一、B7瘤苗与DC瘤苗诱导的抗L615白血病的免疫作用（论文文献综述）
王辉[1]（2014）在《rhHSP70联合HBxAg负载树突状细胞治疗HBV相关肝癌的实验研究》文中研究说明树突状细胞（Dendritic cells，DCs）是体内已知功能最强的抗原递呈细胞（antigenpresenting cell,APC），在体内外唯一能直接激活初始型T细胞（na ve T cell），进行加工、处理和递呈到组织相容性抗原（MHC）Ⅰ类和Ⅱ类分子上，并激活细胞毒T细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL），在抗肿瘤免疫方面发挥着重要的作用。而肿瘤患者体内DCs存在数量和功能上的缺陷，无法诱导初次免疫应答和激活特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）效应，使机体无法对肿瘤抗原产生再次免疫应答。原发性肝癌（因主要是肝细胞肝癌，故称为hepatocellular carcinoma，HCC，简称“肝癌”）一种高度恶性的肿瘤，我国是肝癌高发的国家，每年的发生率占全世界的54%。肝癌的评价生存期一般不超过6个月，对放、化疗均不敏感，故现行治疗肝癌的方法主要还是以手术等局部治疗为主的综合治疗，尽管如此，目前我国肝癌患者总体的五年生存率仅在10％左右，中晚期肝癌的五年生存率更低。近年来，肿瘤的免疫治疗成为肿瘤研究的新热点，其中以DCs为基础的肿瘤疫苗（简称DC瘤苗）在实验性肝癌免疫治疗中取得了良好效果。目前，国内外学者大多采用肿瘤细胞冻融裂解物、AFP多肽等负载DCs治疗肝癌，也都取得了一定的疗效，但因负载物单一、免疫原性低，其产生的免疫反应较低，疗效也有限，因此，探索新的负载物，构建新的高效DC瘤苗对肝癌的临床治疗有着重要的意义。HBV感染与HCC的发生密切相关，进一步的研究表明HBV X基因的编码蛋白HBx蛋白（HBxAg）在HCC的发生过程中起着重要的作用。HBxAg在肝癌组织中的阳性表达率达70%－80%,因此HBxAg可作为理想的抗原识别靶点，将HBxAg作为抗原负载DC，制备DC疫苗将可能成为肝癌生物免疫治疗的一个新的思路。热休克蛋白70（HSP70）家族是一类重要的应激蛋白，在肿瘤勉一中发挥免疫佐剂的功能，通过分子载体的作用将抗原肽呈递至APC表面，激活CD8+T细胞，达到杀伤肿瘤细胞的目的，HSP70对开发肿瘤疫苗也有重要的意义。本研究采用以HBV病毒抗原多肽HBxAg作为靶抗原，利用rhHSP70结合多肽的生物学活性，体外制备rhHSP70-HBxAg复合物增强多肽的稳定性与抗原性，采用人体专职性抗原递呈细胞DCs作为rhHSP70-HBxAg复合物的承载体，增加疫苗的免疫原性，制备rhHSP70-HBxAg-DC活细胞瘤苗，并进一步研究该瘤苗对HBxAg表达阳性的肝癌细胞的杀伤效能。第一部分构建rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗，并鉴定其生物学功能目的：构建rhHSP70-HbxAg-DC瘤苗，并鉴定其生物学功能。方法：（1）采集HLA-A2+健康献血员外周血，经Ficoll分离获得外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs），其中贴壁细胞经体外诱导产生DCs，每日观察DCs形态变化；（2）DCs生长第7日开始负载不同浓度的rhHSP70、HBxAg及rhHSP70-HBxAg复合物，流式细胞检测CD80、CD83、CD86、CD11c及HLA-DR的表达，ELISA检测细胞培养上清中IL-12的分泌，寻找出最适抗原负载浓度；（3）未贴壁细胞经尼龙毛柱分离获得T淋巴细胞，以最适抗原浓度体外构建rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗，并将T淋巴细胞与rhHSP70-HBxAg-DC共培养诱导效应细胞及特异性CTL细胞，CCK-8试剂盒检测T淋巴细胞增殖反应。结果：（1）随着培养时间的延长，DCs出现拉长，呈细树枝状典型形态；（2）不同浓度的rhHSP70及HBxAg负载DCs后流式细胞仪检测DC表型的表达及ELISA检测IL-12的分泌显示两种抗原的最适浓度分别为rhHSP70:20μg/ml，HbxAg:5μg/ml；（3）负载抗原的DCs，高表达CD80、CD83、CD86、CD11c及HLA-DR，细胞因子IL-12的分泌也显着增加，其中rhHSP70-HBxAg组最高；（4）rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗可明显刺激T淋巴细胞的增殖。结论：外周血来源的DCs负载rhHSP70和（或）HBxAg后，可分化为成熟DCs，促进T淋巴细胞的增殖。第二部分rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗对肝癌细胞的杀伤效能研究目的：研究rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗对肝癌细胞的杀伤效能。方法：（1）rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗诱导T淋巴细胞产生CTL细胞，体外杀伤靶细胞，LDH释放试验检测CTL细胞对不同处理组靶细胞的杀伤效能；（2）用转染了HBx基因的HepG2（HBx-HepG2）建立小鼠皮下移植瘤模型，将30只小鼠随机分为rhHSP70-HBxAg-DC组、未负载抗原的DC组、PBS组，每3日测量瘤体体积，比较各组对裸鼠移植瘤生长的抑制作用；（3）治疗后第28d处死小鼠，分离瘤体，行免疫组化检测瘤体HBx蛋白、AFP以及Bcl-2、PCNA、Fas、Bax、Caspase的表达。结果：（1）rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗诱导的CTL细胞能有效杀伤HBx-HepG2细胞与SMMC-7721细胞，其中对HBx-HepG2细胞的杀伤最明显，而对NK细胞敏感的K562细胞及正常肝细胞L02无明显杀伤作用，同时对被抗MHC-Ⅰ类复合物抗体处理过的HBx-HepG2细胞与SMMC-7721细胞杀伤效能明显下降；（2）rhHSP70-HBxAg-DC组和对照组的移植瘤生长受到明显抑制，其中rhHSP70-HBxAg-DC组最明显；（3）免疫组化结果显示瘤体组织中有HBx蛋白、AFP的表达；Bcl-2、PCNA的表达较对照组下调，而凋亡相关基因Fas、Bax和Caspase较对照组表达上调。结论：rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗可诱导产生特异性抗HBV相关肝癌细胞效应，有一定的临床应用前景。
王薇[2]（2011）在《纳米材料在抗肿瘤免疫治疗中的应用研究》文中指出目的：近年来,抗肿瘤免疫疗法在肿瘤治疗中的应用日益受到医学界的重视,其中树突状细胞（dendritic cells，DC）疗法是抗肿瘤免疫治疗领域中的一个重要研究方向,已在多种肿瘤的临床治疗试验中显示出较好的应用前景。然而,DC抗肿瘤疗法的疗效尚有较大改进空间,因此仍需发展新的技术和方法以进一步增强DC所诱导的抗肿瘤免疫反应。碳纳米管（Carbon nanotubes, CNT）作为一种优良的载体可携带多种生物活性分子穿越生物膜,将DNA、RNA、多肽、蛋白、药物等带到效应器官及细胞内。在本研究中,我们评估了碳纳米管对肿瘤抗原的载体效应,构建了碳纳米管与肿瘤蛋白共价复合物（CNT-TumorP）,用以刺激DC,在体外观察了碳纳米管是否会影响DC对肿瘤蛋白的吞噬,并评价了碳纳米管-肿瘤蛋白共价复合物对DC所诱导的抗肿瘤免疫反应的影响。方法：抽取健康志愿者外周血,常规分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）,贴壁去悬浮法分离单核细胞后,加入含重组人巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）和重组人白介素-4（rhIL-4）的RPMI 1640+10% fBS完全培养基中培养6天诱导出DC；用细胞裂解液裂解人乳腺癌细胞MCF-7,提取细胞裂解蛋白（tumor lysate protein）,标记上FITC荧光,再与经过表面处理的多壁碳纳米管在催化剂碳二亚胺（EDAC）的作用下进行共价偶联；用碳纳米管-肿瘤蛋白的复合物刺激DC后,激光共聚焦显微镜下观察DC对肿瘤蛋白的吞噬,流式细胞术检测DC表面CD40、CD83、CD86、HLA-DR分子的表达水平；在体外用可溶性肿瘤抗原或碳纳米管-肿瘤抗原复合物负载的DC刺激PBMC,以MTS法检测PBMC对MCF-7细胞的特异性杀伤作用；将MCF-7细胞置于含各种浓度碳纳米管的培养基内,检测碳纳米管对细胞存活的影响。结果：1)人外周血单个核细胞在rhGM-CSF和rhIL-4因子的协同诱导下,可获得一定数量及功能正常的未成熟树突状细胞,20m1人外周血大约可诱导出2×106个DC；2)碳纳米管与裂解蛋白共价连接后,仍具有较好的分散性及稳定性；3)流式结果显示,肿瘤蛋白与碳纳米管结合后,DC对肿瘤蛋白的吞噬增加,平均荧光强度在肿瘤蛋白浓度为1μg/ml或0.1μg/ml时,分别提升了84%和95%（p<0.05）；4)激光共聚焦显微镜显示,碳纳米管与肿瘤蛋白的复合物可被DC吞入细胞质中；5)碳纳米管对DC的表型不产生影响,不会促进DC的成熟；6)以碳纳米管-肿瘤蛋白的复合物刺激DC,可显着增强肿瘤蛋白的免疫原性,改善DC对淋巴细胞的活化,进而提升DC所诱导的淋巴细胞对靶肿瘤细胞的杀伤效应；7)碳纳米管-肿瘤蛋白的复合物所增强的抗肿瘤免疫效应具有抗原特异性,对其它细胞的杀伤作用无显着增强；8)所用碳纳米管的安全性较好,在0.0005-0.5μg/ml的浓度范围内,对MCF-7的存活不产生影响。结论：碳纳米管与肿瘤蛋白共价偶联后,在体外能促进DC对肿瘤蛋白的吞噬,并提升DC所诱导的淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,因而有可能在基于DC的抗肿瘤免疫治疗中具有潜在的应用价值。目的：抗肿瘤免疫治疗作为一种重要的肿瘤辅助治疗手段,能有效提升传统治疗方法的疗效,改善病人的预后。然而,肿瘤免疫疗法中普遍存在的一个重要问题是相关肿瘤抗原的免疫原性往往较弱,导致治疗效果有限。提高肿瘤抗原免疫原性的一种直接有效的方法是应用免疫佐剂。传统铝佐剂尽管在人类疫苗中有七十余年的应用历史,但其在增强抗肿瘤免疫方面的效果一直不佳。在本研究中我们用纳米氧化铝作为肿瘤疫苗的佐剂,在小鼠体内比较纳米铝与传统铝佐剂在抗肿瘤免疫治疗中的效果,以此来评价纳米铝作为肿瘤疫苗佐剂的潜在应用价值。方法：用H22肝癌细胞系在BALB/c小鼠体内建立皮下肿瘤模型（DayO）；H22细胞用丝裂霉素C灭活后作为肿瘤细胞疫苗；第7天（Day7）将荷瘤小鼠随机分为四个组,分别皮下注射生理盐水、肿瘤细胞疫苗（TCV）、肿瘤细胞疫苗联合氢氧化铝佐剂（TCV+Alum）或肿瘤细胞疫苗联合纳米铝佐剂（TCV+Nano-alum）进行免疫治疗,第14天再进行相同免疫一次。在两次免疫治疗之后（Day14）,每四天测量小鼠肿瘤生长大小。实验末期检测小鼠外周血单个核细胞对肿瘤细胞的杀伤率,并取肿瘤组织进行病理切片观察淋巴细胞浸润和肿瘤坏死。结果：1)皮下肿瘤生长情况观察：TCV+Nano-alum组的平均肿瘤面积均明显小于对照组（p<0.05）,除TCV+Alum组的肿瘤面积在第14天明显小于对照组外,其它治疗组与对照组相的平均肿瘤面积在所有检测点无差异；2)体外淋巴细胞毒性试验结果显示：对照组、TCV组、TCV+Alum组和TCV+Nano-alum组的肿瘤杀伤率分别是9.9±6.9%、30.1±3.09%、35.63±2.8%和67.96+9.54%,其中TCV+Nano-alum组显示了最强的肿瘤杀伤作用（p<0.05）；3)肿瘤组织病理切片观察：治疗组比对照组有更多的淋巴细胞浸润,且TCV+Nano-alum组更可见肿瘤坏死。结论：纳米铝可提升肿瘤细胞疫苗的免疫治疗效果,因此有可能作为一种新型的佐剂在肿瘤的免疫治疗中发挥有效作用。目的：半抗原二硝基氟苯（dinitrophenyl, DNP）修饰后的肿瘤细胞疫苗（tumor cell vaccine, TCV）可明显提升针对恶性黑色素瘤的免疫反应,并改善患者预后。然而,DNP瘤苗修饰法能否促进针对其它肿瘤的免疫反应,仍有待于探索。本研究的目的,是评价DNP修饰的瘤苗是否会影响人淋巴细胞对人乳腺癌细胞和人肺癌细胞的杀伤效应。并将DNP与另一类广泛应用于肿瘤细胞疫苗的修饰物——新城疫病毒Ulster株（New Castle Disease Virus of Ulster Strain, NDV Ulster）在增强淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤作用方面的效果进行比较。方法：人乳腺癌细胞系MCF-7和人肺癌细胞系H23用丝裂霉素C灭活,再经DNP/NDV修饰（或不修饰）后作为肿瘤疫苗；抽取健康志愿者外周血,用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）,将其用作杀伤肿瘤靶细胞的效应细胞。本试验将PBMC（其中富含的淋巴细胞发挥直接杀伤作用）分为三组：未经肿瘤疫苗刺激的淋巴细胞（T）经未修饰的肿瘤疫苗所刺激过的淋巴细胞（T+TCV）,和经DNP（或NDV）修饰的肿瘤疫苗所刺激过的淋巴细胞（T+DNP-TCV或T+NDV-TCV）。淋巴细胞与各种肿瘤疫苗共同孵育三天后,用标准的MTS肿瘤抑制法检测淋巴细胞对靶细胞的杀伤。结果：1)比之对照组（T组）,不论是未修饰的肿瘤疫苗（T+TCV组）还是DNP修饰过的肿瘤疫苗（T+DNP-TCV组）,均诱导淋巴细胞产生了针对MCF-7或H23细胞更强的杀伤作用；2)在MCF-7为靶细胞时,DNP修饰过的肿瘤疫苗（T+DNP-TCV组）所诱导的肿瘤杀伤,要明显高于未经修饰的肿瘤疫苗（T+TCV组）；3)DNP与NDV Ulster相比,两者增强抗肿瘤免疫反应的程度是相似的,且产生的杀伤作用不针对非肿瘤靶细胞。结论：DNP修饰的肿瘤疫苗能显着增强人淋巴细胞对乳腺癌细胞的特异性杀伤作用。提示DNP肿瘤疫苗修饰法除了可用于治疗恶性黑色素瘤之外,也可能在针对其它人类肿瘤的免疫治疗中发挥作用。
李江斌[3]（2010）在《可溶性人PD-1蛋白对肝癌患者树突状细胞功能的影响》文中研究说明原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一种严重威胁人类健康和生命安全的恶性肿瘤,为全球常见肿瘤的第5位,其死亡率居恶性肿瘤的第3位[1],我国肝癌死亡率在城市仅次于肺癌,在农村则次于胃癌,其发病率逐年增高,每年全球HCC死亡率高达50多万人,而新发病人数则达到60多万人,其中约50%发生于我国[2]。肝癌恶性程度高、预后差、病死率高,多数患者在经确诊时,已属于中晚期[3],由于患者的肝功差,且多伴有转移,仅10%-20%的患者可行姑息性手术切除,切术后5年生存率仅为25%-50%。因此,新的能够有效抑制肝癌细胞生长的方法将是目前研究的关键。随着对肿瘤免疫学的深入研究,证明了机体对肿瘤存在特异性免疫反应,这为肿瘤治疗指明了新方向,使免疫疗法成为肿瘤治疗的重要手段之一,其中以DC瘤苗为基础的生物免疫治疗成为近年来人们研究的热点,目前部分DC瘤苗已进入Ⅰ、Ⅱ期临床试验[4]。树突状细胞（DC）作为目前已知的专职且功能最为强大的抗原递呈细胞（APC）,参与抗原的捕捉、加工、处理和递呈,是淋巴细胞活化、增生、发挥效应的始动环节,主要参与细胞免疫和T细胞依赖的体液免疫,在抗肿瘤免疫应答中起关键作用[5]。体外和动物实验表明,以适当形式的肿瘤抗原负载DC制备瘤苗,可激活能够识别、杀伤肿瘤细胞的特异性T细胞,并可产生免疫记忆效应。大量的临床试验研究也表明DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗具有良好的应用前景[6]。在人体的抗肿瘤免疫机制中,T细胞介导的细胞免疫为主要方式。初始T细胞的活化需要两个信号,即由T细胞抗原受体（TCR）与DC上的抗原肽-MHC分子复合物结合提供的抗原特异性信号,又需要DC上的B7共刺激分子与T细胞上的CD28分子结合提供的共刺激信号[7]。只有双信号共同刺激才能有效激活T细胞反应,若缺乏第二信号刺激,将使T细胞处于克隆无能或无应答状态[8],因此B7/CD28共刺激信号对T细胞的活化起着至关重要的作用。近年来,PD-L1/PD-1作为B7/CD28协同刺激分子超家族的一个重要成员,其作用已被越来越多人重视[9]。PD-L1作为B7家族的一个新成员,主要表达于造血细胞,如静息的T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞[10],其受体PD-1主要表达在活化的T细胞、B细胞、髓系细胞和胸腺细胞[11]。DC上的PD-L1与其受体结合后,可产生抑制信号,并诱导抗原特异性T细胞凋亡、无反应性和衰竭,对机体的免疫应答起负性调控作用[12]。基础研究表明,肿瘤微环境中存在的VEGF、IL-10、TGF-β等细胞因子可诱导树突状细胞PD-L1表达上调,使得肿瘤患者的DC成熟和功能障碍,激活T淋巴细胞能力降低,不能产生有效的抗肿瘤免疫反应,使肿瘤细胞发生免疫逃逸[13]。研究发现,PD-L1是参与肿瘤免疫逃逸过程的一个重要分子,因此封闭PD-L1/PD-1信号传导通路已成为肿瘤免疫治疗的一个重要策略。目的:本实验观察了应用shPD-1蛋白封闭PD-L1/PD-1信号传导通路,对肝癌患者DC刺激自体T淋巴细胞增殖、分泌细胞因子和刺激CTL杀伤能力的影响,进而探讨通过阻断负性调节信号PD-L1/PD-1来增强肝癌患者DC的免疫刺激能力,为DC瘤苗在临床中的应用提供新的思路。方法:以Ficoll密度梯度离心法从肿瘤患者外周血中分离出外周血单个核细胞（ PBMC）后,再以粘附法获得单核细胞（Mo）,应用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（ rhGM-CSF）、白细胞介素-4（ rhIL-4）、α-肿瘤坏死因子（rhTNF-α）体外诱导培养DCs;观察给予或不给予shPD-1蛋白对DC的影响。应用流式细胞术检测DC免疫表型,MTT法检测DC刺激自体T淋巴细胞的增殖能力, ELISA法测定上清液中IL -12p70的水平,MTT法检测效应淋巴细胞对靶细胞的杀伤活性。结果:封闭DC表面PD-L1分子后,DC刺激T细胞增殖,分泌IL -12p70能力显着提高,促进CTL杀伤反应的能力显着增强（P<0.05）。结论:可溶性人PD-1蛋白（shPD-1）封闭DC表面PD-L1分子后能显着提高DC活化T细胞的能力,促进DC诱导的抗肿瘤免疫反应。
鲍传庆[4]（2010）在《大肠癌患者自体树突状细胞免疫治疗技术临床应用研究》文中进行了进一步梳理大肠癌包括结肠癌和直肠癌,是最常见的消化道恶性肿瘤之一。在世界范围内,大肠癌发病率居恶性肿瘤第4位,已占全身恶性肿瘤的12%-15%,每年有102万新发病例和53万死亡病例。自上世纪70年代以来,我国大肠癌发病率和死亡率有不断上升趋势（以结肠癌上升为主）,并且青年期（<30岁）大肠癌发病率高是我国大肠癌的一个显着临床特点。因大肠癌早期症状不明显,多数患者就诊时已发生区域或远处转移,单纯手术治疗不能显着改善患者预后,因此综合治疗成为目前治疗大肠癌的重要方法。生物治疗作为大肠癌综合治疗的组成部分,即可以独立运用,又可与手术及放、化疗结合,具有疗效高、特异性强、副作用小等优点,已成为研究的热点之一。树突状细胞（DC）是目前已知功能最强大的专职抗原递呈细胞,是机体T细胞特异性免疫应答的直接启动和调控者。它最大的特点是能够显着刺激初始型T细胞的增殖,在免疫反应的诱导中具有独特的地位。DC在外周组织中摄取抗原,加工分解成抗原肽与MHC-I/II类分子结合,然后移行到周围淋巴器官通过MHC分子递呈抗原给T淋巴细胞,激发特异性抗肿瘤免疫反应。与其他抗原递呈细胞相比,DC表达MHC-I/II类分子、共刺激分子和粘附分子的水平更高,因此在刺激T细胞增殖,抗肿瘤免疫中起重要作用。早在1995年国外学者就开展了DC治疗肿瘤的I期临床试验,以DC为载体开发的DC肿瘤疫苗在前列腺癌、恶性黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、脑胶质瘤、肾细胞癌等恶性肿瘤患者治疗中取得了显着的疗效。DC肿瘤疫苗用于结直肠癌的研究也表明其安全有效,不仅可降低结直肠癌患者癌胚抗原（CEA）水平,甚至可使肺部转移病灶消失。以DC为载体开发的DC肿瘤疫苗已成为现今最先进、最有希望的肿瘤免疫治疗方法之一。由于大肠癌是一种免疫原性较弱的肿瘤,且肿瘤细胞缺乏共刺激分子或某些粘附分子,并可通过抗原调变、下调MHC分子表达等机制介导肿瘤免疫逃逸,从而影响免疫治疗效果。另有研究表明,肿瘤患者体内DC数量减少及功能缺陷,使其无法有效递呈肿瘤抗原,亦是肿瘤免疫逃逸的主要原因之一。因此,提高肿瘤患者体内DC的数量并维持其强大的抗原识别、呈递功能是实施抗肿瘤免疫治疗的关键措施之一。正因为此,应用足够数量和功能正常的DC细胞进行细胞免疫治疗或基于DC细胞的抗肿瘤疫苗研究工作越来越受到重视。对肿瘤患者提供外源性DC细胞进行细胞免疫治疗的方法现已经历了以下阶段的发展:早期多采用已知肿瘤相关抗原肽或肿瘤细胞mRNA修饰致敏DC,但疗效不佳。随着研究的深入,改用肿瘤全抗原致敏DC的方法,即,将肿瘤细胞与DC融合或用肿瘤细胞裂解物负载DC制成杂交疫苗,用于胃癌、肝细胞癌及大肠癌治疗的临床研究取得较好的抗肿瘤效果。而最近研究发现,DC表面表达多种热休克蛋白（HSP）受体（如CD91,CD40,TLR2/4或LOX1）,HSP可作用于DC或单核细胞,刺激其产生细胞因子（IL-12,TNFa,IL-6等）,增强机体非特异性免疫反应。2004年免疫学权威杂志《Immunity》报道,与多肽负载的DC相比,HSP70-抗原肽复合物负载的DC在体外激发CD8+ T的能力远远高于前者（1000倍）。提示如果将HSP与DC进行有机结合,发挥二者各自的优势,将会产生更强的免疫激发作用。有鉴于此,本研究对大肠癌患者热休克凋亡自体的大肠癌细胞抗原制备、自身的树突状细胞体外诱导、以及抗原负载方法等进行了初步探讨,并比较了分别负载热休克诱导凋亡大肠癌细胞株和肿瘤细胞裂解物两种不同抗原的DC对大肠癌细胞的杀伤效果,并探讨了热休克凋亡的人自体大肠癌细胞致敏自体的树突状细胞疫苗对大肠癌患者术后免疫功能的影响,为制备大肠癌细胞肿瘤疫苗研究提供技术基础。研究共分为三个部分:第一部分自体大肠癌细胞负载树突状细胞的方法研究目的:建立自体热休克凋亡大肠癌（包括结肠、直肠癌）细胞抗原制备、树突状细胞体外诱导、以及抗原负载方法,为制备树突状细胞肿瘤疫苗提供技术基础。方法:采用酶消化法从手术切除的14例大肠癌新鲜组织获得单细胞悬液,热休克处理后用桦脂酸诱导其凋亡制备成细胞抗原;采集外周静脉血,分离单个核细胞,经GM-CSF与IL-4体外诱导成未成熟树突状细胞,负载细胞抗原后制备成DC肿瘤疫苗;苔盼蓝染色进行细胞总数及活细胞计数,计算细胞活率;用FITC-Annexin-Ⅴ和PI标记细胞,流式细胞仪检测,计算细胞凋亡率。软琼脂克隆法检测细胞体外成瘤能力;按《中华人民共和国药典》2005版第三部规定的方法进行内毒素检测。结果: （1）肿瘤细胞抗原得率:（11.81±0.65）×106/g组织;平均凋亡率:（93.16±2.31）%;（2）imDC平均得率为（9.75±0.82）×106（/121.64）×106个PBMC,细胞活率>95%;imDC表型分析:CD11c+CD14-、CD11c+HLA-DR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD83+、CD11c+CD86+表达率分别为（87.58±2.56）%、（87.97±0.98）%、（2.21±0.69）%、（4.85±1.22）%、（5.02±0.95）%;（3）DC平均得率为（6.76±0.98）×106/（9.75±0.82）×106个imDC,细胞活率>95%,DC表型:CD11c+CD14-、CD11c+HLA-DR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD83+、CD11c+CD86+表达率分别为（ 93.45±1.25 ） %、（89.79±1.35）%、（87.85±1.62）%、（70.74±6.45）%、（95.54±2.18）%。内毒素检测均合格（≤5 IU/mL）。结论:本方法稳定、安全、可靠,可制备出成熟DC。第二部分两种不同方式负载大肠癌细胞株的树突状细胞体外刺激淋巴细胞抗肿瘤活性的比较目的:比较树突状细胞以两种不同方式负载大肠癌细胞株体外刺激淋巴细胞的抗瘤活性。方法:分离30例大肠癌患者外周血单核细胞体外诱导DC,分别负载热休克诱导凋亡大肠癌细胞株和肿瘤细胞裂解物,以此刺激淋巴细胞作为效应细胞,大肠癌细胞株为靶细胞,MTT法测定效应细胞对靶细胞的杀伤作用。结果:负载热休克大肠癌细胞的DC与负载肿瘤细胞裂解物的DC都显示对靶细胞的杀伤活性,但前者的杀伤率显着高于后者（P<0.05）。结论:负载热休克肿瘤细胞的DC是一个更为有效的负载方式。第三部分自体DC治疗对大肠癌患者术后免疫功能的影响目的:探讨热休克凋亡的人自体大肠癌细胞致敏的树突状细胞疫苗对大肠癌术后免疫功能的影响。方法:从大肠癌患者外周血单个核细胞中诱导DC,并用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4刺激活化,经热休克凋亡自体大肠癌细胞致敏制备DC疫苗。将28例大肠癌术后患者随机分为DC疫苗治疗组14例,化疗对照组14例。对两组病例治疗前后免疫功能、临床疗效进行观察比较。结果:DC疫苗组治疗后外周血CD3+、CD4+/CD8+及NK细胞比率较治疗前明显升高（P<0.05）,且明显高于对照组化疗后的CD3+、CD4+/CD8+及NK细胞比率（P<0.05）;DC疫苗治疗后患者血清IL-2、IL-12、IFN-γ水平较治疗前明显升高（P<0.05）,且明显高于对照组（P<0.05）,生存时间明显延长。结论:大肠癌术后行热休克凋亡自体大肠癌细胞致敏的DC疫苗治疗,可提高患者的细胞免疫水平。
吴尘轩[5]（2008）在《增强树突状细胞及其相关exosome抗肝癌免疫效应的实验研究》文中提出肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的临床治疗效果较差,研究者不断探索有效的治疗方法以期减少术后复发、延长生存时间、提高总体疗效。随着免疫学等基础研究的不断深入,生物治疗日益显示出良好的应用前景。作为肿瘤生物治疗策略之一的树突状细胞（dendritic cell,DC）疫苗的研究与应用已取得相当大的进展。然而在实际应用中DC疫苗的治疗效果往往不如预期,为此,众多学者尝试多种途经增强DC诱导的肿瘤特异性免疫反应,这其中包括对不同来源DC的比较和选择,联合其他辅助药物如中药、多种细胞因子,以及研制新型亚细胞瘤苗exosome等来调节或替代DC功能。Exosome是肿瘤细胞和DC均能分泌一种膜性微囊结构,其重要特性是携带来源细胞的各种功能蛋白,且理化性质稳定、耐高温、制备时易于质控,已经在黑色素瘤、肺癌等的治疗中取得良好效果,用于抗肝癌的研究尚处于探索阶段。本课题尝试应用多种来源的单核细胞作为前体制备DC疫苗,又分别制备人肝癌细胞株SMMC7721来源（Tumor-derived exosome,Texo）和DC来源的exosome（DC-derived exosome,Dexo）,研究其对抗肝癌免疫的诱导及调节效应,并初步探讨了中药单体黄芪甲苷对DC及其相关exosome诱导特异性抗肿瘤免疫的调节作用,为研制更具临床应用前景的用于肝癌的肿瘤疫苗和提高其治疗效果提供更多选择。目的1.应用多种来源的单核细胞,通过简便有效的方法,体外诱导培养获得足够数量及具成熟表型的DC,为DC疫苗的进一步研究及应用打下基础;2.对比分析Texo和Dexo的形态、表型及功能,研究此新型亚细胞瘤苗在抗肝癌免疫中的作用;3.观察中药单体黄芪甲苷（AstragalosideⅣ,ASI）对于DC及其exosome免疫功能的调节作用,探讨其作为免疫增强剂的可行性。方法1.提取健康人外周血、人脐血及肝癌患者术中失血的单核细胞,用细胞因子组合rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导培养DC,光镜、电镜观察形态,流式细胞仪鉴定其表型;2.离心/超滤/超离法提取SMMC 7721来源exosome（Texo）及SMMC 7721抗原致敏DC来源的exosome（Dexo）,电镜观察,Western-blot检测其携带的蛋白;观察二者刺激淋巴细胞增殖情况,ELISA检测淋巴细胞培养上清中IL-2,MTT法检测不同组合激活的效应淋巴细胞对SMMC-7721的细胞毒效应。3.在DC诱导培养过程中加入ASI,光镜及电镜观察细胞形态,流式细胞仪检测DC表型,ELISA法测定培养上清中IL-12和MHCⅡ类分子水平;观察黄芪甲苷对DC刺激淋巴细胞增殖的影响;MTT法测定黄芪甲苷作用下DC及Dexo诱导的CTL对SMMC 7721特异性杀伤效应。结果1.三种来源的单核细胞均可体外诱导培养为具有典型形态和表型的DC;术中失血来源DC表面标志物表达水平稍低,但较未诱导前有显着的提高。2.应用少量细胞培养上清（60～80mL）提取exosome;Dexo和Texo具有相似的形态特征;前者表达CD40、CD80、CD81、CD86、CD54、MHCⅠ、MHCⅡ（HLA-DR）;而后者CD40缺乏,CD80、CD86和MHCⅡ（HLA-DR）相对低表达;二者在DC参与下均可显着刺激淋巴细胞增殖及IL-2分泌,且能激发较强的针对SMMC7721的特异性细胞毒作用,效果高于致敏DC组（P＜0.05）;Dexo具有刺激淋巴细胞活化增殖的作用,并可诱导具有特异性杀伤活性的CTL,杀伤效率（%）明显高于单纯Texo（30.93±11.1 vs 10.24±7.37,P=0.004）,但低于致敏DC组（30.93±11.1%vs 43.76±8.93%;P=0.050）。3.黄芪甲苷作用下DC生长状态及形态特征较常规诱导组无明显差异;各表面标志较常规诱导组均有不同程度上调,其中CD83表达显着上调（73.5%vs 41.3%）;DC培养上清IL-12含量（pg/mL）较常规诱导组明显升高（632.65±14.26 vs 442.85±38.96,P=0.000）,且该组DC刺激淋巴细胞增殖作用增强;黄芪甲苷可使未成熟DC释放exosome增加,并可促进DC诱导的CTL对SMMC7721的特异性杀伤（%）（59.98±5.23 vs 46.50±2.31,P=0.002）,而对Dexo无明显作用。结论1.健康人外周血、脐血和肝癌病人术中失血来源单核细胞均可在体外诱导获得具有典型形态和表型的成熟DC,用于后续肝癌DC疫苗实验研究;肝癌术中失血来源DC成熟度稍低,但有望通过体外诱导培养并添加促成熟因子提高肝癌患者DC成熟标志物的表达,从而提高其免疫功能。2.Dexo作为一种既携带肿瘤抗原又具有抗原提呈作用的亚细胞结构,可诱导淋巴细胞的增殖,诱发特异性杀伤效应,此作用在DC参与下明显增强,Dexo有可能完全或部分替代DC而发挥肿瘤疫苗或天然抗肿瘤佐剂的作用;Texo在体外不能单独诱导初始T淋巴细胞活化增殖,但是在机体内环境中仍然有可能发挥其免疫学功能,诱导有效的抗肝癌免疫反应。3.黄芪甲苷可通过促进DC成熟和抗原提呈功能、增加其功能性细胞因子IL-12的释放,进而增强DC诱导的特异性CTL细胞毒作用,因此有望作为一种天然的免疫增强剂应用于DC介导的抗肝癌治疗。
曹大勇[6]（2008）在《重组腺病毒介导IL-18和AFP基因修饰的树突状细胞体外诱导抗肝癌免疫治疗的研究》文中研究表明原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是中国和部分亚洲地区最常见的恶性肿瘤之一，具有复发率高，预后较差的特点，严重威胁着人类的健康。尽管目前对原发性肝癌的治疗已取得一些进展，但对于晚期患者的治疗和预防复发及转移效果仍不理想，因此，有必要寻求一种更为有效的治疗手段。围绕着树突状细胞建立的特异性肿瘤免疫治疗方法，为免疫治疗原发性肝癌提供了新方法。甲胎蛋白（ alpha-feto protein，AFP）主要见于肝癌和生殖细胞来源的肿瘤，是一种胚胎抗原，在70%-80%的原发性肝癌中有较高的表达水平，因此，是HCC免疫治疗的一个良好的靶分子。在以往的研究中证实AFP能够作为一种潜在的诱导特异性的CTL反应的肿瘤抗原用于AFP分泌性肝癌的靶向性免疫治疗。但是以AFP作为靶点均存在诱导免疫效应弱的缺点。而利用转基因技术将某些细胞因子基因导入DC（例如IL-18），具有增强原先较低的肿瘤细胞的免疫原性，提高宿主对肿瘤抗原识别能力以及增强DC的肿瘤抗原递呈的功能，从而达到诱导更强的抗肿瘤免疫效应的目的。因此，在本研究中，我们在以AFP基因为靶点的基础上，联合IL-18基因，通过腺病毒介导Ad-AFP和Ad-IL-18共感染DC，探讨其能否增强DC免疫刺激功能、提高AFP特异性CTL免疫效应的可行性。第一部分：人IL-18、AFP基因腺病毒表达载体的构建及鉴定目的构建能高效转导AFP、IL-18基因的重组腺病毒，进行病毒扩增和滴度测定，并检测AFP、IL-18抗原表达，以用于DC基因治疗的实验研究。方法应用AdEasy?腺病毒表达载体系统分别构建表达AFP、IL-18的重组腺病毒和对照载体Ad-GFP。目的基因首先克隆到pShuttle-CMV形成穿梭载体，然后转染到高效的原核细胞一大肠杆菌BJ 5183（内含腺病毒骨架质粒pAd-Easy）中，并在该菌内进行同源重组，产生包含目的基因的重组腺病毒基因组质粒，转染293细胞包装为重组腺病毒。检测病毒滴度后，进一步对重组腺病毒分别感染293和H1299细胞的结果进行IFA法检测目的基因在靶细胞中的有效表达。结果经酶切、PCR鉴定证实，穿梭质粒和重组腺病毒质粒插入片段为IL-18、AFP基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性，可以在293细胞中形成病毒颗粒。滴度测定结果为Ad-IL-18 2.65×109 PFU/ml；Ad-AFP采用同样方法测定的滴度为4.01×109 PFU/ml。重组腺病毒感染H1299细胞后IFA法检测结果显示目的基因表达于感染细胞中，表明腺病毒介导的IL-18、AFP基因感染的有效性。结论成功构建了复制缺陷型AFP、IL-18重组腺病毒及对照重组腺病毒Ad-GFP；重组腺病毒Ad-IL-18、Ad-AFP能高效介导基因在被感染细胞内有效表达。第二部分：肝癌患者外周血PBMC来源的树突状细胞的体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定目的以经动员富集的肝癌患者外周血单个核细胞（Mono nuclear cell，MNC）为来源，建立体外诱导培养DC的方法；以健康供者MNC为对照，检测肝癌DC的形态、表型及功能；利用Ad-GFP作为研究对象，测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率。方法选择肝癌患者及正常人外周血，血细胞分离机分离富集外周血MNC，经淋巴细胞分离液梯度离心、聚苯乙烯细胞培养板贴壁纯化后，加入含GM-CSF和IL-4的X-VIVO 15培养液联合诱导DC分化，诱导d6加入TNF-&促进DC成熟。分别以倒置显微镜、电子显微镜观察DC形态变化，FCM检测细胞表型变化。利用Ad-GFP作为研究对象，测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率，MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。取培养第7天的DC，按不同的MOI将重组腺病毒加入培养孔中，FCM检测细胞感染前后的表型变化以及腺病毒的感染效率。结果肝癌患者DC鉴定：诱导后，患者DC显示出典型的形态及表型特征。诱导d8（加TNF-&活化48h），CD1a CD11c CD86 CD80、HLA-DR各抗原表达量明显升高，为典型DC表型；健康对照DC各抗原表达量比较，二者间无显着性差异（P>0.05 ）。混合淋巴细胞反应结果显示，患者DC具有高效地刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力，其刺激指数（ SI）与健康对照DC的SI无显着差异（P>0.05 ）。用Ad-GFP感染培养的DCs时，有较好的量效关系和时效关系。当感染增殖率（multiplicity of infection, MOI）为200时，感染24小时大于70%的DCs被转染。且转染后的DCs的形态与对照组相比无明显异常。并且DC经腺病毒感染DC 24小时后，FCM检测细胞表型为成熟DC表型特征。证明Ad-GFP能高效、安全感染培养的DC。结论以肝癌患者经动员富集的外周血MNC为来源，联合应用GM-CSF、IL-4及TNF-&，在体外可诱导培养出具有典型形态、表型及免疫活性的DC。腺病毒介导的基因可在人外周血MNC来源的DC中高效表达。体外诱导抗肝癌免疫治疗的研究目的以腺病毒载体介导AFP基因与IL-18基因修饰树突状细胞，使之即表达肝癌相关抗原AFP，又表达细胞因子IL-18，从而诱导更强的AFP特异性CTLs，探讨AFP、IL－18基因修饰树突状细胞较以往AFP基因修饰DC瘤苗作为肝癌免疫治疗瘤苗是否更具优势。方法分别以Ad-IL－18、Ad-AFP以及Ad-IL-18和Ad-AFP转染DC，以western blot及ELISA法检测三组细胞基因表达，以FCM检测感染后DC表型变化。以感染Ad-IL-18、感染Ad-AFP、共感染Ad-IL-18/ Ad-AFP的DC作为刺激细胞，取患者外周静脉血单个核细胞（PBMC ）中非贴壁细胞（淋巴细胞，T），调整细胞密度为1×106/mL，以含1L-2，10%FCS的RPMI1640培养；将IL-18-DC、AFP-DC与IL-18/AFP-DC以5×104mL密度分别加入上述淋巴细胞中，共同孵育72h （设未致敏DC组和单独淋巴细胞组为对照），再次加入同剂量DC孵育72h，收获细胞分别称为IL-18/AFP-DC-T、AFP-DC-T、IL-18-DC-T、DC-T和T。以IL-18/AFP-DC-T、AFP-DC- T、S-DC-T、DC-T和T作为效应细胞，肝癌细胞株HepG2，SMMC-7721和人肺腺癌H1299作为靶细胞，以不同效靶比接种于96孔板，4h后LDH法测定效应细胞对各肿瘤细胞的杀伤作用。结果western blot及ELISA法检测结果显示目的基因均表达于转染的三组细胞中。FCM结果显示共感染的DC细胞均高表达CD1a、CD11c、CD80、CD86和HLA-DR，表现为成熟DC表型特征。CTL结果显示IL-18/AFP-DC-T、AFP-DC-T组均显示对HepG2高效特异的杀伤活性，显着高于IL-18-DC-T、DC-T组和单纯T组，其杀伤能力与效应细胞数量成正比；IL-18/AFP-DC-T、AFP-DC-T刺激的T细胞组IFN-分泌显着高于IL-18-DC-T、DC-T组和T组；但IL-18/AFP-DC-T刺激组IFN-分泌高于AFP-DC-T而DC-T和T组IFN-分泌亦无明显区别。结论腺病毒介导AFP和IL-18基因修饰DC，能够在体外诱导特异性CTL效应，对表达AFP的肝癌细胞有明显的杀伤作用，而且对HepG2细胞杀伤率大于单独AFP基因转染DC组。
于哲[7]（2008）在《异体树突状细胞与骨肉瘤细胞融合瘤苗的制备及其抗骨肉瘤主动免疫效应实验的研究》文中研究表明骨肉瘤（osteosarcoma）是儿童和青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤。20世纪70年代以前,主要治疗方法是截肢和关节离断,从外科治疗到出现肺转移的平均时间为8个月,5年生存率<25%。随着外科技术和影像学的发展,新辅助化疗的进步,骨肉瘤治愈率有了明显改进,5年生存率达到80%。但目前的治疗手段仍无法解决肿瘤病人的转移、复发和药物耐药等情况,因此,有必要探索一种新的、更为有效的治疗途径。随着对肿瘤发病机制和免疫逃避机制的认识,免疫治疗尤其是主动性免疫治疗为骨肉瘤的综合治疗提供了新的手段。制备针对肿瘤特异性抗原（tumor-specific antigens, TSA）或肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen, TAA）的治疗性瘤苗是目前肿瘤免疫治疗中的研究热点。其抗肿瘤免疫的重要目的就是诱导针对肿瘤抗原的特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytocoxic T lymphocyte,CTL）反应,而CTL的激活依赖于抗原提呈细胞（antigen-presenting cell,APC）提供的抗原多肽和共刺激信号。在抗原提呈细胞中,尤以树突状细胞（dendritic cell,DC）的抗原提呈功能最强,可启动并调节免疫应答,有效刺激T、B淋巴细胞活化,在抗肿瘤、抗感染、移植排斥以及自身免疫性疾病发病过程中起重要作用。本研究以骨肉瘤全细胞提供肿瘤抗原,采用细胞电融合技术将肿瘤抗原通过DC呈递表达于T淋巴细胞表面。全细胞瘤苗的最大的优点就在于融合细胞能够呈递肿瘤细胞所有的抗原,包括已知的和未知的抗原,鉴于目前大多数人类和动物的肿瘤细胞（包括骨肉瘤细胞）抗原类型仍未得到明确的鉴定,用全肿瘤细胞作为瘤苗提供抗原的有效组分仍不失为一类简单、有效的方法。电融合技术是当前生物学界重要的开创性研究手段之一,在制备单克隆抗体、哺乳动物克隆实验研究及肿瘤的免疫治疗方面均获得了广泛的应用,和传统的化学融合方法（如聚二乙醇PEG法）相比,电融合方法是一种更为高效的手段,融合效率通常可以提高1～2个数量级,这在很大程度上弥补了DC数量较少的缺陷,该技术也使两个来源于异体的细胞相互融合成为可能,目前已被广泛应用于瘤苗制备领域。研究工作者之所以如此积极地进行异体融合瘤苗的尝试,是因为在临床应用中自体瘤苗的成功制备通常会受到疾病本身的困绕。首先,对患者自体的肿瘤细胞进行原代培养具有某种不确定性,特别是在保守治疗和以微波、射频等热疗手段处理后的肿瘤组织,失去进一步体外培养的可能;另外,目前肿瘤的治疗方案往往是手术、化疗及放疗等相结合的综合治疗,肿瘤患者的机体经过一系列治疗副效应的累加,患者的血象及血细胞质量通常难以满足进一步的免疫治疗需要,其营养状况也基本处于过消耗状态。而异体的树突状细胞可以从储备的健康志愿者外周血单核细胞获得,又可避免使所有肿瘤患者在接受免疫治疗前都必须提供相当量的自身外周血的缺陷,避免了“雪上加霜”。实验一UMR-106细胞系易感动物的筛选和大鼠骨肉瘤及其肺转移模型的建立目的探讨从普通的封闭群动物中筛选出对UMR-106大鼠骨肉瘤细胞系易感的SD大鼠,并建立其近交系的方法,以及大鼠骨肉瘤及其肺转移模型的建立方法。方法取10对4周龄封闭群饲养的SD大鼠,分别在右股外侧皮下接种1×107个大鼠骨肉瘤细胞UMR-106,观察成瘤情况,选取存活的成瘤的雌、雄大鼠,6周后同笼交配,约4周妊娠期后,产下幼鼠,4周后重复肿瘤细胞皮下接种过程……依照此方法重复共4次,获得第4代UMR-106细胞系易感的近交繁殖SD大鼠;取30只4周龄近交繁殖的SD大鼠随机分为3组,将UMR-106细胞分别以1×106、5×106、1×107个数量注射入大鼠右股外侧皮下。接种后,每周观察肿瘤生长情况,测量肿瘤直径,绘制肿瘤生长曲线,连续6周。至第6周末,取肿瘤及双侧肺,病理取材,HE染色,光镜下观察。结果4周龄封闭群饲养的SD大鼠,以1×107个数量接种肿瘤细胞后,肿瘤发生率仅为30%,筛选易感SD大鼠并近交繁殖4代后,肿瘤发生率达到100%,肺转移率达70%;而1×106及5×106组肿瘤生长情况不佳,均未出现肺转移。结论封闭群饲养的SD大鼠具有一定的遗传差异,经反复筛选并近交繁殖后,遗传性状恢复稳定,成瘤能力得以保持。大鼠骨肉瘤细胞系UMR-106具有较强的致瘤性及较高的肺转移率,应用该细胞系建立的动物模型为骨肉瘤综合治疗奠定了动物实验基础。实验二大鼠骨髓单核细胞为来源的树突状细胞的体外定向诱导、培养及表型鉴定目的以大鼠骨髓单核细胞（Bone Marrow Mononuclear Cell,BMMC）为来源,建立体外诱导、培养DC的方法,并检测该培养过程中,树突状细胞的表型变化情况。方法从大鼠骨髓细胞中分离出单核细胞,经淋巴细胞分离液梯度离心、聚苯乙烯细胞培养板贴壁纯化后,加入含rGM-CSF和rIL-4的RPMI-1640培养液联合诱导DC分化,诱导d6加入nrhTNF-α促进DC成熟。对经标抗大鼠OX62单抗免疫磁珠分离纯化后的DC,分别以倒置显微镜、电子显微镜观察其形态变化,采用流式细胞仪每隔3日检测DC的表型变化情况。结果大鼠骨髓单核细胞经诱导培养9d后,在倒置显微镜和电镜下显示出典型的树突状细胞形态和超微结构;流式细胞术分析显示在DC诱导培养过程中,细胞表面的DC功能相关抗原均呈递增性表达,第0天为OX62 1.78%,MHCⅡ13.68%,CD80 4.77%,CD86 5.77%;第3天为OX62 32.31%,MHCⅡ32.14%,CD80 23.68%,CD86 15.44%;第6天为OX62 63.13%,MHCⅡ68.36%,CD80 43.06%,CD86 54.78%;第9天为OX62 72.41%,MHCⅡ84.71%,CD80 79.06%,CD86 74.80%;而大鼠骨肉瘤相关性抗原CD44在DC始终呈阴性表达。结论以大鼠骨髓单核细胞为来源,联合应用rGM-CSF、rIL-4及nrhTNF-α,在体外可成功诱导培养出具有典型形态、及表型特征的DC,DC的表面分子随着诱导培养时间的推进,呈递增性改变,该研究为进一步研究DC在肿瘤免疫治疗中的应用打下了基础。实验三异体树突状细胞与骨肉瘤细胞融合瘤苗的制备及表型分析目的以Wistar大鼠树突状细胞和SD大鼠骨肉瘤细胞UMR-106为来源,应用细胞融合仪建立体外制备异体融合瘤苗方法,并检测融合细胞的表型变化情况。方法将Wistar大鼠骨髓来源的树突状细胞和SD大鼠骨肉瘤细胞UMR-106以5:1比率混合并悬浮于含10%胎牛血清的完全培养基中,离心后,将细胞悬浮于无血清的培养基中。调整细胞浓度后,将0.5ml含5×106个混合细胞的悬液置于ECM 2001型细胞融合仪的特制电击槽内。融合过程施加两步骤电脉冲,第一步是施加50V交流脉冲,将细胞彼此紧密接触;既而施加250V直流脉冲,使相邻细胞的细胞膜穿孔,细胞质彼此交通,来实现细胞之间的融合。整个施加电脉冲的过程重复一遍,以确保电融合效率。静止5分钟后,将融合细胞移入完全培养基,37℃条件下过夜培养。再收集贴壁细胞,经标抗大鼠OX62单抗免疫磁珠分离纯化后,分别以倒置显微镜、电子显微镜观察其形态变化,采用流式细胞仪检测融合瘤苗的表型变化情况。结果异体树突状细胞和骨肉瘤细胞在电脉冲作用下,实现了细胞间的融合,在扫描电镜和透射电镜下,融合细胞表现出兼具两类细胞外形特点的形态学特征和典型的多细胞核超微结构;流式细胞术分析显示,经过免疫磁珠分离纯化的融合细胞表型分子较两类成分细胞均发生了变化,其同时高表达骨肉瘤细胞表型分子CD44（50.02%）和树突状细胞表型分子OX62（83.55%）,双标阳性细胞比率高达49.43%。结论应用细胞融合仪可以将同种异体来源的树突状细胞和骨肉瘤细胞在电脉冲作用下制备融合瘤苗,融合细胞兼具有树突状细胞与骨肉瘤细胞的形态学及表型特征,异体融合瘤苗有望在针对骨肉瘤的免疫治疗中发挥作用。实验四异体融合瘤苗体外诱导的抗骨肉瘤免疫效应实验目的本研究旨在检验异体融合瘤苗体外诱导T淋巴细胞增殖能力,以及骨肉瘤细胞特异性的细胞毒T淋巴细胞（CTL）的杀瘤效果。方法经标抗大鼠OX62单抗免疫磁珠分离纯化的异体融合瘤苗,接受30Gy的60Co照射后,与SD大鼠骨髓来源的T淋巴细胞作共同培养,旨在刺激T细胞的增殖,并采用MTT法测定细胞毒T淋巴细胞的杀瘤活性。将10裸鼠右后肢皮下接种UMR-106细胞1×106/只,3日后随机分组。治疗组以1×107/只皮内注射活化的T淋巴细胞,连续3次,4周后观察成瘤情况。结果T淋巴细胞和异体融合瘤苗（DOF）经过共同培养,T细胞得以显着增殖。与生理盐水和树突状细胞对照组相比,异体融合瘤苗诱导的UMR-106特异性CTL杀瘤效果显着。裸鼠接种UMR-106细胞28天后,治疗组、对照组肿瘤体积分别为（945±125）mm3和（4867±375）mm3,与对照组相比,治疗组移植瘤的生长受到明显抑制（p<0.05）。结论该研究为异体树突状细胞与骨肉瘤细胞融合瘤苗可以在体外有效的刺激T淋巴细胞增殖,并成功地诱导杀瘤效果显着的UMR-106特异性CTL提供了证据。从而表明异体融合瘤苗为以树突状细胞为基础的免疫治疗领域提供了新的策略,针对临床骨肉瘤患者具有广阔的应用前景。实验五异体融合瘤苗体内诱导的抗骨肉瘤主动免疫效应实验目的本研究旨在探讨以Wistar大鼠树突状细胞和SD大鼠骨肉瘤细胞UMR-106为来源制备的融合瘤苗诱导的特异性抗骨肉瘤免疫学效应及其应用潜能。方法预防接种实验以10只SD大鼠作为1组,收集筛选过的异体融合细胞,经30Gy的60Co照射后作为肿瘤疫苗,洗1遍,调整细胞浓度,于第0天和第14天在实验组每只大鼠腹股沟皮内注射1×106个融合细胞,同时设立4个对照组,分别以生理盐水、经过照射的自身融合的肿瘤细胞、自身融合的DC以及后二者的混合物对大鼠进行皮内接种,1周之后（即第21天）采用盲法在实验组和对照组大鼠右后肢外侧皮下均注射致死量（1×107个）的骨肉瘤细胞,10周之后观察动物生存状况。再次以致死剂量的骨肉瘤细胞（1×107个）对存活下来的大鼠进行皮下注射,7周之后观察动物生存状况以检验该预防保护作用是否具有长效性。主动免疫治疗实验于第0天在每只SD大鼠右后肢外侧皮下接种1×107个UMR-106细胞建立大鼠的骨肉瘤动物模型,分别于第3、7、14天在大鼠腹股沟皮内注射瘤苗进行免疫治疗,绘制动物生存曲线。结果10周之后,在预防接种了异体融合瘤苗的实验组,70%的大鼠抵抗了致死剂量骨肉瘤细胞的攻击,而得以存活。经过预防接种异体融合瘤苗而得以存活的大鼠,全部抵抗了第2次致死剂量的骨肉瘤细胞的免疫攻击,7周之后继续得以存活。异体融合瘤苗主动免疫治疗的效果根据注射融合细胞的数量的不同而出现差异,1×106组疗效较差,仅有10%的个体得以存活,而该剂量在预防接种实验中已经能够取得良好的疗效;2×106组疗效显着,60%的荷瘤大鼠瘤体萎缩、消失而得以长期存活。结论预防接种异体融合瘤苗的实验组产生了强大的抵抗骨肉瘤细胞攻击的预防保护作用,该作用在存活下来的动物机体产生了长效的免疫记忆应答。异体融合瘤苗还可以发挥良好的主动免疫治疗作用,但是治疗剂量与预防接种实验相比需要有所提高。实验结果表明大鼠骨肉瘤细胞系UMR-106与同种异基因树突状细胞的融合瘤苗可诱发有效的特异性抗骨肉瘤免疫学效应,该方法有望在针对抗原表型尚未明确的其它肿瘤的免疫治疗中获得推广应用。
李亮助[8]（2008）在《对白血病化疗药物左旋天冬酰胺酶II的热稳定性改造以及微小残留白血病DNA疫苗的构建、纯化和免疫效果研究》文中认为在治疗急性淋巴细胞白血病的临床实践中有两个长期困扰人们的难题:一个是化疗药物的副作用问题;另一个是导致白血病完全缓解后又不断复发的肿瘤细胞微小残留问题。本课题针对这两个问题进行了初步的探索。在急性淋巴细胞白血病的化疗方案中,左旋大肠杆菌天冬酰胺酶Ⅱ是重要的药物组成部分。但是该酶具有较大的副作用,同时由于其相对较短的半衰期和热不稳定性,使得该药在实际治疗中需要进行频繁地注射,结果使病人产生了更大的痛苦。因此在本研究课题中对如何提高该酶的热稳定性以便进一步提高其半衰期进行了初步研究:通过生物信息学分析手段确定了天冬酰胺酶蛋白质二级结构中一个与热稳定性关系密切的β-转角,并用定点突变的方法将该转角上的第178位的天冬氨酸突变为脯氨酸。实验结果显示:与野生型酶相比,突变体酶在不同温度条件下的热稳定性得到了提高;从能量角度上看,改造后的酶在保持动力学性质(Km和Kcat)基本不变的同时活化能得到了增加。这说明笔者对左旋天冬酰胺酶的改造在不影响酶活性的前提下提高了其热稳定性。对于化疗和骨髓移植不能彻底解决的白血病细胞微小残留问题,本课题对相应的免疫学解决方案进行了探索。虽然肿瘤细胞疫苗在目前来说是一种较有前景的免疫治疗形式,但出于对其安全性方面考虑,笔者决定尝试用另外一种相对安全的免疫形式——DNA疫苗,来治疗微小残留白血病,并对其免疫效果进行了初步研究。本课题采用双质粒系统,其中一个质粒表达经过改造灭活的肿瘤细胞特异性超表达抗原生存素（survivin）和能特异性引起Th1细胞免疫反应的发夹状单链RNA（ssRNA）;另一个质粒表达细胞因子GM-CSF和共刺激分子CD80。结果证明用该DNA疫苗系统免疫BalB/C小鼠能引起较强的细胞免疫应答,诱导较强的T细胞增殖和对肿瘤细胞的CTL杀伤活力。这些结果为进一步研究DNA疫苗对微小残留白血病的实际治疗提供了前期实验室数据基础。DNA疫苗大规模纯化技术的研发是DNA疫苗走向实际临床应用和工业化生产的必不可少的环节。本课题重点对利用排阻层析纯化质粒的技术进行了研究。笔者对不同种类及不同浓度盐缓冲液存在时,各种核酸分子排阻层析行为的变化进行了观察比较。结果显示:在高浓度中性盐存在情况下,不仅是RNA,其它的核酸分子包括宿主基因组DNA和各种质粒同分异构体的层析分辨率都得到了较大提高。进一步探讨深层机制,笔者认为在这一高盐排阻层析纯化过程中同时存在两种分离模式:1、超螺旋质粒DNA主要受到压缩效应的影响以排阻模式被洗脱;2、RNA和宿主基因组DNA则主要受疏水效应的影响从而以相互作用模式被洗脱。我们的实验结果证明使用高浓度（2 M）的中性盐（硫酸铵）将提高排阻层析纯化DNA疫苗的效率。
杨静悦[9]（2007）在《腺病毒介导的基因修饰树突状细胞肝癌瘤苗的制备及其抗HBV相关肝癌的免疫实验的研究》文中研究说明原发性肝癌是中国和部分亚洲地区最常见的恶性肿瘤之一,流行病学资料显示乙型肝炎表面抗原阳性人群肝癌发病率是其他人群的12-300倍。我国人群HBV的携带率在10%左右,而90%的原发性肝癌患者发现HBsAg阳性。尽管目前对原发性肝癌的治疗已取得一些进展,但对于晚期患者的治疗和预防复发及转移效果仍不理想[1～3]。因此,有必要探索一种新的、有效治疗途径。随着人类肿瘤抗原以及肿瘤抗原基因的发现和确认,为肿瘤的免疫治疗尤其是主动性免疫治疗提供了新的手段。直接作用于肿瘤特异性抗原或相关抗原的治疗性瘤苗是目前研究的热点。其抗肿瘤免疫的重要目的就是诱导针对肿瘤的特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytocoxic T lymphocyte,CTL）反应,而CTL的激活依赖于抗原提呈细胞（Antigen-presenting cell,APC）提供的抗原多肽和共刺激信号。在抗原提呈细胞中,尤以树突状细胞（Dendritic cell,DC）的抗原提呈功能最强,可启动并调节免疫应答,有效刺激T、B淋巴细胞活化,在抗肿瘤、抗感染、移植排斥以及自身免疫性疾病发病过程中起重要作用。目前DC在抗肿瘤免疫治疗方面的研究已经取得一些进展,并且在肿瘤的临床治疗上已显示其良好的治疗效果。但是由于大多数肿瘤来说,肿瘤组织中仅部分肿瘤细胞表达一种肿瘤相关抗原,针对单一肿瘤相关抗原的免疫应答无法清除所有肿瘤细胞。并且肿瘤细胞本身存在多种肿瘤相关抗原,针对单一抗原的免疫治疗有时并不能发挥其应有的作用,激发的免疫效应弱。故近来为使DC能够负载更多肿瘤抗原,发挥更大免疫治疗效应,人们研究了DC负载多种抗原的制备方法,包括:经照射的肿瘤细胞与DC共培养,肿瘤细胞来源的RNA转染DC,腺病毒介导多种肿瘤相关抗原感染DC以及多种肿瘤相关抗原肽冲击致敏DC等方法。在这些方法中以肿瘤细胞来源的RNA转染DC以及腺病毒介导多种肿瘤相关抗原感染DC最为有效,但肿瘤细胞来源的RNA具有生物活性不稳定等缺点。因此,在本研究中,我们根据中国人原发性肝癌独有的流行病学特点,应用HBV相关性肝癌中HBV病毒特异性抗原,联合肝癌相关抗原AFP作为免疫治疗靶点,制备AFP、HBsAg基因的腺病毒载体,体外转染人树突状细胞,比较HBsAg- DC、AFP-DC以及AFP / HBsAg-DC瘤苗体外对HBsAg表达的人肝癌细胞株的杀伤活性。探讨腺病毒介导的HBsAg、AFP基因共感染较单基因感染DC能否增强其体外诱导的特异性抗肿瘤免疫效应,以期选择更为有效的DC肝癌瘤苗,为原发性HBV感染肝癌的治疗寻求新的途径。第一部分:HBsAg、AFP基因重组腺病毒表达载体的构建及鉴定目的构建能高效转导HBsAg、AFP基因的重组腺病毒,进行病毒扩增和滴度测定,并检测HBsAg、AFP抗原表达,以用于DC基因治疗的实验研究。方法应用Adeno-XTM腺病毒表达载体系统分别构建表达AFP、HBsAg的重组腺病毒和对照载体Ad-GFP。目的基因首先克隆到pShuttle形成穿梭载体,用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切后将所获HBsAg、AFP基因片段再与线性化的腺病毒载体Adeno-X连接,形成重组腺病毒质粒,再以PacⅠ酶切线性化,转染HEK293细胞包装为重组腺病毒。检测病毒滴度后,进一步对重组腺病毒分别感染HEK293和H1299细胞的结果进行IFA法检测目的基因在靶细胞中的有效表达。结果经酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒和重组腺病毒质粒插入片段为HBsAg、AFP基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒。滴度测定结果为Ad-S 2.65×109 PFU/ml;Ad-AFP采用同样方法测定的滴度为3.16×109 PFU/ml。重组腺病毒感染H1299细胞后IFA法检测结果显示目的基因表达于感染细胞中,表明腺病毒介导的HBsAg、AFP基因感染的有效性。结论成功构建了复制缺陷型AFP、HBsAg重组腺病毒及对照重组腺病毒Ad-GFP;重组腺病毒Ad-S、Ad-AFP能高效介导基因在被感染细胞内有效表达。第二部分:树突状细胞的体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定目的以经动员富集的肝癌患者外周血单个核细胞（Mono nuclear cell,MNC）为来源,建立体外诱导培养DC的方法;以健康供者MNC为对照,检测肝癌DC的形态、表型及功能;利用Ad-GFP作为研究对象,测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率。方法选择肝癌患者及正常人外周血,血细胞分离机分离富集外周血MNC,经淋巴细胞分离液梯度离心、聚苯乙烯细胞培养板贴壁纯化后,加入含GM-CSF和IL-4的X-VIVO 15培养液联合诱导DC分化,诱导d6加入TNF-α促进DC成熟。分别以倒置显微镜、电子显微镜观察DC形态变化,FCM检测细胞表型变化。利用Ad-GFP作为研究对象,测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率,MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。取培养第7天的DC,按不同的MOI将重组腺病毒加入培养孔中,FCM检测细胞感染前后的表型变化以及腺病毒的感染效率。结果肝癌患者DC鉴定:诱导后,患者DC显示出典型的形态及表型特征。诱导d8（加TNF-α活化48h）,各抗原表达量明显升高,分别为:CD1a（ 71.45士4.39）%、CD11c（ 89.68士3.16）%、CD86（91.17士4.43）%、CD80 （ 91.37士4.12）%、HLA-DR（ 94.03士3.01 ）%,为典型DC表型;健康对照DC各抗原表达量为CD1a（ 68.45士5.02）%、CD11c（ 91.09士2.01）%、CD86（92.19士4.36）%、CD80 （ 90.81士3.15）%、HLA-DR（ 93.49士4.18 ）%,二者间无显着性差异（P>0.05 ）。混合淋巴细胞反应结果显示,患者DC具有高效地刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,其刺激指数（ SI）与健康对照DC的SI无显着差异（P>0.05 ）。用Ad-GFP感染培养的DCs时,有较好的量效关系和时效关系。当感染增殖率（multiplicity of infection, MOI）为100时,感染24小时接近80.62%的DCs被转染。且转染后的DCs的形态与对照组相比无明显异常。当MOI为100,感染48小时后接近85.25%的DC被转染。并且DC经腺病毒感染DC 48小时后,FCM检测细胞表型为成熟DC表型特征。证明Ad-GFP能高效、安全感染培养的DC。结论以肿瘤患者经动员富集的外周血MNC为来源,联合应用GM-CSF、IL-4及TNF-α,在体外可诱导培养出具有典型形态、表型及免疫活性的DC。腺病毒介导的基因可感染人外周血MNC来源的DC可高效表达。第三部分:重组腺病毒介导HBsAg和AFP基因修饰树突状细胞体外诱导抗HBV相关肝癌免疫实验的研究目的以腺病毒载体介导AFP基因与HBsAg基因修饰树突状细胞,使之作为抗原呈递细胞,同时呈递HBV肝癌相关抗原AFP和HBsAg,从而诱导更强的特异性CTLs,即可对恶性肿瘤细胞发挥杀伤效应,又可诱导抗HBV免疫的作用。并探讨AFP、HBsAg基因修饰树突状细胞较单基因修饰DC瘤苗作为HBV持续感染的肝癌免疫治疗是否更具优势。方法分别以Ad-S、Ad-AFP以及Ad-S和Ad-AFP转染DC,以IFA法检测三组细胞抗原表达,以FCM检测感染后DC表型变化。以S-DC、AFP-DC与S/AFP-DC作为刺激细胞,取患者外周静脉血单个核细胞（PBMC ）中非贴壁细胞（淋巴细胞,L）,调整细胞密度为1×106/mL,以含1L-2,10%FCS的RPMI1640培养;将S-DC、AFP-DC与S/AFP-DC以5×104mL密度分别加入上述淋巴细胞中,共同孵育72h （设未致敏DC组和单独淋巴细胞组为对照）,再次加入同剂量DC孵育72h,收获细胞分别称为S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L。以S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L作为效应细胞,肝癌细胞株HepG2.2.15,SMMC-7721和人肺腺癌H1299作为靶细胞,以不同效靶比接种于96孔板,4h后LDH法测定效应细胞对各肿瘤细胞的杀伤作用。结果IFA法检测结果显示目的基因均表达于转染的三组细胞中。FCM结果显示共感染的DC细胞均高表达CD1a、CD11c、CD80、CD86和HLA-DR,表现为成熟DC表型特征。CTL结果显示S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L组均显示对HepG2.2.15高效特异的杀伤活性,显着高于DC-L组和单纯L组,其杀伤能力与效应细胞数量成正比;在同一效靶比时S/AFP-DC-L对HepG2.2.15的杀伤率明显高于S-DC-L、AFP-DC-L组;而S-DC-L、AFP-DC-L组对HepG2.2.15的杀伤率无明显区别;S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L刺激的T细胞组IFN-γ分泌显着高于DC刺激的L细胞组和L细胞组;但S/AFP-DC-L刺激组IFN-γ分泌显着高于S-DC-L、AFP-DC-L组;而S-DC-L、AFP-DC-L刺激组IFN-γ分泌无明显区别;对照组DC-L和L组IFN-γ分泌亦无明显区别。结论腺病毒介导AFP和HBsAg基因修饰DC,能够在体外诱导特异性CTL效应,对表达HBsAg的肝癌细胞有明显的杀伤作用,而且对HepG2.2.15细胞杀伤率大于单独转基因者。
于津浦,李牧,葛薇,马双,尤胜国[10]（2006）在《树突状细胞融合瘤苗体内外诱导特异性抗白血病免疫的实验研究》文中进行了进一步梳理本研究观察615鼠骨髓来源树突状细胞（DC）与白血病细胞L615融合瘤苗L615/DC体内外诱导特异性抗白血病免疫的能力。分别制备615鼠骨髓来源DC,用PEG融合法将DC与照射灭活的L615制备L615/DC融合瘤苗并免疫动物,用MTT法和LDH法测定L615/DC融合瘤苗免疫鼠脾细胞体外MLR反应和对L615特异性杀伤活性,同时通过免疫治疗实验检测L615/DC融合瘤苗的体内抗白血病作用。结果表明:研究获得了具有特征形态的树突状细胞,MLR反应表现出强大的异基因免疫刺激功能,当L615/DC融合瘤苗免疫鼠的脾细胞再次接触L615抗原时表现出强烈的增殖活性;LDH实验显示,融合瘤苗组、共培瘤苗组和灭活L615组均可在体外诱导扩增出L615特异性CTL,但融合瘤苗组的CTL在不同效靶比、不同孵育时间的特异性杀伤活性均明显高于另两组（P<0.01）。体内免疫治疗实验中L615/DC融合瘤苗治疗组平均寿命为25.7±1天,有1/4小鼠长期存活,而对照组全部死亡,平均寿命17.5±1天。2个月后对治疗组存活鼠用致死剂量L615攻击不发病。结论:L615/DC融合瘤苗可诱导强大的特异性抗L615免疫,它不仅在体外能特异性识别并杀伤L615细胞,还可有效抑制荷瘤鼠体内肿瘤的生长,延长存活时间,并产生免疫记忆,抵抗肿瘤的二次攻击。L615/DC融合瘤苗为肿瘤免疫治疗提供了新的手段。
二、B7瘤苗与DC瘤苗诱导的抗L615白血病的免疫作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、B7瘤苗与DC瘤苗诱导的抗L615白血病的免疫作用（论文提纲范文）
（1）rhHSP70联合HBxAg负载树突状细胞治疗HBV相关肝癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 构建 rhHSP70-HBxAg-DC 瘤苗，并鉴定其生物学功能 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 rhHSP70-HBxAg-DC 瘤苗对肝癌细胞的杀伤效能研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 硕士研究生期间发表的论文 |
| 本研究所获得基金资助 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（2）纳米材料在抗肿瘤免疫治疗中的应用研究（论文提纲范文）
| 第一部分 碳纳米管对人树突状细胞疫苗抗肿瘤免疫效应的影响 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一章 材料和方法 |
| 1.1 主要材料和试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 人外周血单个核细胞的分离 |
| 1.3.2 人外周血来源的树突状细胞的培养 |
| 1.3.3 人乳腺癌细胞系MCF-7裂解蛋白的提取及浓度检测 |
| 1.3.4 多壁碳纳米管的表征及与肿瘤裂解蛋白的连接 |
| 1.3.5 DC吞噬肿瘤抗原的检测 |
| 1.3.6 DC表型的检测 |
| 1.3.7 DC诱导的对肿瘤特异性杀伤作用的检测 |
| 1.3.8 碳纳米管对MCF-7细胞存活的影响 |
| 1.4 统计学方法 |
| 第二章 实验结果与分析 |
| 2.1 DC的形态学观察 |
| 2.2 提取MCF-7细胞裂解蛋白作为肿瘤抗原 |
| 2.3 多壁碳纳米管特征分析及与肿瘤蛋白共价连接 |
| 2.3.1 表面羧基化的多壁碳纳米管特征分析 |
| 2.3.2 多壁碳纳米管与肿瘤蛋白共价连接 |
| 2.4 DC对肿瘤抗原的吞噬 |
| 2.4.1 流式细胞仪检测DC对肿瘤蛋白的吞噬 |
| 2.4.2 激光共聚焦显微镜观察DC对肿瘤蛋白的吞噬 |
| 2.5 碳纳米管对DC表型的影响 |
| 2.6 碳纳米管对DC诱导的淋巴细胞特异性抗肿瘤作用的影响 |
| 2.6.1 对人乳腺癌细胞MCF-7的杀伤作用 |
| 2.6.2 杀伤作用的特异性检测 |
| 2.7 碳纳米管对外周血单个核细胞的直接刺激作用 |
| 2.8 碳纳米管对MCF-7细胞存活的影响 |
| 第三章 讨论与结论 |
| 3.1 讨论 |
| 3.2 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 纳米铝作为肿瘤疫苗佐剂对抗肿瘤免疫治疗效果的影响 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一章 材料和方法 |
| 1.1 主要材料和试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 制备传统铝佐剂和纳米铝佐剂 |
| 1.3.2 小鼠肝癌细胞H22的培养及肿瘤疫苗的制备 |
| 1.3.3 荷瘤小鼠模型的建立 |
| 1.3.4 动物分组以及免疫治疗方案 |
| 1.3.5 肿瘤生长大小的测量和记录 |
| 1.3.6 小鼠外周血单个核细胞的提取 |
| 1.3.7 体外淋巴细胞毒性试验 |
| 1.3.8 肿瘤组织病理切片检查 |
| 1.3.9 统计学方法 |
| 第二章 实验结果与分析 |
| 2.1 纳米铝佐剂的表征 |
| 2.1.1 纳米铝佐剂的一般性状 |
| 2.1.2 纳米铝扫描电镜观察 |
| 2.2 小鼠肿瘤生长情况 |
| 2.3 体外淋巴细胞毒性试验 |
| 2.4 肿瘤组织病理学观察 |
| 第三章 讨论与结论 |
| 3.1 讨论 |
| 3.2 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 二硝基氟苯修饰的肿瘤疫苗所诱导的抗肿瘤效应的体外评估 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一章 材料和方法 |
| 1.1 主要材料和试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 DNP溶液的配制 |
| 1.3.2 鸡胚内病毒的培养及病毒的滴度检测 |
| 1.3.3 肿瘤细胞疫苗的制备 |
| 1.3.4 肿瘤细胞疫苗与人外周血单个核细胞混合培养 |
| 1.3.5 淋巴细胞毒性试验 |
| 1.3.6 统计学方法 |
| 第二章 结果与分析 |
| 2.1 DNP修饰的瘤苗诱导淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤 |
| 2.1.1 以人乳腺癌细胞系MCF-7为研究对象 |
| 2.1.2 以人肺癌细胞系H23为研究对象 |
| 2.2 DNP修饰的瘤苗与NDV修饰的瘤苗诱导抗肿瘤杀伤作用的比较 |
| 2.3 肿瘤杀伤作用的特异性 |
| 第三章 讨论与结论 |
| 3.1 讨论 |
| 3.2 结论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 树突状细胞肿瘤疫苗 |
| 参考文献 |
| 附录1 英文缩略词汇表 |
| 附录2 文章题录 |
| 致谢 |
（3）可溶性人PD-1蛋白对肝癌患者树突状细胞功能的影响（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 实验一 可溶性人PD-1 蛋白对肝癌患者树突状细胞功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（4）大肠癌患者自体树突状细胞免疫治疗技术临床应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 自体大肠癌细胞负载树突状细胞的方法研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 树突状细胞以两种不同方式负载大肠癌细胞株体外刺激淋巴细胞抗肿瘤活性的比较 |
| 前言 |
| 资料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 自体DC 治疗对大肠癌患者术后免疫功能的影响 |
| 前言 |
| 临床资料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 总结、问题及展望 |
| 综述1：大肠癌生物治疗研究进展 |
| 综述2：树突状细胞肿瘤疫苗的研究进展 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（5）增强树突状细胞及其相关exosome抗肝癌免疫效应的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 第一部分 以单核细胞为前体来源的树突状细胞体外诱导致敏 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 不同来源exosome制备、鉴定及其介导的体外抗肝癌免疫效应 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 黄芪甲苷调节树突状细胞及其exosome抗肝癌免疫作用初探 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 实验主要溶液配制 |
| 综述 |
| 综述一 树突状细胞与肝癌的免疫治疗 |
| 综述一 参考文献 |
| 综述二 Exosome及其相关研究进展 |
| 综述二 参考文献 |
| 致谢 |
（6）重组腺病毒介导IL-18和AFP基因修饰的树突状细胞体外诱导抗肝癌免疫治疗的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 1 人 IL-18、 AFP基因腺病毒表达载体的构建及鉴定 |
| 引言 |
| 1.实验仪器及设备 |
| 2.实实 验材材 料 |
| 3.实验方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 2 肝癌患者外周血 PBMC 来源的树突状细胞的体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 3 重组腺病毒介导 IL-18 和 AFP 基因修饰树突状细胞体外诱导抗肝癌免疫治疗的研究 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）异体树突状细胞与骨肉瘤细胞融合瘤苗的制备及其抗骨肉瘤主动免疫效应实验的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 实验一 UMR-106细胞系易感动物的筛选和大鼠骨肉瘤及其肺转移模型的建立. |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 实验二 大鼠骨髓单核细胞为来源的树突状细胞的体外定向诱导、培养及表型鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 实验三 异体树突状细胞与骨肉瘤细胞融合瘤苗的制备及表型分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 实验四 异体融合瘤苗体外诱导的抗骨肉瘤免疫效应实验 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.3 方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 实验五 异体融合瘤苗体内诱导的抗骨肉瘤主动免疫效应实验 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.3 方法 |
| 5.4 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）对白血病化疗药物左旋天冬酰胺酶II的热稳定性改造以及微小残留白血病DNA疫苗的构建、纯化和免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、急性淋巴细胞白血病治疗中的两个问题 |
| 二、结合生物信息学分析手段改造原有白血病化疗药物从而降低其副作用是一个值得探索的方向 |
| 三、DNA疫苗是一种治疗微小残留白血病的有希望的免疫治疗形式 |
| 四、DNA疫苗纯化工艺探索及纯化机理研究 |
| 第一部分 大肠杆菌左旋天门冬酰胺酶Ⅱ(L-asparginase Ⅱ)的热稳定性改造 |
| 一、实验材料和方法 |
| 二、结果和讨论 |
| (一) 生物信息学分析 |
| (二) 酶的表达和纯化 |
| (三) 温度对酶活性的影响 |
| (四) 动力学性质分析 |
| 三、结论 |
| 第二部分 微小残留白血病DNA疫苗的免疫效果研究 |
| 一、实验材料和方法 |
| 二、结果 |
| (一) 抗原刺激后小鼠T细胞反应情况 |
| (二) 抗原刺激后小鼠脾淋巴细胞CTL杀伤活力 |
| (三)、抗survivin特异性IgG抗体水平 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 DNA疫苗纯化工艺探索及其纯化机理研究 |
| 一、实验材料和方法 |
| 二、结果和讨论 |
| (一) 盐对RNA分离效果的影响 |
| (二) 盐对大肠杆菌残留基因组DNA分离效果的影响 |
| (三) 盐对超螺旋质粒DNA分离效果的影响 |
| (四) 分析层析 |
| 三、结论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 研究生简历 |
（9）腺病毒介导的基因修饰树突状细胞肝癌瘤苗的制备及其抗HBV相关肝癌的免疫实验的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言和文献回顾 |
| 正文 |
| 1 人HBsAg、AFP基因Adeno-X~(TM)腺病毒表达载体的构建及鉴定 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 方法 |
| 1.5 结果 |
| 1.6 讨论 |
| 1.7 结论 |
| 2 树突状细胞的体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 3 重组腺病毒介导HBsAg和AFP基因修饰树突状细胞体外诱导抗HBV相关肝癌免疫实验的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 结 果 |
| 3.5 讨 论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
四、B7瘤苗与DC瘤苗诱导的抗L615白血病的免疫作用（论文参考文献）
- [1]rhHSP70联合HBxAg负载树突状细胞治疗HBV相关肝癌的实验研究[D]. 王辉. 苏州大学, 2014(11)
- [2]纳米材料在抗肿瘤免疫治疗中的应用研究[D]. 王薇. 北京协和医学院, 2011(11)
- [3]可溶性人PD-1蛋白对肝癌患者树突状细胞功能的影响[D]. 李江斌. 第四军医大学, 2010(06)
- [4]大肠癌患者自体树突状细胞免疫治疗技术临床应用研究[D]. 鲍传庆. 苏州大学, 2010(10)
- [5]增强树突状细胞及其相关exosome抗肝癌免疫效应的实验研究[D]. 吴尘轩. 天津医科大学, 2008(12)
- [6]重组腺病毒介导IL-18和AFP基因修饰的树突状细胞体外诱导抗肝癌免疫治疗的研究[D]. 曹大勇. 第四军医大学, 2008(01)
- [7]异体树突状细胞与骨肉瘤细胞融合瘤苗的制备及其抗骨肉瘤主动免疫效应实验的研究[D]. 于哲. 第四军医大学, 2008(02)
- [8]对白血病化疗药物左旋天冬酰胺酶II的热稳定性改造以及微小残留白血病DNA疫苗的构建、纯化和免疫效果研究[D]. 李亮助. 中国协和医科大学, 2008(07)
- [9]腺病毒介导的基因修饰树突状细胞肝癌瘤苗的制备及其抗HBV相关肝癌的免疫实验的研究[D]. 杨静悦. 第四军医大学, 2007(04)
- [10]树突状细胞融合瘤苗体内外诱导特异性抗白血病免疫的实验研究[J]. 于津浦,李牧,葛薇,马双,尤胜国. 中国实验血液学杂志, 2006(02)