可能与其减轻线粒体损伤,从而减少细胞内mtROS累积有关。3.小檗碱可提高流感病毒感染的巨噬细胞内自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达,减少p62蛋白表达;同时免疫荧光实验可见明显自噬体-线粒体共定位,透射电镜可观察到线粒体自噬小体结构。表明小檗碱可诱导流感病毒感染的巨噬细胞线粒体自噬。4.自噬/线粒体自噬抑制剂3-MA可加重流感病毒感染的巨噬细胞线粒体损伤,增加mtROS累积,促进NLRP3炎性体活化;小檗碱可3-MA加剧的线粒体损伤,减少mtROS释放,逆转其导致的NLRP3炎性体活化。表明小檗碱减少mtROS释放,进而抑制NLRP3炎性体活化的机制与其诱导线粒体自噬有关。5.小檗碱可提高流感病毒、CsA及BNIP3siRNA干预的巨噬细胞内BNIP3、LC3II蛋白表达,降低p62蛋白表达,并可见明显的自噬体-线粒体-BNIP3共定位;在BNIP3-siRNA转染组LC3II蛋白表达均有所下降,表明敲减BNIP3可在一定程度抑制小檗碱对细胞线粒体自噬的上调作用。表明小檗碱诱导线粒体自噬部分依赖BNIP3途径,并可能与其提高BNIP3蛋白表达有关。6.小檗碱可显着减轻流感病毒性肺炎小鼠肺组织炎症损伤,提高LC3Ⅱ、BNIP3蛋白表达,减少p62蛋白表达;同时小檗碱可减少小鼠肺组织ROS释放,降低Caspase1p20、NLRP3蛋白表达及IL-1β分泌水平,而自噬抑制剂可逆转小檗碱的作用。体内实验验证了体外实验的研究结果,表明小檗碱减轻流感病毒性肺炎小鼠肺部炎性损伤的机制与其诱导线粒体自噬,减少ROS释放,进而抑制NLRP3炎性体过度活化有关。研究结论小檗碱可诱导线粒体自噬,清除损伤的线粒体,减少ROS释放,进而抑制NLRP3炎性体过度活化,减少IL-1β等炎性因子分泌,从而抑制流感病毒引起的过度炎症反应,减轻流感病毒感染导致的炎性损伤。小檗碱诱导线粒体自噬部分依赖BNIP3途径。本研究为抑制流感病毒性肺炎过度炎症反应的发生提供了新途径,为小檗碱治疗流感病毒性炎的机制研究提供了新的理论和实验基础。
董训虎[8]（2020）在《维生素D3通过抑制NLRP3炎性小体活化改善氮芥诱导皮肤炎性损伤的作用和机制研究》文中进行了进一步梳理糜烂性毒剂（vesicants或blistering agents）是迄今仍具极大军事威胁的经典化学战剂之一。烷化剂氮芥（nitrogen mustard,NM）是糜烂性毒剂的典型代表,可引起难愈性皮肤损伤,尚缺乏有效治疗措施。研究表明,NM引起皮肤损伤的机制多样且复杂。目前认为,炎症反应在NM引起的皮肤损伤中起关键作用,贯穿NM诱导皮损发生、发展的全过程。然而,NM引起的皮肤炎症损伤的确切机制,至今仍未阐明,也是限制特效抗毒剂研发的关键所在。因此,明确NM诱导皮肤炎症损伤的确切机制,对于研制、开发特效抗毒药物有重要的军用价值,拓展对烷化剂类引起的炎症反应的认识。NLRP3（NLR pyrin domain containing 3）炎性小体是一种细胞内蛋白复合物,可被多种病原、大分子和环境刺激物激活。激活的NLRP3炎性小体可使Caspase-1活化,剪切IL-1β和IL-18而使其成熟,在维持固有免疫系统功能尤其是炎症反应中发挥重要作用;但是,过度激活NLRP3炎性小体可引发严重的炎症反应,进而造成机体损伤。近年来研究发现,NLRP3炎性小体介导的炎性损伤在理化刺激如紫外光、二硝基氟苯等引起的皮肤损伤的发生发展中起关键作用,抑制NLRP3炎性小体介导的炎性损伤可能成为防治该类损伤的新靶点。维生素D3（Vitamin D3,VD3）是一种脂溶性类固醇类激素,其主要由皮肤合成,具有显着的抗炎、抗氧化和代谢调节作用。最新研究证实,VD3能抑制NM诱导的小鼠皮肤炎性因子的释放,促进皮肤损伤愈合;同时还发现,VD3对NLRP3炎性小体有重要的调控作用。然而,关于NLRP3炎性小体在VD3改善NM诱导的皮肤炎性损伤中的作用及机制,目前尚未见相关报道。此外,前期研究证实,线粒体活性氧自由基（mitochondrial reactive oxygen species,mtROS）是NLRP3的重要激活因子之一;而线粒体去乙酰化酶SIRT3（Sirtuin 3）可通过直接结合并去乙酰化超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase2,SOD2）,增加SOD2活性维持mtROS的稳态,进而在调控NLRP3炎性小体活化中起关键作用。因此,基于现有的科学实验证据,我们提出如下假说:VD3可能通过调控“SIRT3-SOD2-mtROS”信号通路,抑制NLRP3炎性小体活化,进而改善NM诱导的皮肤炎性损伤”。为了验证该假说,本研究通过建立NM染毒皮肤损伤体内外模型,利用多种抑制剂、siRNA、激光共聚焦、Western blot等实验技术,首先检测了NLRP3炎性小体在NM诱导皮肤炎性损伤中的作用;同时,研究了“SIRT3-SOD2-mtROS”信号通路在其中的可能作用;并进一步探讨了该信号通路在VD3改善NM诱导皮肤炎性损伤中的作用,深入阐述了VD3改善NM诱导皮肤损伤的分子作用机制。本实验的主要实验结果如下:（1）NM诱导角质形成细胞炎性损伤。主要表现为:当NM浓度≤20μM时,对细胞增殖活力和形态无明显影响,却能浓度依赖性激活细胞促炎因子IL-1β的表达和分泌,上调COX2的表达水平。（2）NLRP3炎性小体在NM诱导角质形成细胞炎性损伤中发挥关键作用。NM能够浓度依赖性激活NLRP3炎性小体;抑制NLRP3炎性小体后,NM诱导的炎性损伤效应被显着削弱。（3）“SIRT3-SOD2-mtROS”信号通路在NM诱导角质形成细胞NLRP3炎性小体活化中具有重要作用。NM通过抑制SIRT3-SOD2通路促进细胞mtROS的生成,进而激活NLRP3炎性小体和炎性因子的生成;清除细胞内的mtROS能够显着抑制NM对NLRP3炎性小体的活化作用,改善细胞炎性损伤。（4）NLRP3炎性小体在VD3改善NM角质形成细胞炎性损伤中发挥重要作用。VD3能够显着抑制NM诱导的NLRP3炎性小体的生成,减少炎性因子表达和释放。（5）VD3通过激活SIRT3相关信号通路抑制NM诱导的NLRP3炎性小体活化。体外实验发现,VD3能部分逆转NM对SIRT3-SOD2抗氧化通路的抑制效应,同时减少mtROS生成,进而抑制NLRP3炎性小体活化及其介导的炎性因子生成,改善NM诱导角质形成细胞炎性损伤。利用SIRT3抑制剂和si RNA处理后,可明显抑制VD3对NM诱导的NLRP3炎性小体活化的抑制作用。同时,体内实验也证实,VD3干预能恢复NM染毒皮肤中SIRT3和SOD2的表达和活性,抑制皮肤组织炎性因子的生成,加速皮肤损伤修复。提示,SIRT3/NLRP3信号通路在VD3抑制NM诱导的皮肤炎性损伤中发挥重要作用。综上所述,本研究首次证实,糜烂性毒剂NM可以通过抑制“SIRT3-SOD2-mtROS”信号通路,使NLRP3炎性小体过度活化,引起角质形成细胞的炎性损伤;VD3可通过该信号通路抑制NLRP3炎性小体活化,从而改善NM诱导的角质形成细胞和皮肤的炎性损伤。研究结果对于进一步揭示NM诱导皮肤损伤及VD3改善NM诱导皮肤损伤的具体作用机制提供了新的视角;同时对于探索NM中毒防治新策略具有潜在的应用价值。
苏国旗[9]（2019）在《猪β防御素114的表达调控机制及其在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用研究》文中进行了进一步梳理防御素是哺乳动物先天免疫的重要组成部分,近些年的研究发现防御素具有抗菌活性、促炎抗炎、适应性免疫等多种生物学功能,既具有开发成抗生素替代品的潜力,又可以作为提高抗病力的药物靶点。2012年通过对猪的基因组比对分析发现了猪βdefensin 114（PBD114）,目前为止PBD114的表达调控机制,生物学功能及其机制尚未有报道。因此本研究开展五个试验,首先克隆并分析了PBD114基因序列,比较了不同品种猪PBD114基因表达的差异,探索了PBD114的表达调控机制;在此基础上,成功表达出PBD114蛋白,并以小鼠和IPEC-J2细胞为模型,研究了PBD114在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用和机制。主要研究结果如下:试验一PBD114基因的克隆、序列分析及其在不同品种猪间的差异表达藏猪是西藏和川西地区特有的猪种之一,与外种猪相比,具有耐粗饲和抗病力强的优点。本试验分别以藏猪和DLY猪的cDNA为模板,克隆了藏猪和DLY猪PBD114基因CDS序列,用DNAMAN比对分析,且分析了猪、人、大猩猩和瘤牛的βdefensin114的氨基酸序列。结果表明:藏猪和DLY猪的PBD114基因CDS区序列完全一致,猪、人、大猩猩和瘤牛的beta defenisn 114同源性比较近;为研究PBD114在不同品种猪间的表达规律,选取6头60日龄藏猪（6.63±0.85 kg）和6头60日龄DLY三元仔猪（21.72±0.36 kg）,检测PBD114在猪的组织中表达丰度。结果表明:PBD114在DLY猪的十二指肠中表达丰度最高,在藏猪的空肠中表达丰度最高。藏猪的空肠、结肠和肺中的PBD114表达丰度显着高于DLY猪（P<0.05）,然而藏猪的肾脏中PBD114表达丰度显着低于DLY猪（P<0.05）。上述结果表明:Beta defensin 114在不同品种和物种间高度保守,藏猪各组织PBD114表达水平普遍高于DLY猪,提示PBD114可能在猪的健康与免疫调节方面发挥了重要作用,是潜在的抗病基因之一。试验二PBD114基因的表达调控机制研究为探索PBD114在免疫调节中的作用,分别以7日龄DLY仔猪和IPEC-J2为体内外模型,用E.coli K88作为病原菌进行攻毒,研究PBD114基因在免疫激活下的表达规律,结果表明:E.coli K88显着提高了猪十二指肠、空肠和回肠PBD114基因的表达量（P<0.05）以及IPEC-J2的PBD114基因的表达量（P<0.05）,说明PBD114在免疫激活下上调。由于TLRs是介导免疫激活的重要病原菌受体,为探索PBD114的表达受何种信号途径的调控,进一步采用不同的TLRs激活剂Pam3CSK4、Poly（I:C）、LPS、R837（分别为TLR2、3、4和7激活剂）处理IPEC-J2细胞。结果发现:Pam3CSK4显着降低PBD114基因的表达量（P<0.05）;Poly（I:C）、LPS和Imiquimod-R837均显着提高PBD114基因的表达量（P<0.05）。该结果表明,TLR2/3/4/7参与PBD114的表达;TLRs途径的下游是NF-κB和MAPK信号途径,而基因的表达是由转录因子调控。在此基础上,利用JASPAR在线预测发现转录因子NF-κBp65（RELA）和AP-1（FOS和JUN）能够结合PBD114上游启动子区,通过双荧光素酶报告试验证实,转录因子RELA、FOS和JUN均参与了PBD114转录激活,其调控强度为:RELA-JUN>RELA>RELA-FOS>FOS>JUN>FOS-JUN。另外IPEC-J2细胞在E.coli K88攻击下,PBD114基因表达显着提高（P<0.05）,但RELA抑制剂PDTC可显着抑制PBD114基因表达（P<0.05）,结果进一步表明PBD114基因表达受RELA的调控。上述结果表明:免疫激活（如E.coli K88攻击）可上调猪PBD114基因表达,TLR2/3/4/7信号途径均参与了PBD114基因表达的调控,其中,转录因子RELA、FOS和JUN对PBD114的基因表达起关键调节作用。试验三PBD114在大肠杆菌中的异源表达及其生物学特性研究为进一步研究PBD114的生物学特性及功能,将PBD114的成熟肽的DNA构建到表达载体pET32（a+）中,并转化到表达宿主菌Origami B（DE3）构建重组表达菌Origami B-pET32-PBD114,以获得重组PBD114蛋白。通过最优表达条件(最佳表达初始OD600值为0.6、0.8和1.0,最佳IPTG诱导浓度是0.5和1.0 mM,最佳诱导时间是4、6、8和10 h)、亲和层析纯化和蛋白质谱鉴定,成功获得纯度达到95%以上的重组PBD114（rPBD114）,且蛋白质谱结果表明rPBD114的氨基酸序列和NCBI数据库中NP001123445重合度达到100%。在线分析PBD114的蛋白结构和物理化学特性,PBD114同人的beta-defensin 2相似,具有α螺旋和β折叠组成的蛋白结构,带有+1电荷的具有双亲性的多肽。体外抑菌试验表明,rPBD114对E.coli DH5α和E.coli K88+均有较明显的抑制作用,MIC值分别为64和128μg/mL;红细胞溶血与细胞毒性试验则证实,rPBD114几乎没有溶血性和细胞毒性,表明rPBD114安全性较好,可用于后续体内外研究。试验四PBD114缓解肠上皮细胞炎性损伤的作用及其机制肠上皮细胞炎性损伤是导致肠道屏障功能受损的重要原因之一,前面的研究结果已经证实PBD114在免疫激活下表达量显着提高,但其有怎样的免疫调节功能及其调控机制如何。本试验采用双因素设计,先用rPBD114和抑制剂PDTC（抑制NF-κB）、GDC-0994（抑制ERK1/2）和T-5224（抑制FOS）预处理IPEC-J2细胞1 h,再分别用PBS和LPS处理细胞3 h,以此探究PBD114缓解肠上皮细胞炎性损伤的作用及其机制,结果表明:rPBD114和抑制剂显着提高LPS引起的IPEC-J2细胞活性的降低（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显着提高ZO-1、claudin-1和occludin的基因表达量（P<0.05）,显着提高ZO-1和claudin-1蛋白表达（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显着降低TNFα、IL-1β和IL-6的基因表达量（P<0.05）,显着降低细胞培养液TNFα和IL-1β蛋白浓度（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显着降低LPS引起的IPEC-J2早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡的提高（P<0.05）,显着增加IPEC-J2的Bcl-2的基因表达量（P<0.05）,显着提高IPEC-J2的Bcl-2/Bax（P<0.05）。显着降低IPEC-J2的Bax的基因表达量（P<0.05）,显着降低caspase 8和caspase 9的蛋白水平（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显着降低LPS诱导的IPEC-J2细胞pIκB-α/IκB-α、pNF-κB/NF-κB和pERK1/2/ERK1/2的升高（P<0.05）。上述结果表明:rPBD114可通过降低NF-κB和ERK信号通路关键分子IκB-α、NF-κB和ERK1/2磷酸化水平,减少肠上皮细胞炎性因子表达,进而下调凋亡相关基因和蛋白表达水平,减少肠上皮细胞凋亡。试验五PBD114对LPS诱导小鼠肠道屏障炎性损伤的缓解作用为进一步验证PBD114在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用效果,试验将72只3周龄ICR小鼠按照体重相近原则,随机分配到6个试验组:CON（生理盐水）、LOW（4 mg/kg的rPBD114）、HIGH（8 mg/kg的rPBD114）、LPS（生理盐水+10 mg/kg LPS攻毒）、LOW+LPS（4 mg/kg的rPBD114+10 mg/kg LPS攻毒）和HIGH（4 mg/kg的rPBD114+10 mg/kg LPS攻毒）。预饲一周后,按照试验设计所有试验鼠注射给与等体积的rPBD114或生理盐水,每天注射一次,连续注射6天。试验第7天早上小鼠注射完生理盐水和rPBD114后1 h,攻毒组立即注射10 mg/kg LPS,未攻毒组注射等体积的生理盐水,5 h后所有小鼠二氧化碳麻醉处死。结果表明:LOW组显着降低采食量和平均日采食量（P<0.05）,增加脾脏的脏器指数（P<0.05）;LPS攻毒显着增加血清D乳酸和二胺氧化酶的水平（P<0.05）,表明LPS攻毒模型成功导致小鼠肠道炎性损伤;LPS攻毒增加炎性因子的基因和蛋白水平,造成小鼠肝脏、肾脏和肠道屏障的损伤;而给与小鼠rPBD114,可降低血清和空肠的炎性因子（TNFα、IL-1β和IL-6）水平（P<0.05）,减少LPS对小鼠肝脏（降低血清ALT）的损伤（P<0.05）,并且通过调节空肠凋亡相关基因（增加Bcl-2和Bcl-2/Bax的基因表达,降低Bax和caspase3的基因表达）的表达（P<0.05）,提高肠道紧密连接蛋白（增加ZO-1、occludin和claudin-1的基因表达,增加ZO-1蛋白表达）表达（P<0.05）,增强机体免疫力（提高血清IgG、IgM、C3和C4）（P<0.05）,从而改善肠道形态（降低十二指肠隐窝深度和提高空肠的绒隐比）（P<0.05）。上述研究结果表明:LPS攻毒造成小鼠全身性炎症和肠道损伤。rPBD114在不影响小鼠生长性能的前提下,通过降低血清和空肠中炎症因子的产生,调节凋亡相关基因和蛋白的表达,减少肠黏膜凋亡,提高小鼠免疫力,改善肠道健康。综上所述,PBD114在不同品种猪之间高度保守,且PBD114在藏猪的组织中表达水平高于DLY猪,PBD114在免疫激活下表达上调,是一个重要的免疫应答基因,其表达受TLR2/3/4/7和转录因子RELA/FOS/JUN调控;PBD114不仅具有抑菌活性,且对免疫激活具有明显的反馈调节作用,即在免疫激活时,PBD114通过降低IκBα,NF-κB和ERK1/2磷酸化水平,抑制炎性因子表达,缓解其导致的肠上皮细胞炎性损伤。上述研究结果不仅从理论上揭示了PBD114的表达调控机制及其生物学功能,还有望为新型抗生素替代品的研发以及寻求改善动物健康的营养调控措施等提供新的思路。
罗鹏飞[10]（2014）在《尿胰蛋白酶抑制剂用于脓毒症治疗的疗效综合分析》文中提出研究背景脓毒症是一种常见的致死性疾病，是危重病患者最具威胁且最为常见的死因。目前已发表的脓毒症流行病学和经济学数据的整合结果表明：脓毒症的疾病负担十分严重，甚至很有可能位列所有疾病首位；现有脓毒症发病机制及其相关证据的信息归纳显示：尚无统一的脓毒症发病模式，但模式间存在部分共同点，包括：过度炎症反应与免疫抑制共存，且两者都是重要死因；已有临床策略及其相关临床试验的数据分析提示：抗炎策略仍有希望成功、免疫刺激策略尚待进一步研究；历史沿革以及抗炎失败的经验启示：疾病本身的多态性、发病机制的复杂性、关键时间节点的不确定性、组织细胞损伤的渐进性以及死亡通路的共同性等都是潜在的脓毒症突破口。基于上述分析，本研究选择了尿胰蛋白酶抑制剂（UTI）作为脓毒症治疗的辅助药物。选择该药的原因在于：UTI具有天然的生理性抗炎作用（针对脓毒症发病机制上游的过度炎症反应）、抗氧化作用（针对机制下游的细胞组织氧化应激损伤效应）和抑酶效应（针对机制上游依靠酶解激活的炎症级联反应、机制下游细胞组织酶过度活化损伤效应以及炎症效应细胞的酶解损伤效应）。第一部分UTI用于脓毒症治疗的META分析研究目的：针对目前已有相关临床试验进行系统性总结，以了解“UTI用于脓毒症治疗的疗效”是否已有定论。研究方法：`严格按照Cochrane系统评价手册进行系统评价，包括：在制定好计划书的前提下，按照计划书全面检索、筛选、质量评价、数据提取以及数据合并，以GRADE证据等级评价系统对合并效应量推荐证据等级；秩相关和meta回归用于进一步验证并细化UTI治疗的具体方案、同时筛选可能影响病死率的其他混杂因素。研究结果：①.Meta分析显示UTI用于脓毒症治疗可以有效降低总体病死率[RR=0.58（0.44,0.76），P＜0.0001（Z=3.93）]和28天病死率[RR=0.51（0.37,0.71），P＜0.0001,（Z=4.05）]，缓解脓毒症病情[标化均数差（SMD）=-0.77（-1.07,0.47），P＜0.0001（Z=5.0）]；②. GRADE推荐证据等级“极低”；③秩相关分析显示单日UTI使用次数和28天病死率之间存在正相关关系（秩相关系数=-0.8660，P=0.0012）；④.Meta回归提示原发疾病构成可能影响UTI应用于脓毒症治疗的疗效。[其他次要数据详见论文全文]研究结论：①.所有合并效应量的GRADE推荐证据等级均为“极低”，即目前尚不能确定上述meta合并结果的真实可信性，尚不能认为“UTI用于脓毒症治疗”是安全有效的；②.UTI用法用量上的改善，如增加单日UTI使用次数，可能更有助于其UTI应用于脓毒症治疗的疗效增加；③.UTI应用于以创伤、胰腺炎为原发病的脓毒症病例时疗效或许更佳。第二部分UTI用于特大面积烧伤及烧伤脓毒症治疗的多中心回顾性分析研究目的：基于第一部分结论中的“创伤基础上的脓毒症或许对UTI的治疗反应更好”，本研究选取特大面积烧伤为研究对象，探讨UTI用于治疗烧伤脓毒症以及烧伤疾病本身的疗效。研究方法：回顾性收集多中心特大面积烧伤病例资料，以UTI使用视为“暴露”因素，采用类似回顾性队列研究分析方法，首先采用单因素分析模型检验UTI的疗效情况以及可能存在的混杂因素；进而采用多因素回归模型进行进一步验证；分层分析用以具体判断混杂因素的混杂效应。研究结果：①.单因素模型显示UTI的应用可提高总体存活率[OR=3.168（2.010,4.992）， P＜0.001]以及烧伤脓毒症的存活率[OR=3.722（1.627,8.515），P=0.001]、降低MODS发生[OR=0.505（0.305,0.836），P=0.007]以及心血管系统[OR=0.501（0.322,0.779），P=0.002]、呼吸系统[OR=0.582（0.385,0.881），P=0.010]和泌尿系统[OR=0.538（0.296,0.977），P=0.039]并发症的发生，但同时存在着7种其他辅助药物（抗氧自由基药物、胰岛素、白蛋白、保肝药物、免疫球蛋白、中医药、胸腺肽）的干扰；②.多因素分析显示UTI的使用能够提高特大面积烧伤患者总体存活率[OR=2.097（1.077,4.086），P=0.029]以及未并发脓毒症[OR=3.147（1.192,8.304），P=0.021]的特大面积烧伤患者的存活率，降低呼吸系统[OR=0.146（0.043,0.488），P=0.002]、心血管系统[OR=0.460（0.249,0.848），P=0.013]并发症的发生风险，但对烧伤脓毒症的存活率无影响；③.分层分析显示：烧伤脓毒症未使用保肝药物时，UTI的OR=4.77（1.39,16.41），P=0.017；而烧伤脓毒症使用保肝药物时，UTI的OR值=2.02（0.59,6.96），P=0.260。[其他次要数据详见论文全文]研究结论：①.UTI的使用能够提高特大面积烧伤患者总体存活率以及未并发脓毒症的特大面积烧伤患者的存活率；②.尚不能认为UTI的使用可以提高并发脓毒症的特大面积烧伤患者存活率，造成脓毒症和非脓毒症之间的差别是在于保肝药物的使用掩盖了UTI的部分疗效，而这种掩盖作用在脓毒症发生时更为明显；③.其他次要结论： UTI的使用还可降低呼吸系统、心血管系统的并发症发生风险，尤其是呼吸系统并发症（风险平均降低为1/7倍）；基础病情程度（包括烧伤面积、烧伤深度、合并伤，尤其是吸入性损伤）以及院前的液体复苏仍然是决定特大面积烧伤预后结局指标的重要因素，入院时如若已然发生休克，则强烈提示预后不良（死亡风险平均增加8倍）；.抗氧自由基治疗是特大面积烧伤治疗中最常使用的辅助治疗，呼吸系统并发症是特大面积烧伤最常见的并发症，保肝药物在MODS防治以及存活率提高（包括并发脓毒症的存活率）方面有着显着的改善效应。第三部分UTI对低急相反应脓毒症及脓毒症相关肺损伤的影响研究目的：基于第二部分结论中的“保肝药物的使用掩盖了UTI的部分疗效，从而使得UTI用于脓毒症治疗的疗效不显着”，为进一步探讨UTI与脓毒症中肝脏的相关关系，展开以下研究。研究方法：通过Smad3基因敲除鼠这一新动物模型探索脓毒症模型（基于盲肠结扎穿刺模型）的建立及其急相蛋白谱的变化；采用UTI治疗低急相反应脓毒症小鼠，观察病死率改变情况、血清学机制以及肺损伤改善情况；③.观察UTI的剂量疗效反应，并采用急相蛋白回补法，进一步探索UTI的治疗疗效是否真的由急相反应介导。研究结果：盲肠远端三分之一结扎穿刺是合适的Smad3基因敲除鼠脓毒症模型，其病死率符合建模要求，且血清炎性介质、氧化应激指标和酶学效应提示发生机制符合脓毒症病理生理变化；肝脏急性期蛋白的数字表达图谱检测结果显示，相比于野生型小鼠，Smad3基因敲除小鼠CLP后急相蛋白发生变化的数目较少，相同蛋白的变化程度弱，这些都说明Smad3基因敲除鼠在CLP诱导下发生的急相反应低于野生型，即Smad3基因敲除鼠是一种低急相反应小鼠；UTI确实能够改善罹患脓毒症的基因敲除鼠存活率（61.5%vs.23.1%，Log-rank卡方检验示P=0.020），但却不能显着提高野生型小鼠脓毒症存活率。血清炎症介质、氧化指标和酶学活力检测结果显示UTI能够降低血清TNF-alpha、IL-6、MDA、SOD和弹性蛋白酶水平；还能改善脓毒症病死率和肺组织损伤病理评分，降低转录水平的IL-1beta和IL-6以及翻译水平的TNF-alpha和IL-6，还可降低肺组织SOD和弹性蛋白酶活力；体外酶学实验证实急相蛋白A1AT和UTI之间的酶学活性定量关系：1单位UTI=2.5微克A1AT；按照UTI50kU/kg和A1AT0.125g/kg治疗基因敲除鼠三分之一结扎盲肠远端穿刺模型（未设野生型组、未给药组和假手术组），结果我们发现了两者的生存曲线类似（Log-rank检验示P=0.784）；不同剂量的UTI三组（10kU/kg、50kU/kg、100kU/kg）之间没有发现统计学改变，但和未给药组相比，50kU/kg和100kU/kg均能起到改善存活率的作用，线性趋势检验提示以认为由低到高的剂量组间存在着存活率增高（死亡率降低）的趋势[P=0.020（卡方值=4.822）]。[其他次要数据详见论文全文]研究结论：①.UTI可以改善肝低急相反应小鼠脓毒症存活率；一定范围内存在剂量-效应反应，但也存在着屋顶效应，改善机制可能和UTI的抗炎、抗氧化、抑酶效应有关；②. UTI可以缓解肝低急相反应小鼠的脓毒症相关肺损伤情况，缓解机制依赖于UTI在全身作用的抗炎、抗氧化、抑酶效应；③.肝脏急相反应与UTI有着共性的疗效和治疗机制，两者同时应用时，肝脏急相反应会削弱UTI治疗脓毒症的疗效；④.肝急相蛋白A1AT也可改善肝低急相反应小鼠脓毒症存活率，且与UTI相同抑酶活力条件下，生存率改善程度相当，临床可以考虑使用UTI作为A1AT的替代药物；⑤.其他次要结论：肝脏急相反应是Smad3基因起到保护机体、抵抗脓毒症生物学作用的重要机制；Smad3基因敲除可以作为肝低急相反应的动物模型。
二、蛋白酶抑制剂对肺炎性损伤的保护作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蛋白酶抑制剂对肺炎性损伤的保护作用（论文提纲范文）
（1）产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选及其在发酵乳中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 简写对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 枯草芽孢杆菌简介 |
| 1.2 纳豆激酶的研究进展 |
| 1.2.1 纳豆激酶的酶学性质 |
| 1.2.2 纳豆激酶的功能及其应用前景 |
| 1.2.3 纳豆激酶与其它溶栓药物的比较及其溶栓优势 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌凝乳酶的研究进展 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌在发酵食品及益生菌制剂中的应用 |
| 1.5 枯草芽孢杆菌对肠道菌群的调节作用和在医药保健领域的应用 |
| 1.5.1 肠道菌群及肠道菌群失调相关疾病 |
| 1.5.2 炎症性肠病的发病机制及治疗方法的研究进展 |
| 1.6 立题背景和研究意义 |
| 1.7 主要研究内容 |
| 第二章 产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌菌株的分离、筛选及鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 主要试剂与材料 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 培养基配方 |
| 2.3.2 纤维蛋白溶解酶纤溶活力测定方法 |
| 2.3.3 凝乳酶活力测定方法 |
| 2.3.4 产纳豆激酶和凝乳酶双酶菌株的筛选及鉴定 |
| 2.3.5 产双酶菌株菌株的鉴定 |
| 2.3.6 B.subtilis JNFE0126 菌株的生长特征检测 |
| 2.3.7 B.subtilis JNFE0126 株菌发酵液凝乳酶和纤溶酶活性的动态检测 |
| 2.3.8 B.subtilis JNFE0126 菌株产双酶能力的遗传稳定性测定 |
| 2.3.9 B.subtilis JNFE0126 菌株保藏 |
| 2.3.10 酶抑制剂抑制试验分析纤溶酶和凝乳酶的类型 |
| 2.3.11 B.subtilis JNFE0126 菌株的两种酶基因的PCR扩增和测序 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 产双酶(纳豆激酶和凝乳酶)菌株的筛选 |
| 2.4.2 B.subtilis nk1 菌株的鉴定 |
| 2.4.3 B.subtilis JNFE0126 菌株的生长和产酶特性 |
| 2.4.4 蛋白酶抑制剂实验分析纤溶酶和凝乳酶类型 |
| 2.4.5 B.subtilisJNFE0126 的纳豆激酶和M4 金属蛋白酶基因PCR扩增和测序结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 枯草芽孢杆菌产发酵液中纳豆激酶和凝乳酶的分离纯化及酶学性质研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 主要试剂与材料 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养基 |
| 3.3.2 B.subtilis JNFE0126 菌株的活化 |
| 3.3.3 纳豆激酶、凝乳酶粗酶液的制备 |
| 3.3.4 蛋白质浓度的测定—Bradford检测法 |
| 3.3.5 纳豆激酶的分离纯化 |
| 3.3.6 凝乳酶的分离纯化 |
| 3.3.7 纳豆激酶的酶学性质研究 |
| 3.3.8 凝乳酶的酶学性质研究 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 纳豆激酶的分离纯化 |
| 3.4.2 凝乳酶的分离纯化 |
| 3.4.3 纯化酶的SDS-PAGE电泳检测结果 |
| 3.4.4 纳豆激酶的酶学性质 |
| 3.4.5 凝乳酶的酶学性质研究 |
| 3.4.6 纯化凝乳酶的凝乳效果及其潜在应用价值 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 枯草芽孢杆菌发酵乳的研制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与设备 |
| 4.2.1 主要试剂与材料 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 发酵乳制备方法 |
| 4.3.2 单因素实验和正交试验 |
| 4.3.3 发酵乳理化指标测定 |
| 4.3.4 发酵乳感官评定 |
| 4.3.5 发酵乳储藏过程中的品质变化观察 |
| 4.3.6 发酵乳的微观结构观察 |
| 4.3.7 发酵乳动物体内抗血栓作用 |
| 4.3.8 试验数据统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 单因素试验优化发酵乳配方和发酵条件 |
| 4.4.2 采用正交试验确定发酵乳最适发酵条件 |
| 4.4.3 正交试验确定稳定剂配方 |
| 4.4.4 发酵过程中菌量、p H和酶活的变化 |
| 4.4.5 发酵乳总蛋白和总糖含量 |
| 4.4.6 发酵乳感官评定结果 |
| 4.4.7 发酵乳的流变学特性 |
| 4.4.8 发酵乳的持水力和质构测定结果 |
| 4.4.9 发酵乳的微观凝胶结构 |
| 4.4.10 发酵乳储藏过程中的品质变化: |
| 4.4.11 小鼠黑尾模型验证发酵乳体内抗血栓效果 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 枯草芽孢杆菌发酵乳预防和治疗炎症性肠病 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与设备 |
| 5.2.1 主要试剂与材料 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 枯草芽孢杆菌发酵乳的制备及其CFU计数和革兰氏染色 |
| 5.3.2 DSS诱导性炎症性肠病动物模型的建立和动物分组 |
| 5.3.3 模型小鼠疾病活动指数(DAI)的测定 |
| 5.3.4 小肠和结肠的组织学切片观察和组织学评分 |
| 5.3.5 免疫组织化学染色 |
| 5.3.6 Western blotting检测蛋白表达水平 |
| 5.3.7 肠道菌群分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 枯草芽孢杆菌发酵乳的外观、CFU计数及其Gram’s染色 |
| 5.4.2 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对DSS诱导性炎症性肠病动物DAI的影响 |
| 5.4.3 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对小肠和结肠病理变化的影响 |
| 5.4.4 枯草芽孢杆菌发酵乳对白细胞浸润和炎症因子、抗炎因子表达的影响 |
| 5.4.5 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对Lgr-5,CDX-2,Mucin-2 表达水平的影响 |
| 5.4.6 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对ZO1和Villin表达水平的影响 |
| 5.4.7 口服发酵乳对DSS诱导的IBD模型小鼠肠道菌群的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 纳豆激酶缓释颗粒的研制 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料和设备 |
| 6.2.1 主要试剂与材料 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 缓释颗粒原材料的各种反应体系内纳豆激酶纤溶活性测定 |
| 6.3.2 双层壳-核结构的纳豆激酶缓释颗粒的设计和构建 |
| 6.3.3 纳豆激酶缓释颗粒的粒径和zeta电位测定 |
| 6.3.4 装载纳豆激酶和模型药物的缓释颗粒微观结构的显微镜观察 |
| 6.3.5 纳豆激酶缓释颗粒在储藏过程中的纤溶活性的动态测定 |
| 6.3.6 模拟消化液对缓释颗粒纤溶活性的影响 |
| 6.3.7 模拟消化液对缓释颗粒粒径、ζ-电位和表面结构的影响 |
| 6.3.8 荧光标记模拟药物(Ig G)缓释颗粒口服后在小鼠消化道内分布情况分析 |
| 6.3.9 口服纳豆激酶缓释颗粒后小鼠肠道内的活性酶的释放和吸收试验 |
| 6.3.10 口服纳豆激酶缓释颗粒对模型小鼠血栓治疗效果的评价 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 纳豆激酶缓释颗粒的设计与构建 |
| 6.4.2 颗粒双层壳-核结构的鉴定与验证 |
| 6.4.3 纳豆激酶缓释颗粒保藏过程中酶活的变化 |
| 6.4.4 缓释颗粒中纳豆激酶的体外释放特性 |
| 6.4.5 双层壳-核结构缓释颗粒所装载模型药物口服后在体内的释放 |
| 6.4.6 口服纳豆激酶缓释颗粒对黑尾模型小鼠的血栓治疗效果 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文的主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（2）Fosl1调控脊髓损伤自噬、炎症和凋亡及其分子机制（论文提纲范文）
| 英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 Fosl1与AMPK在损伤的脊髓组织及神经元细胞中的表达情况 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 Fosl1在GEO数据库中脊髓损伤的表达情况 |
| 3.2 Fosl1和AMPK在大鼠脊髓损伤模型中的表达情况 |
| 3.3 Fosl1在损伤的大鼠脊髓神经元细胞中的表达情况 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Fosl1和AMPK在损伤的PC-12细胞中的表达情况,以及Fosl1对其凋亡、炎症、自噬的调控 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 H_2O_2诱导损伤的PC-12细胞中Fosl1和AMPK的表达情况.. |
| 3.2 H_2O_2对PC-12细胞凋亡的影响 |
| 3.3 H_2O_2对PC-12细胞活性的影响 |
| 3.4 si-Fosl1对损伤的PC-12细胞中Fosl1和AMPK表达的影响. |
| 3.5 si-Fosl1对损伤的PC-12细胞凋亡的影响 |
| 3.6 si-Fosl1对损伤的PC-12细胞活性的影响 |
| 3.7 si-Fosl1对损伤的PC-12细胞自噬、炎症和凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Fosl1通过AMPK信号通路调控损伤PC-12细胞的自噬、炎症及凋亡 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 AMPK激动剂与抑制剂对Fosl1敲低的损伤PC-12细胞AMPK与p-AMPK的影响 |
| 3.2 AMPK激动剂与抑制剂对Fosl1敲低的损伤PC-12细胞凋亡率与活性的影响 |
| 3.3 AMPK激动剂与抑制剂对Fosl1敲低的损伤PC-12细胞自噬与凋亡的影响 |
| 3.4 AMPK激动剂与抑制剂对Fosl1敲低的损伤PC-12细胞炎症的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 Fosl1对大鼠脊髓损伤的炎症、凋亡及神经功能的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 si-Fosl1对脊髓损伤大鼠Fosl1及AMPK表达的影响 |
| 3.2 si-Fosl1促进脊髓损伤大鼠后肢神经功能的恢复 |
| 3.3 si-Fosl1降低脊髓损伤大鼠神经细胞的凋亡 |
| 3.4 si-Fosl1缓解脊髓损伤大鼠脊髓的炎症 |
| 3.5 si-Fosl1增加脊髓损伤大鼠脊髓Nissl小体数量 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 脊髓损伤与自噬 |
| 参考文献 |
（3）鹰嘴豆芽素A基于PI3K/AKT信号通路缓解PM10致急性肺细胞损伤机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 PM_(10)概述 |
| 1.1.1 PM_(10)概念、成分及来源 |
| 1.1.2 PM_(10)对人体健康的影响 |
| 1.1.3 PM_(10)致急性肺细胞损伤的机理研究 |
| 1.2 鹰嘴豆芽素A概述 |
| 1.2.1 鹰嘴豆芽素A概念 |
| 1.2.2 鹰嘴豆芽素A生物活性 |
| 1.2.3 鹰嘴豆芽素A分子作用机制 |
| 1.3 PI3K/AKT信号通路概述 |
| 1.3.1 PI3K/AKT信号通路的传导与调节 |
| 1.3.2 PI3K/AKT信号通路的组成 |
| 1.3.3 PI3K/AKT信号通路调控氧化应激、炎症与免疫 |
| 1.3.4 PI3K/AKT信号通路抑制剂 |
| 1.4 DNA碱基切除修复途径(BER)概述 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 1.6 研究内容和技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 天津市PM_(10)形态学与化学组成成分分析 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验试剂与耗材 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 颗粒物样品采集 |
| 2.2.2 颗粒物粒径分析 |
| 2.2.3 颗粒物中无机元素测定 |
| 2.2.4 颗粒物中水溶性离子测定 |
| 2.2.5 颗粒物中有机化合物测定分析 |
| 2.2.6 天津市PM_(10)颗粒物形态分析 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 天津市PM_(10)粒径分析与确定 |
| 2.3.2 颗粒物中无机元素的测定分析 |
| 2.3.3 天津市PM_(10)颗粒物中水溶性离子测定分析 |
| 2.3.4 颗粒物中有机化合物分析 |
| 2.3.5 天津市PM_(10)形态学分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 PM_(10)诱导因素与呼吸系统损伤相关性分析 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.1.1 PM_(10)成分信息收集 |
| 3.1.2 Chem View DB& ToxRef DB数据库评估PM_(10)成分 |
| 3.1.3 呼吸系统损伤的界定方法 |
| 3.1.4 呼吸系统损伤终点统计分析 |
| 3.1.5 Tox Cast DB数据库评估 |
| 3.1.6 基因分数计算 |
| 3.1.7 二模网络可视化 |
| 3.1.8 生物信息分析 |
| 3.2 实验结果与讨论 |
| 3.2.1 Chem View DB& ToxRef DB数据库评估PM_(10)成分 |
| 3.2.2 致呼吸系统损伤化学成分Tox Cast DB生物活性分析 |
| 3.2.3 PM_(10)诱导因素-呼吸系统损伤二模网络可视化 |
| 3.2.4 Tox Cast?分子靶点生物信息学分析评价 |
| 3.3 本章小结 |
| 第4章 PM_(10)致急性肺细胞损伤研究 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 实验试剂与耗材 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 PM_(10)颗粒物采集 |
| 4.2.2 PM_(10)颗粒物样品的制备 |
| 4.2.3 细胞培养 |
| 4.2.4 染毒母液的制备 |
| 4.2.5 细胞模型构建及处理 |
| 4.2.6 MTT试验 |
| 4.2.7 LDH试验 |
| 4.2.8 DCFH-DA荧光标记细胞内活性氧测定 |
| 4.2.9 氧化损伤相关指标的测定 |
| 4.2.10 炎症因子/介质的测定 |
| 4.2.11 基因表达测定 |
| 4.2.12 数据统计与分析 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 PM_(10)致急性肺细胞损伤作用评价 |
| 4.3.2 BCA安全作用剂量考察 |
| 4.3.3 PM_(10)暴露-BCA保护体外细胞模型的建立 |
| 4.3.4 DCFH-DA细胞内活性氧测定 |
| 4.3.5 BCA抗氧化作用评价 |
| 4.3.6 BCA抗炎作用评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 BCA缓解PM_(10)致急性肺细胞损伤作用机制研究 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 实验试剂与耗材 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞培养、模型构建及处理 |
| 5.2.2 CRISPR-CAS9 法构建XRCC1 基因敲除BEAS-2B细胞模型 |
| 5.2.3 基因表达测定 |
| 5.2.4 细胞总蛋白提取 |
| 5.2.5 蛋白浓度测定及变性处理 |
| 5.2.6 蛋白质免疫印迹试验 |
| 5.2.7 数据统计与分析 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 BCA抑制PM_(10)致急性肺细胞损伤的生物标志蛋白表达 |
| 5.3.2 BCA调控PI3K/AKT信号通路 |
| 5.3.3 XRCC1 干扰PI3K/AKT信号通路 |
| 5.3.4 BCA介导DNA碱基切除修复BER信号通路 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 全文总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.1.1 全文结论 |
| 6.1.2 论文创新点 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（4）外膜蛋白A-Caspase-1通路在鲍曼不动杆菌肺炎免疫机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 鲍曼不动杆菌依赖外膜蛋白A增强NLRP3炎症小体的激活 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 敲低NLRP3-ASC-Caspase-1 炎症小体轴相应蛋白的表达对鲍曼不动杆菌感染的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 MG-132抑制蛋白酶体的泛素化降解对鲍曼不动杆菌感染的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文小结 |
| 全文结论 |
| 创新与不足之处 |
| 参考文献 |
| 综述 鲍曼不动杆菌的致病机制及与天然免疫系统间的关系 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
（5）硒通过TrxR1/MAPK信号通路缓解奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 氧化应激的危害及其防治 |
| 1.1.1 氧化应激的产生 |
| 1.1.2 氧化应激的诱发因素 |
| 1.1.3 氧化应激对奶牛的危害 |
| 1.1.4 缓解氧化应激的措施 |
| 1.2 硒对奶牛生产性能的促进作用 |
| 1.2.1 硒在反刍动物体内的代谢与利用 |
| 1.2.2 硒对奶牛生产性能的影响 |
| 1.3 硒缓解奶牛乳腺氧化应激的研究进展 |
| 1.3.1 硒对奶牛乳腺氧化应激的调节作用 |
| 1.3.2 硒减缓氧化应激的可能机制 |
| 1.4 论文研究目的与意义 |
| 1.5 论文研究内容和技术路线 |
| 2 试验研究 |
| 2.1 不同剂量硒对奶牛乳腺上皮细胞抗氧化功能的调节作用 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 试验材料和方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 过量一氧化氮诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的建立 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 试验材料与方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 硒对一氧化氮诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的减缓作用 |
| 2.3.1 引言 |
| 2.3.2 试验材料与方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 2.4 硒通过硫氧还蛋白还原酶抑制白介素-1活性对细胞损伤的减缓作用 |
| 2.4.1 引言 |
| 2.4.2 试验材料与方法 |
| 2.4.3 结果 |
| 2.4.4 讨论 |
| 2.4.5 小结 |
| 2.5 硒通过抑制MAPK信号通路缓解奶牛乳腺上皮细胞的氧化损伤 |
| 2.5.1 引言 |
| 2.5.2 试验材料与方法 |
| 2.5.3 结果 |
| 2.5.4 讨论 |
| 2.5.5 小结 |
| 2.6 硫氧还蛋白还原酶1的过表达对硒缓解BMEC氧化应激损伤的影响 |
| 2.6.1 引言 |
| 2.6.2 试验材料与方法 |
| 2.6.3 结果 |
| 2.6.4 讨论 |
| 2.6.5 小结 |
| 3 论文总体讨论与结论 |
| 3.1 总体讨论 |
| 3.1.1 过量NO对细胞抗氧化功能及炎症因子的调节作用 |
| 3.1.2 Se对BMEC氧化应激的减缓作用具有剂量依赖性 |
| 3.1.3 Se缓解BMEC氧化应激的机理 |
| 3.2 总体结论 |
| 3.3 存在的问题及进一步研究的领域 |
| 3.4 本研究的创新之处 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）巨噬细胞诱导型C型凝集素受体在肺纤维化中的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 绪论 |
| 第一部分 巨噬细胞诱导型C型凝集素受体在肺纤维化组织的表达 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 研究结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 剪接体相关蛋白130在IPF患者和博莱霉素诱导肺纤维化小鼠模型的表达及识别 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 耗材 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 常用溶液配制 |
| 1.5 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 3. 研究结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 巨噬细胞诱导型C型凝集素受体基因对肺纤维化发生的影响 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 研究结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 巨噬细胞诱导型C型凝集素受体对肺纤维化小鼠肺巨噬细胞极化的影响 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第五部分 Mincle通过Syk/CARD9 信号通路调控巨噬细胞极化影响肺纤维化 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 研究结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文和科研成果目录 |
（7）小檗碱诱导线粒体自噬干预流感病毒激活的ROS-NLRP3炎性体通路的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 细胞自噬与NLRP3炎性体相互调控关系研究进展 |
| 1 细胞自噬概述 |
| 2. NLRP3炎性体概述 |
| 3. 细胞自噬与NLRP3炎性体的相互调控关系 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 小檗碱抗炎作用机制研究进展 |
| 1 小檗碱对炎症信号通路的作用 |
| 2 小檗碱对炎性细胞的作用 |
| 3 小檗碱对炎症细胞因子的作用 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 第一节 小檗碱对流感病毒感染的巨噬细胞NLRP3炎性体活化的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 小檗碱对流感病毒感染的巨噬细胞线粒体损伤一ROS-NLRP3炎性体通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 小檗碱对流感病毒感染的巨噬细胞线粒体自噬的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四节 小檗碱诱导的线粒体自噬对ROS-NLRP3炎性体通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五节 小檗碱诱导流感病毒感染的巨噬细胞线粒体自噬的机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六节 小檗碱通过诱导线粒体自噬减轻病毒性肺炎小鼠肺部炎性损伤 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（8）维生素D3通过抑制NLRP3炎性小体活化改善氮芥诱导皮肤炎性损伤的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 实验设计和技术路线 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 NLRP3炎性小体在氮芥诱导角质形成细胞炎性损伤中的作用和机制 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 SIRT3/NLRP3 炎性小体信号通路在VD3 改善NM诱导皮肤炎性损伤中的作用和机制 |
| 3.1 材料与方法(与第二章相同的未列出) |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 NM毒性损伤作用及VD3皮肤修复功能研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）猪β防御素114的表达调控机制及其在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本文缩略语表(Abbreviations) |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 防御素概述 |
| 1.1 防御素的种类 |
| 1.2 防御素的分布与表达 |
| 2 防御素的表达调控 |
| 2.1 营养素对猪防御素的表达调控 |
| 2.2 非营养素对猪防御素的表达调控 |
| 3 防御素的生物学功能 |
| 3.1 抗菌活性 |
| 3.2 促炎和抗炎 |
| 3.3 屏障保护作用 |
| 3.4 加强趋化作用 |
| 3.5 Defensins和 TLRs |
| 3.6 增强胞内外杀伤能力 |
| 3.7 促进细胞分化 |
| 4 Defensins的应用中遇到的问题 |
| 5 存在的问题 |
| 第二章 本研究的目的、意义、主要内容和技术路线 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 研究内容 |
| 3 技术路线 |
| 第三章 试验研究 |
| 试验一 PBD114 基因的克隆、序列分析及其在不同品种猪间的差异表达 |
| 一、Beta defensin114 的序列分析 |
| 1 PBD114 克隆技术图 |
| 2 试验材料 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 总RNA提取和反转录 |
| 3.2 PBD114 基因的扩增 |
| 3.3 核酸电泳 |
| 3.4 DNA纯化 |
| 3.5 DNA加 A |
| 3.6 DNA连接 |
| 3.7 大肠杆菌感受态制备 |
| 3.8 转化与初筛 |
| 3.9 测序与分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 PBD114 的克隆及其序列分析 |
| 4.2 不同物种beta defensin114 同源性 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 二、不同品种猪PBD114 基因的差异表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验设计 |
| 1.2 组织样品采集 |
| 1.3 测定指标与方法 |
| 1.3.1 总RNA提取及反转录 |
| 1.3.2 引物设计 |
| 1.3.3 qRT-PCR |
| 1.4 数据处理与统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PBD114 在藏猪和DLY猪组织中的表达丰度 |
| 2.2 PBD114 在藏猪和DLY猪中的差异表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验二 PBD114 基因的表达调控机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.2.1 E.Coli K88 攻毒对PBD114 基因表达的影响 |
| 1.2.2 不同TLRs信号途径对PBD114 基因表达的影响 |
| 1.2.3 转录因子RELA、FOS和 JUN对 PBD114 基因表达的调控 |
| 1.2.4 转录因子RELA和 FOS的抑制对IPEC-J2的PBD114 基因表达的影响 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 腹泻评分 |
| 1.3.2 E.coli K88 的培养 |
| 1.3.3 细胞培养 |
| 1.3.4 总RNA提取、反转录和qRT-PCR |
| 1.3.5 酶联免疫检测细胞因子 |
| 1.3.6 PBD114 启动子区转录因子结合预测 |
| 1.3.7 载体构建 |
| 1.3.8 转染与荧光检测 |
| 1.4 数据处理与统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 免疫激活对PBD114 基因表达的影响 |
| 2.2 不同TLRs信号途径对PBD114 基因表达的调控 |
| 2.3 转录因子RELA、FOS和 JUN对 PBD114 基因表达的调控 |
| 2.4 反向验证转录因子RELA和 FOS对 PBD114 表达的调控 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验三 PBD114 的大肠杆菌异源表达及其生物学特性研究 |
| 1 表达策略 |
| 2 试验材料 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 表达载体的构建 |
| 3.2 重组大肠杆菌构建 |
| 3.3 诱导表达 |
| 3.4 SDS-PAGE鉴定 |
| 3.5 蛋白质质谱 |
| 3.6 诱导表达条件优化 |
| 3.6.1 诱导初始OD值的优化 |
| 3.6.2 诱导剂IPTG的优化 |
| 3.6.3 诱导时间的优化 |
| 3.7 重组蛋白的纯化回收 |
| 3.8 PBD114 蛋白质的空间结构和物理化学特性的预测 |
| 3.9 MIC |
| 3.10 溶血性 |
| 3.11 细胞毒性 |
| 4 数据处理与统计分析 |
| 5 试验结果 |
| 5.1 表达载体的构建 |
| 5.2 重组菌Origami B-pET32-PBD114 的构建 |
| 5.3 重组蛋白rPBD114 的表达 |
| 5.4 表达条件的优化 |
| 5.5 重组蛋白rPBD114 的纯化和蛋白质质谱鉴定 |
| 5.6 重组蛋白rPBD114 的空间结构和物理化学特性 |
| 5.7 最小抑菌浓度 |
| 5.8 溶血性 |
| 5.9 细胞毒性 |
| 6 讨论 |
| 7 小结 |
| 试验四 重组PBD114 对肠道屏障炎性损伤的缓解及其机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.2.1 重组蛋白rPBD114 处理IPEC-J2 浓度梯度 |
| 1.2.2 重组蛋白rPBD114 处理IPEC-J2 时间梯度 |
| 1.2.3 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 肠道屏障炎性损伤 |
| 1.2.4 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 肠道屏障炎性损伤及其机制 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 抑制剂安全剂量 |
| 1.3.3 细胞增殖 |
| 1.3.4 荧光定量PCR |
| 1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 1.3.6 ELISA检测细胞因子 |
| 1.3.7 免疫荧光检测ZO-1和claudin-1 |
| 1.3.8 免疫印迹 |
| 1.4 数据处理与统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 重组蛋白rPBD114 浓度梯度和时间梯度的优化 |
| 2.1.1 重组蛋白rPBD114 浓度梯度优化 |
| 2.1.2 重组蛋白rPBD114 时间梯度优化 |
| 2.2 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 炎性损伤 |
| 2.2.1 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞增殖的影响 |
| 2.2.2 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞凋亡的影响 |
| 2.2.3 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞凋亡基因的影响 |
| 2.2.4 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞炎症因子的影响 |
| 2.2.5 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞紧密连接蛋白的影响 |
| 2.3 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 肠道屏障炎性损伤及其机制 |
| 2.3.1 抑制剂浓度梯度筛选 |
| 2.3.2 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞增殖的影响 |
| 2.3.3 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞紧密连接蛋白的影响 |
| 2.3.4 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞炎症因子的影响 |
| 2.3.5 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞凋亡的影响 |
| 2.3.6 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞凋亡基因和凋亡蛋白的影响 |
| 2.3.7 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞NF-κB/MAPK信号通路蛋白的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验五 重组蛋白rPBD114 对小鼠肠道屏障炎性损伤的缓解作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 饲养管理 |
| 1.4 样品采集 |
| 1.5 测定指标与方法 |
| 1.5.1 生长性能 |
| 1.5.2 血液生化 |
| 1.5.3 空肠粘膜凋亡 |
| 1.5.4 肠道形态 |
| 1.5.5 空肠免疫荧光 |
| 1.5.6 荧光定量PCR |
| 1.6 数据处理与统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠生长性能的影响 |
| 2.2 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠脏器指数的影响 |
| 2.3 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠血清二胺氧化酶和D-乳酸的影响 |
| 2.4 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠血清生化的影响 |
| 2.5 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠血清免疫球蛋白和补体的影响 |
| 2.6 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠肠道形态的影响 |
| 2.7 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠空肠紧密连接蛋白的影响 |
| 2.8 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠空肠凋亡及相关基因的影响 |
| 2.9 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠炎症的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 总体讨论、结论与展望 |
| 1 总体讨论 |
| 2 主要结论 |
| 3 创新点 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）尿胰蛋白酶抑制剂用于脓毒症治疗的疗效综合分析（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 缩略词表 前言 第一部分 UTI 用于脓毒症治疗的 META 分析 |
| 一、 引言 |
| 二、 课题设计 |
| 三、 材料和方法 |
| （一） 纳入排除标准 |
| （二） 检索方法 |
| （三） 数据收集与分析 |
| 四、 结果 |
| （一） 基本情况 |
| （二） 研究的方法学质量评估 |
| （三） META 分析结果 |
| 五、 讨论 |
| （一） 内部真实性评价 |
| （二） 外部真实性评价 |
| （三） 同类研究对比性评价 |
| （四） 局限性评价 |
| 六、 结论 第二部分 UTI 用于特大面积烧伤及烧伤脓毒症治疗的多中心回顾性分析 |
| 一、 引言 |
| 二、 课题设计 |
| 三、 材料和方法 |
| （一） 资料来源 |
| （二） 病例选择 |
| （三） 数据收集 |
| （四） 统计分析 |
| 四、 结果 |
| （一） 基本情况 |
| （二） 单因素模型筛选 UTI 相关指标 |
| （三） 多因素模型检验 UTI 相关疗效 |
| （四） UTI 与总体存活率、烧伤脓毒症存活率 |
| （五） 分层分析探索 UTI 治疗烧伤脓毒症的混杂因素 |
| 五、 讨论 |
| （一） UTI 与存活率的关联性 |
| （二） 关联的一致性和合理性解释 |
| （三） 肝脏在脓毒症和严重烧伤中所起作用 |
| （四） 本研究局限性 |
| 六、 结论 第三部分 UTI 对低急相反应脓毒症及脓毒症相关肺损伤的影响 |
| 一、 引言 |
| 二、 课题设计 |
| 三、 材料和方法 |
| （一） 主要仪器 |
| （二） 试剂配制 |
| （三） 技术步骤 |
| （四） 统计分析 |
| 四、 结果 |
| （一） 动物模型的准备和验证 |
| （二） UTI 用于低急相反应脓毒症的治疗 |
| （三） UTI 与肝急相反应关系的进一步验证 |
| 五、 讨论 |
| （一） 有效性和论证强度讨论 |
| （二） Smad3 与 A1AT 之间关系 |
| （三） 本实验的局限性 |
| 六、 结论 附录 文献综述 参考文献 在读期间发表论文和参加科研工作情况 致谢 |
四、蛋白酶抑制剂对肺炎性损伤的保护作用（论文参考文献）
- [1]产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选及其在发酵乳中的应用[D]. 张轩. 江南大学, 2021(01)
- [2]Fosl1调控脊髓损伤自噬、炎症和凋亡及其分子机制[D]. 钟林. 安徽医科大学, 2021(01)
- [3]鹰嘴豆芽素A基于PI3K/AKT信号通路缓解PM10致急性肺细胞损伤机制研究[D]. 王君宇. 天津大学, 2020(02)
- [4]外膜蛋白A-Caspase-1通路在鲍曼不动杆菌肺炎免疫机制的研究[D]. 李玉美. 贵州医科大学, 2020(04)
- [5]硒通过TrxR1/MAPK信号通路缓解奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的机理研究[D]. 郭咏梅. 内蒙古农业大学, 2020(01)
- [6]巨噬细胞诱导型C型凝集素受体在肺纤维化中的机制研究[D]. 刘凯雄. 上海交通大学, 2020
- [7]小檗碱诱导线粒体自噬干预流感病毒激活的ROS-NLRP3炎性体通路的机制研究[D]. 刘慧. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]维生素D3通过抑制NLRP3炎性小体活化改善氮芥诱导皮肤炎性损伤的作用和机制研究[D]. 董训虎. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020
- [9]猪β防御素114的表达调控机制及其在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用研究[D]. 苏国旗. 四川农业大学, 2019
- [10]尿胰蛋白酶抑制剂用于脓毒症治疗的疗效综合分析[D]. 罗鹏飞. 第二军医大学, 2014(04)