一、小鼠耳蜗神经营养因子-3基因的克隆及其基因工程细胞模型的建立（论文文献综述）
曾友根[1]（2020）在《NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究》文中认为目的:本研究通过观察NSCs和OECs联合移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞神经营养因子,凋亡及抗凋亡蛋白因子表达影响,探讨细胞移植对SNHL损伤耳蜗细胞保护作用的部分机制。方法:（1）细胞培养:选取胎鼠作为移植细胞组织来源,对NSCs和OECs培养、形态观察及鉴定。（2）动物造模:采用庆大霉素对大鼠进行SNHL造模,将筛选出符合要求的大鼠随机分为实验组和对照组,每组10只,实验组予NSCs和OECs联合移植,对照组予输注人工外淋巴液代替细胞移植。（3）细胞移植:将荧光标记的NSCs和OECs通过圆窗植入耳蜗内,术后记录各组大鼠体重变化,检测大鼠ABR听力阈值变化和听觉耳动反射阈值,并采集样本检测。（4）耳蜗切片HE染色。（5）耳蜗免疫荧光染色检测移植后NSCs和OECs荧光标记物。（6）TUNEL法检测凋亡细胞阳性细胞数和MOD值。（7）免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞。（8）Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达影响。结果:（1）细胞培养鉴定结果:NSCs染色鉴定标记物呈nestin阳性,OECs染色鉴定标记物呈p75NTR阳性,培养获得了纯度较高的细胞。（2）听觉耳动反射检测结果:实验组大鼠耳廓反射阈值改善,耳廓抖动变化增强,对照组改变不明显。（3）ABR阈值变化结果:与对照组比较,实验组在1周后ABR阈值变化不明显（P>0.05）,在2周后实验组ABR阈值变化升高（P<0.05）。（4）耳蜗免疫荧光染色结果:实验组移植后NSCs标记分化的细胞部分能表达神经元细胞标志物Nestin,OECs标记分化的细胞分能表部达OECs标志物p75NTR,对照组耳蜗未发现荧光标记的细胞。（5）HE染色结果:对照组见内、外毛细胞变性坏死,SGCs部分坏死,核萎缩,损伤明显,细胞空泡样变性,密度降低,排列疏松混乱不齐,实验组整体病理损伤减低。（6）TUNEL阳性细胞数检测结果:与对照组比较,实验组TUNEL阳性细胞数明显减少（P<0.05）,细胞凋亡指数占比减少,MOD值减少（P<0.05）。（7）免疫组化检测结果:与对照组比较,实验组BDNF和NT-3阳性细胞数及IOD值明显增多（P<0.05）,同时抗凋亡因子Bcl-2阳性细胞数及IOD值升高,促凋亡因子Bax、Caspase-3阳性细胞数及IOD值减少（P<0.05）。（8）Western-blot检测结果:与对照组比较,实验组耳蜗组织样本中BDNF、NT-3,Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低（P<0.05）。结论:（1）NSC联合OEC移植对SNHL大鼠耳蜗具有保护作用,能减轻耳蜗细胞的损伤。（2）NSC联合OEC移植可能通过调节神经营养因子的表达水平而参与了耳蜗细胞的保护过程。（3）NSC联合OEC移植可能通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2,下调凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达路径而参与了对SNHL耳蜗细胞凋亡的保护机制。
桂飞[2]（2019）在《Neuritin对长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节损伤的保护作用》文中指出目的:耳蜗螺旋神经节（spiral ganglion neurons,SGNs）能够将毛细胞接收到的声音信号传递至听觉中枢并产生听力,其数量和功能对于维持正常听功能具有重要意义。受限于有限的再生能力,SGNs损伤后很难自发再生并恢复原有功能,各种神经营养因子在此过程中发挥重要作用。神经突起生长因子Neuritin是一种与神经可塑性密切相关的神经营养因子,本课题组前期研究发现其在促进毛细胞转分化再生方面具有重要作用,并可保护神经纤维免于毛细胞缺失所致的继发性损伤,说明其在维持SGNs存活及功能方面具有潜在重要作用。基于上述研究基础,本研究旨在利用长爪沙鼠筛选并建立耳蜗螺旋神经节特异性损伤所致的感音神经性耳聋模型,探究其在保护受损耳蜗SGNs,修复受损听神经功能中的作用,为SGNs缺失导致的感音神经性耳聋的防治提供新的研究策略和科学依据。方法:1、取不同发育时期的耳蜗组织,用qPCR和WB方法,从分子水平检测Neuritin的表达变化;冰冻切片后,用免疫荧光法,检测Neuritin的表达定位,明确Neuritin在长爪沙鼠耳蜗发育各阶段的表达变化。2、选择3种耳毒性药物（卡那霉素和呋塞米联用、新霉素、哇巴因）造模,通过ABR检测和组织形态学分析,筛选并鉴定出长爪沙鼠耳蜗SGNs特异性损伤的耳聋模型,并探究耳聋发生发展过程中Neuritin的表达变化,明确其表达与该耳聋模型的相关性。3、组织水平,建立乳鼠Corti组织的体外培养体系,使用哇巴因损伤SGNs的同时加入不同浓度的Neuritin蛋白,探究其对受损耳蜗SGNs的保护作用。动物水平,利用方法2中确定的损伤模型,经圆窗滴注不同剂量的Neuritin蛋白,通过ABR检测和组织水平分析,综合评价Neuritin对受损听功能的修复效果。结果:1、检测发现,Neuritin在长爪沙鼠耳蜗不同发育阶段均有表达,胚胎期第20天（E20）表达量较低,出生后1-56天（P1-56）表达持续升高;其表达主要分布于SGNs和Corti器区域。2、不同药物建模结果显示,仅低浓度哇巴因（1mM）可引起耳蜗SGNs特异性缺失,且伴听力阈值显着上升,最终选定此条件进行损伤模型的建立;进一步研究发现,损伤后耳蜗中Neuritin表达下调,表明Neuritin的表达与该模型具有相关性,且呈负相关。3、体外研究显示,Neuritin（16μg/mL）组和Neuritin（32μg/mL）组每100μm2 SGNs的数量分别为13.2±1.2和16±2.6,显着高于损伤组的7.3±2.2;每100μm神经纤维的数量分别为8.2±1.1和11.6±1.5,也显着高于损伤组的4.6±1.1,且排列更为整齐;各组毛细胞均不受影响。动物水平结果显示,在哇巴因损伤的同时经圆窗滴注Neuritin蛋白可促进部分听功能的恢复,表现为Neuritin（16μg）组高频区16kHz和32kHz听力阈值分别为32.5±8.9dB,61.3±3.5 dB,显着低于损伤组的48.3±16.0 dB,85±5.5 dB;Neuritin（32μg）组高频区8kHz、16kHz和32kHz听力阈值分别为25±10.7 dB,31.3±9.9 dB,55±5.3dB,均显着低于损伤组。组织形态学检测显示,Neuritin处理组中耳蜗中底回螺旋神经节细胞及神经纤维的数量较损伤组显着增多,与功能检测的结果一致。结论:1、Neuritin在长爪沙鼠耳蜗发育过程中均有表达,尤其在幼年至成年阶段,且主要表达在耳蜗SGNs及Corti区域;2、低浓度哇巴因（1mM）诱导的长爪沙鼠耳蜗SGNs特异性缺失模型,为本研究选定的最佳动物模型,在该模型中Neuritin的表达与SGNs的损伤呈负相关关系;3、体外和体内研究表明,Neuritin剂量依赖性地维持了受损长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节细胞及神经纤维的数量及排列,有效促进了高频损伤区域的听功能恢复。
李海明[3]（2019）在《丙戊酸联合NT-3基因修饰的嗅鞘细胞移植对脑损伤神经细胞的修复作用》文中研究指明背景创伤性颅脑损伤（TBI）有着较高的致死率和致残率,对人类的生命健康有着较大的威胁。中枢神经系统损伤后神经元再生能力较差。嗅鞘细胞（OECs）是一种具备持久分裂能力的细胞,可分泌多种神经营养因子,其中神经营养因子3（NT-3）具备促进神经元发育,维持神经细胞存活以及促进受损的神经元再生的功能。丙戊酸（VPA）能减轻神经细胞损伤,改善TBI大鼠神经功能的恢复。目的本实验运用慢病毒载体将NT-3基因转染入OECs内进行表达,探讨NT-3基因转染OECs的可能性及OECs-NT-3分泌的NT-3的生物学活性;通过构建的基因工程细胞OECs-NT-3联合应用VPA对TBI大鼠进行干预,探讨其对颅脑损伤的神经保护作用与机理,为TBI的临床干预提供动物实验研究资料。方法1.OECs的原代培养及鉴定:取妊娠约14 d的雌性SD大鼠,麻醉后,取出胎鼠,分离嗅球,进行OECs原代培养,应用差速贴壁法纯化OECs。运用免疫荧光技术鉴定OECs。2.OECs-NT-3基因工程细胞的制备:用包装有NT-3基因的病毒液感染OECs,同时建立对照（设未转染组、空载体转染组）,应用荧光显微镜分析转入基因的表达情况。同时收集各组4 d、8 d、12 d、16 d、20 d、24 d、28 d的细胞上清,运用ELISA技术检测各组不同时间点上清中NT-3的含量。3.实验分组及处理:将50只健康雄性SD大鼠按随机数字法分为5组:假手术组、TBI模型组、OECs治疗组、OECs-NT-3治疗组、VPA联合OECs-NT-3治疗组,每组10只。除假手术组外,其余4组分别于脑损伤灶深入3 mm处注入生理盐水、OECs细胞悬液、OECs-NT-3细胞悬液、OECs-NT-3细胞悬液,VPA联合OECs-NT-3治疗组给予VPA腹腔注射,其余各组予等量生理盐水。4.相应干预后1、7、14、21、28 d进行大鼠神经系统疾病严重程度（NSS）评分;应用HE染色、嗜银染色对脑组织进行形态学观察;运用NF免疫组化观察神经细胞轴突排列情况;运用P75、GFAP免疫组化染色检测OECs的存活状态;应用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）对大鼠神经细胞凋亡状况进行观察。结果1.在细胞培养第10 d,进行OECs免疫荧光鉴定,观察OECs形态。计算OECs的纯度为（92.030±2.168）%。2.于转染后第4 d,对转染细胞进行免疫荧光观察。结果显示MOI值为20时转染效果最佳;计算慢病毒对OECs感染率为（70.686±10.291）%。3.ELISA结果显示:转基因组上清液中NT-3含量显着高于未转染组与空载体组,该结果可持续到转染后28 d。转基因组NT-3浓度在8 d左右达到峰值。4.术后21 d和28 d,OECs-NT-3治疗组较模型组和OECs治疗组NSS评分显着降低（P<0.05）,VPA联合OECs-NT-3治疗组较OECs-NT-3治疗组显着降低（P<0.05）。5.VPA联合OECs-NT-3治疗组皮质区细胞排列较其他各组规整,可见更多细胞核膜较完整、细胞核仁较清晰的神经细胞。VPA联合OECs-NT-3治疗组NF免疫组化阳性轴索排列更为整齐,均优于OECs治疗组,OECs-NT-3治疗组。6.OECs治疗组、OECs-NT3治疗组、VPA+OECs-NT-3联合治疗组均可见P75、GFAP染色阳性结果,提示移植的OECs可以在SD大鼠体内存活。7.嗜银染色可见神经元轴突及神经纤维呈黑色,OECs-NT-3治疗组和VPA+OECs-NT-3联合治疗组情况优于单纯OECs治疗组。对正常结构的神经纤维计数并与大鼠NSS评分进行相关性分析,结果显示神经纤维数与NSS评分呈负相关（r=-0.904）。且两者的相关性具有统计学意义（P<0.05）,说明正常形态的神经纤维数目越多,其相应的神经功能恢复状况也越好。8.TUNEL法检测各组大鼠脑组织内神经细胞的凋亡情况:OECs-NT-3治疗组、VPA+OECs-NT-3联合治疗组与单纯的OECs治疗组比较,凋亡细胞明显减少（P<0.05）;VPA+OECs-NT-3联合治疗组与OECs-NT-3治疗组比较大鼠脑组织内细胞凋亡较少（P<0.05）。结论1.OECs的原代培养可通过差速贴壁法进行纯化,且纯化后OECs的纯度可达到进一步的实验要求。2.通过慢病毒载体可以成功将NT-3基因导入OECs,并在OECs内稳定表达NT-3。3.VPA联合NT-3基因修饰的OECs移植能有效改善TBI大鼠的预后。
曾华沙[4]（2018）在《利用CRISPR/Cas9技术建立OSBPL2基因敲除耳聋巴马小型猪模型》文中研究表明背景:耳聋是一种常见的感知性障碍疾病。据统计,全世界3.6亿人受到不同程度耳聋的困扰,约1/1000的新生儿为耳聋患儿,遗传性耳聋占一半以上。其中,非综合征型耳聋（NSHL）约占遗传性耳聋的70%。在本课题组的前期研究中,首次在一个中国遗传性耳聋大家系中定位和克隆了一个新的常染色体显性NSHL（DFNA67）相关致病基因OSBPL2,其编码的氧化固醇结合蛋白样蛋白2（oxysterol binding protein like-2 protein）与氧化固醇结合蛋白（Oxysterol binding protein,OSBP）具有较高同源性,属于OSBP相关蛋白（OSBP-related proteins,ORPs）家族成员。ORP家族是一类与氧化固醇具有高度亲和力的受体蛋白,在细胞内的脂质合成、转运及信号转导过程中发挥重要作用。本研究将利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建OSBPL2突变的耳聋巴马小型猪模型,进一步探索OSBPL2突变的致聋机制。目的:采用CRISPR/Cas9技术建立猪胎儿成纤维细胞（PFFs）OSBPL2敲除的细胞系;以OSBPL2敲除的PFFs细胞系作为体细胞核移植的供体,采用体细胞核移植和胚胎移植技术构建OSBPL2基因缺陷的巴马小型猪模型;在模型动物水平验证基因型与表型的相关性,探讨OSBPL2功能缺陷以及合并高脂饮食干预的条件下血脂参数、听力学和内耳形态学的变化规律。方法:（1）人和猪的OSBPL2基因的生物信息学分析:比对人和猪的OSBPL2基因的序列,采用生物信息学方法对猪与人的OSBPL2基因进行共线性和同源性分析;采用Chou-Fasman算法和Swiss Model在线工具预测并分析人与猪OSBPL2蛋白的二级结构和三级结构。（2）OSBPL2敲除PFFs细胞系的构建:设计合成靶向猪OSBPL2基因第5、6外显子的单导向RNA（single guide RNA,sg RNA）,构建CRISPR/Cas9打靶质粒,将重组质粒与具有Neo抗性基因的p CMVtd-Tomato质粒共转染入巴马猪胎儿原代PFFs中,使用遗传霉素G418筛选,获得单克隆细胞,以单克隆细胞的基因组为模板,PCR扩增后进行TA克隆,测序验证单克隆细胞的基因型,筛选OSBPL2双等位基因敲除的单克隆细胞系。（3）OSBPL2敲除的巴马小型猪模型的构建:采用体细胞核移植和胚胎移植技术,获得OSBPL2缺陷的巴马猪小型模型,提取小猪耳组织的基因组DNA,PCR扩增后进行TA克隆后测序,鉴定OSBPL2敲除巴马小型猪的基因型,Western blotting检测巴马小型猪组织中OSBPL2蛋白的表达,免疫组化对OSBPL2在巴马小型猪耳蜗组织中的表达进行定位。（4）听力学与内耳形态学分析:听性脑干反应（ABR）定期检测猪的听力阈值变化;耳蜗组织经石蜡包埋、切片,采用HE染色观察耳蜗形态学变化。（5）血脂生化分析:对基因敲除的巴马猪断奶,另购买5头相同月龄野生型巴马猪,正常饲料喂养一月后分敲除组（KO-C:4头）、敲除-高脂组（KO-H:4头）和野生型高脂组（WT-H:5头）,分别圈养。定期检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）水平,同时观察主动脉和冠状动脉的动脉粥样硬化斑块的形成。结果:（1）猪与人的OSBPL2基因及其侧翼序列存在高度共线性,二者氨基酸序列一致性达88%,蛋白同源性较高。且两者蛋白二级结构具有近似等量的α螺旋,β折叠以及β转角结构,蛋白三维建模结构相似度高,均含有严格保守的OSBP指纹特征基序“EQVSHHPP”。（2）根据猪的OSBPL2基因序列,设计合成针对OSBPL2第5、6外显子的两对sg RNAs,构建两个打靶质粒,转染巴马猪原代PFFs细胞。经T7EN1酶系统鉴定,剪切效率分别为11.4%（第5外显子）和0%（第6外显子）,用靶向第5外显子的质粒筛选冻存的细胞克隆35个,最终鉴定获得双等位基因突变的细胞克隆19个,基因突变效率为54.29%。（3）采用体细胞核移植和胚胎移植技术,共移植受体猪8头（8月龄长白猪）,怀孕3头。其中一头在怀孕37天时,剖出37天大的胎猪14只,制备原代PFFs细胞,鉴定其基因型全部为OSBPL2双等位基因敲除;另两头怀孕足月,分别自然生产4头与6头小猪（其中一头四肢与口唇畸形,当天处死取材）,鉴定基因型均为双等位基因敲除,且与相应供体的细胞基因型相符;Western blotting检测显示,克隆小猪的脑、肾组织未检测到OSBPL2蛋白的表达。OSBPL2在巴马小型猪的耳蜗中主要表达定位在螺旋神经节、血管纹和基底膜中。（4）出生的克隆猪在断奶一月后定期进行听力学检测。与同月龄的野生型巴马小型猪的听力阈值（4060 d B SPL）相比,KO-C组与KO-H组小猪均呈现渐进性的听力损失,且KO-H组的听力下降尤为明显（4月龄时,听力阈值均在100 d B SPL以上,表现为重度耳聋）。耳蜗HE染色未发现明显的内耳组织形态学改变。（5）KO-C组与KO-H组的小猪均出现肥胖表型,且血脂参数异常,特别是KO-H组的TC和LDL升高明显;苏丹染色显示KO-H组的胸主动脉和腹主动脉可见明显的斑块,而WT-H组和KO-C组的相应动脉未见明显病变。结论:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建得OSBPL2基因敲除的巴马小猪模型,并表现出血脂参数异常和听力损失双重表型。且高脂饮食干预加速耳聋表型的发生。本研究为进一步探索OSBPL2的功能及其突变致病效应奠定了良好基础,为脂代谢紊乱与听力损失的相关性提供了实验证据,并为遗传性耳聋的预防与诊疗奠定了理论基础。
周萍,张晓彤[5]（2012）在《神经营养因子-3治疗感音神经性聋》文中认为感音神经性聋的治疗一直是耳科研究的重要课题,也是一大难题,原因之一就是耳蜗毛细胞损伤常伴有螺旋神经元（spiral ganglion neurons,SGNs）的继发性、渐进性变性及坏死。近年来大量实验证明神经营养因子-3（neurotropin-3,NT-3）对螺旋神经元的保护至关重要。本文就NT-3治疗感音神经性聋的研究进展进行综述。
陈观贵,谢鼎华,刘谦虚,谭志强[6]（2010）在《脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞在药物致聋豚鼠内耳的表达及保护作用》文中认为目的探讨脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）基因修饰的骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）在药物致聋豚鼠内耳的表达及对螺旋神经节细胞（spiral ganglion cell,SGC）的保护作用。方法阿米卡星致聋的豚鼠随机数字表法分为两组,治疗组经鼓阶开窗注射BDNF基因修饰的MSC,对照组注射外淋巴液。各组分别在术后7 d及28 d处死动物,荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测耳蜗组织中BDNF mRNA的表达,耳蜗切片计算SGC细胞密度,末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法（terminal deoxynucleotidyltransferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）检测SGC凋亡情况。结果治疗组在术后7 d和28 d的BDNF mRNA相对表达量均明显高于对照组,差异具有统计学意义（P值均<0.01）。治疗组术后7 d及28 d的SGC密度均高于对照组,并且治疗组术后7 d及28 d的SGC凋亡指数也比对照组明显下降,差异具有统计学意义（P值均<0.01）。结论 BDNF基因修饰的MSC在致聋豚鼠内耳中的表达时间超过28 d,对SGC具有保护作用。
李群真[7]（2009）在《补肾活血通窍中药复方对庆大霉素致聋小鼠耳蜗内NT-3表达的影响》文中研究说明研究目的:观察补肾活血通窍中药复方对庆大霉素（Gentamicin,GM）致聋小鼠听觉脑干诱发电位（ABR）阈值及耳蜗内神经营养因子-3（Neurotrophic Factor 3,NT-3）表达的影响。研究方法:补肾活血通窍中药复方（处方组成:熟地,骨碎补,淫羊藿,黄芪,当归,丹参,川芎,石菖蒲,水蛭,磁石等）煎制为高、中、低三个浓度的汤剂,含生药量分别为2.375g/ml、0.475g/ml、0.095g/ml（按小鼠体重25g,每天灌胃量0.8ml计算,中浓度汤剂相当于70kg成人临床1日常规量的等效量,高浓度汤剂及低浓度汤剂分别相当于中浓度汤剂给药量的5倍及0.2倍剂量）。将40只昆明小鼠随机分为5组,每组8只,A、B、C、D组:补肾活血通窍中药复方高、中、低浓度干预组及生理盐水干预组,每天腹腔注射GM,100mg/kg,连续15天,自腹腔注射GM第一天起分别灌服不同浓度中药复方汤剂和等量生理盐水,连续20天;E组:空白对照组,正常喂养,不做任何处理。灌胃结束后测定各组小鼠听觉脑干诱发电位（ABR）阈值,耳蜗组织采用蛋白免疫印迹（Western Blot）方法检测各组小鼠耳蜗组织中NT-3蛋白的表达。研究结果:高浓度及中浓度补肾活血通窍中药复方可显着抑制GM所致的耳蜗组织内NT-3蛋白含量降低,拮抗GM所致小鼠之听阈升高（P＜0.01）。研究结论:补肾活血通窍中药复方可有效减轻GM对小鼠的耳毒性,部分机制与其改善内耳微循环、提高受损耳蜗内NT-3蛋白的水平进而保护耳蜗毛细胞和神经元有关。通过本实验我们看到了补肾活血通窍中药复方可以拮抗GM所至耳蜗内NT-3蛋白的减少,而起到保护听力的作用,推测可能通过以下几个途径:①通过拮抗GM对毛细胞的损害,保存其正常分泌NT-3的功能;②中药某些成分能透过耳蜗血迷路屏障（blood labyrinth barrier,BLB）进入耳蜗内,调节神经与内分泌,增强NT-3的自分泌和旁分泌功能,并促进其与SGNs表面受体结合,维持神经细胞的正常传递功能。研究表明在耳蜗生理或受损状态时上下级听神经元均可以互为靶器官,NT-3亦可能通过上级神经元逆向传输至SGNs;③中药复方是从整体论治出发,重在整体调节,耳蜗内NT-3蛋白含量增多可能只是对全身调节的一个局部表现,而NT-3是一种小分子蛋白（分子量:14kd）,可以透过耳蜗BLB及血脑屏障,其亦可能通过提高机体内NT-3的整体水平,经血液循环或脑脊液途径到达耳蜗内。笔者认为补肾活血通窍中药复方拮抗GM耳毒性反应的机理,除了改善全身及耳蜗血液循环、清除自由基和促进能量代谢及蛋白质合成,更重要的是多种中药复方制剂可以通过以上三种途径提高耳蜗内NT-3蛋白的含量,从而起到保护毛细胞及听觉神经元和听神经纤维的作用,以减轻听力损害。
陈观贵[8]（2009）在《BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞的表达及对豚鼠螺旋神经元保护作用》文中研究表明第一章BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞的建立及体外表达目的骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）易于分离扩增,具备多方向分化潜能,免疫源性低,可自体移植,并且有良好迁移性,暗示其在基因治疗中可能成为有价值的运载细胞。本章利用非病毒载体介导脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）转染MSCs,观察细胞转染特性和体外表达情况,建立基因工程细胞,为进一步体内研究提供基因工程细胞来源。方法取豚鼠的骨髓进行MSCs的分离、培养和流式细胞仪鉴定。通过比较两种非病毒载体转染方法（脂质体法和电穿孔法）,选择较好的方法介导pcDNA3.1（-）-BDNF转染MSCs并经优化浓度的G418筛选建立基因工程细胞,转染后48小时（瞬时表达）和筛选后（稳定表达）用免疫组化检测BDNF基因表达情况,RT-PCR进一步验证目的基因表达情况。结果成功培养MSCs,流式细胞鉴定显示各细胞表面标志表达率分别为CD44:94.65%、CD34:4.37%、CD45:7.81%。免疫组化显示脂质体介导转染的BDNF瞬时表达率约为5.80%,电穿孔法瞬时表达阳性率约为24.29%。脂质体法转染筛选14天后细胞几乎全部死亡;电穿孔法转染成功扩大培养并建立工程细胞（BDNF-MSCs）,免疫组化显示BDNF阳性表达率达90%,RT-PCR扩增产物电泳证实目的基因阳性条带。结论用电穿孔法成功建立BDNF基因修饰MSCs的工程细胞,并用免疫组化和RT-PCR方法证实了工程细胞具备体外表达目的基因功能。第二章BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞正常豚鼠内耳移植的实验研究目的BDNF基因修饰MSCs（BDNF-MSCs）是治疗神经退变性疾病包括感音神经性聋的潜在有效方法,但首先要明确以下三个问题:一是手术及细胞移植对耳蜗功能及结构是否造成不良影响;二是基因修饰的MSCs在耳蜗内存活和分布情况如何;最后是移植细胞在耳蜗内是否能较长时间维持表达目的基因的能力。目前还没有转基因MSCs内耳移植的报道,在此部分我们将在正常豚鼠耳蜗中对这些问题进行初步的探讨。方法正常豚鼠分3组,组Ⅰ:为空白对照组,组Ⅱ:经鼓阶开窗注射MSCs,组Ⅲ:经鼓阶开窗注射BDNF-MSCs。移植细胞均经DAPI荧光标记。3个组的动物均在术前1d、术后7d及术后28d分别行ABR检测,比较各组术前、术后的ABR阈值变化;分别取术后7d及28d各组动物的耳蜗石蜡切片HE染色观察耳蜗结构;荧光显微镜观察移植细胞存活及分布;免疫组化方法检测BDNF在耳蜗内的表达情况。结果经鼓阶开窗移植细胞导致术后7d时ABR阈值的暂时性提高,术后28d后恢复至正常水平。耳蜗石蜡切片HE染色显示实验动物耳蜗内结构无明显异常改变。组Ⅱ和组Ⅲ术后7d耳蜗切片可见荧光信号多分布于耳蜗底周的外淋巴腔（鼓阶和前庭阶）,极少量细胞能迁移到中阶及蜗轴,术后28d移植细胞存活数量有所下降,但两组动物的移植细胞存活时间均超过28d,并且BDNF基因修饰MSCs能提高移植细胞术后28d时的存活率。免疫组化显示组Ⅲ部分移植细胞表达BDNF,术后28d的阳性表达率比术后7d有显着性下降,而其余两组无阳性染色。结论经鼓阶开窗移植MSCs对听力的损害是轻微（<10dB SPL）和暂时的（<28d）。移植后光镜下耳蜗形态结构没有明显变化。移植细胞能存活并分布于耳蜗内各周,主要在耳蜗底周的外淋巴腔,BDNF基因转染MSCs后可以提高移植细胞的存活率。基因修饰的MSCs能在正常耳蜗内维持表达BDNF至少28d,暗示了MSCs可用作细胞载体向内耳输送BDNF治疗感音神经性聋。第三章BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞在致聋豚鼠内耳的表达及对螺旋神经元的保护作用目的多种因素包括神经营养因子减少、噪音、缺血、耳毒性药物等均会导致内耳毛细胞和螺旋神经元（spiral ganglion neurons,SGNs）的直接或间接的死亡,细胞死亡主要以凋亡的形式。在前面已证明BDNF基因修饰MSCs具备体外及正常耳蜗内表达BDNF的能力,并可以在内耳中存活至少28d,本章中将进一步分析工程细胞在药物致聋豚鼠内耳的表达水平（荧光定量RT-PCR）及对SGNs的保护作用。方法阿米卡星致聋的豚鼠随机分两组。实验组经鼓阶开窗注射BDNF-MSCs,对照组注射外淋巴液。每组均在7d及28d处死动物。荧光定量RT-PCR检测两组动物不同时间点的耳蜗组织BDNF的表达差异,并取耳蜗组织切片行TUNEL检测SGNs凋亡。结果实验组在术后7d和28d的BDNF表达量均显着性高于对照组,实验组术后7d的BDNF表达量是对照组的107倍,术后28d下降为33倍。实验组术后7d及28d的耳蜗SGNs凋亡指数均比对照组有显着性下降。结论药物致聋豚鼠内耳移植的BDNF基因工程细胞能维持表达长达28d,并能显着减少SGNs的凋亡。
杨阳[9]（2008）在《MnSOD基因转染对拟老化大鼠内耳的干预性保护》文中进行了进一步梳理第一部分病毒与非病毒载体转导大鼠耳蜗组织细胞的研究目的通过病毒与非病毒载体对胎鼠耳边缘细胞和耳蜗组织转染情况的研究,选择出合适的内耳基因治疗载体。方法分别用质粒（pEGFP-N1）、腺病毒（rAd5-EGFP）以及腺相关病毒（rAAV2- EGFP）载体转导原代培养的新生Wistar大鼠（≤72小时）耳边缘细胞或经圆窗膜将病毒液注入鼓阶外淋巴液,通过激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、CCK-8、免疫组化（SP法）、免疫组化（ApopTag过氧化物酶凋亡检测）、Westernblot及ABR检测方法对三种载体加以比较。结果三种载体对原代培养的大鼠耳边缘细胞的转染研究发现,腺病毒的转染效率最高,而腺相关病毒转染对细胞活性影响最小。rAAV2和rAd5对大鼠耳蜗组织的感染实验发现,腺病毒和腺相关病毒携带的增强型绿色荧光蛋白可在多种耳蜗组织中及转染对侧耳蜗组织表达,且并不引起明显的耳蜗组织细胞凋亡。rAAV2携带的EGFP基因在第90天时仍可检测到大量表达。rAd5携带的EGFP基因在第30天时表达明显减弱。结论病毒载体相对于非病毒载体以其高的转导效率、低细胞毒性在对原代培养的胎鼠耳边缘细胞的转导中表现出明显优势。在病毒载体对大鼠耳蜗组织感染研究方面,腺病毒载体的优势在于其携带的基因表达迅速而高效,而腺相关病毒载体则以其长表达时程,低组织毒性见长。第二部分重组病毒rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD的构建及其表达目的构建含有大鼠源性锰超氧化物歧化酶（Manganese superoxide dismutase, MnSOD）基因的重组病毒rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD,并检测其在大鼠耳血管纹边缘细胞和耳蜗组织内的表达。方法将大鼠心肌组织来源的SOD基因克隆入融合表达载体pEGFP-N1中,再以限制性酶切方法克隆入真核表达载体pSNAV2.0-IRES-EGFP中,最后将其包装为rAAV2- IRES-EGFP/MnSOD病毒颗粒,用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、PCR及Westernblot检测MnSOD基因的表达。结果真核表达载体pEGFP-N1/MnSOD和pSNAV2.0-IRES-EGFP/MnSOD经酶切、PCR和测序鉴定均检测到MnSOD基因的完整序列,被rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD感染的耳边缘细胞和内耳组织中MnSOD蛋白的表达均高于空白对照耳。结论成功构建了大鼠源性MnSOD基因重组病毒rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD,并使其在大鼠耳边缘细胞和大鼠耳蜗组织中成功表达,为抗氧化基因治疗内耳疾病的研究奠定了基础。第三部分MnSOD基因转染对拟老化大鼠内耳的干预性保护目的探讨锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase, MnSOD）基因内耳注射对氨基糖甙类抗生素造成的拟老化大鼠内耳损伤的干预性保护作用。方法在半乳糖注射的第6周（注射氨基糖甙类抗生素之前2周）将rAAV2-IRES- EGFP/MnSOD病毒液经圆窗膜注入拟老化大鼠的耳蜗外淋巴,通过免疫组化（ApopTag过氧化物酶凋亡检测）、Westernblot及MnSOD活性检测的方法观察MnSOD基因在对抗内耳氧化应激损伤中的干预性保护作用。结果MnSOD基因的干预性注射,感染有效地减少了氧化应激引起的拟老化大鼠内耳细胞凋亡,有效地提升了内耳中MnSOD的活性,并在一定程度上缓解了氨基糖甙类抗生素造成的拟老化大鼠的听力损失。结论外源性MnSOD基因在内耳过表达能部分对抗氨基糖甙类抗生素对拟老化大鼠内耳的损伤。
麻晓峰,陈杰,徐琳,顾香芳,高下[10]（2007）在《人淋巴细胞-NT3基因工程细胞的建立及鉴定》文中提出目的建立能够存活较长时间并稳定表达神经营养素-3（neurotrophin-3,NT3）的人淋巴细胞株,为后续的动物和人体耳蜗内基因转染实验奠定基础。方法从正常人全血中通过Ficoll液提取人淋巴细胞,并在其完全血清培养基中加入白细胞介素-2（IL-2）使其良好生长。通过RT-PCR得到人胎肝组织的NT3cDNA,以T4DNA连接酶和真核表达载体pIRES-DsRed2相连接。以阳离子脂质体作为载体,将pIRES-DsRed2-NT3转染人淋巴细胞,进行RT-PCR及Western Blot分析鉴定。结果建立了一种能使体外培养淋巴细胞成活时间延长的新方法,成功转染NT3基因至淋巴细胞中,并能继续存活相对较长时间,Western Blot证明细胞上清液中有NT3,构建了稳定表达NT3的人基因工程淋巴细胞。结论构建重组质粒pIRES-DsRed2-NT3,利用淋巴细胞作为中介宿主,进而表达、分泌NT3,为进一步NT3基因转染致聋动物耳蜗实验奠定了基础,并有可能为人体基因转染治疗耳聋找到很好的中介细胞。
二、小鼠耳蜗神经营养因子-3基因的克隆及其基因工程细胞模型的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠耳蜗神经营养因子-3基因的克隆及其基因工程细胞模型的建立（论文提纲范文）
（1）NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要操作仪器 |
| 2.1.4 主要溶剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织来源、细胞提取和培养 |
| 2.2.2 NSCs的传代培养 |
| 2.2.3 OECs培养 |
| 2.2.4 NSCs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.5 OECs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.6 细胞活力测定 |
| 2.2.7 细胞冻存 |
| 2.2.8 细胞复苏 |
| 2.3 动物实验及样本检测 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 主要试剂 |
| 2.3.3 主要仪器 |
| 2.3.4 主要试剂配制 |
| 2.3.5 庆大霉素耳毒性大鼠模型的建立方法 |
| 2.3.6 实验动物分组及给药 |
| 2.3.7 ABR检测大鼠听力阈值 |
| 2.3.8 听觉耳动反射检测 |
| 2.3.9 制作切片 |
| 2.3.10 切片染色 |
| 2.3.11 耳蜗免疫荧光染色 |
| 2.3.12 TUNEL法(原位切口末端标记法)检测凋亡细胞 |
| 2.3.13 免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞 |
| 2.3.14 Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达 |
| 2.4 统计方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 细胞的形态观察及鉴定 |
| 3.1.1 NSCs的培养观察及鉴定 |
| 3.1.2 OECs的培养观察和鉴定 |
| 3.2 各组大鼠体重变化结果 |
| 3.3 大鼠听觉耳动反射检测阈值结果 |
| 3.4 各组大鼠ABR阈值变化结果 |
| 3.5 HE染色结果 |
| 3.6 耳蜗免疫荧光染色观察结果 |
| 3.6.1 耳蜗荧光标记NSC结果 |
| 3.6.2 荧光标记OEC观察结果 |
| 3.7 TUNEL法检测凋亡细胞结果 |
| 3.7.1 各组TUNEL阳性细胞数比较 |
| 3.7.2 各组MOD值比较 |
| 3.8 免疫组化检测结果 |
| 3.9 Western-blot检测各组蛋白表达水平结果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 实验性感音神经性耳聋动物模型的制备与机制探究 |
| 4.2 神经营养因子减轻SNHL内耳神经损伤后相关机制 |
| 4.2.1 BDNF对 SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.2.2 NT-3对SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.3 细胞移植抑制耳蜗损伤细胞凋亡机制探索 |
| 4.3.1 Caspase结构、功能与促耳蜗细胞凋亡机制探究 |
| 4.3.2 Bcl-2 结构、功能和抗耳蜗细胞凋亡机制探析 |
| 4.3.3 细胞联合移植激活Bcl-2,抑制Caspase、Bax表达路径保护损伤耳蜗细胞探究 |
| 4.4 细胞联合移植上调神经营养因子,抑制细胞凋亡 |
| 4.5 神经性耳聋常见病因概述 |
| 4.6 神经性耳聋治疗方法概述 |
| 4.7 关于NSC和 OEC的取材、培养与鉴定探究 |
| 4.7.1 NSC的组织取材和分离 |
| 4.7.2 NSC的培养和鉴定方法选择 |
| 4.7.3 OECs的组织取材和分离 |
| 4.7.4 OECs的培养与鉴定选择 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（2）Neuritin对长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究的目的及意义 |
| 1.2 国内外研究的现状 |
| 1.3 研究的主要内容 |
| 1.4 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂耗材 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 引物的设计 |
| 2.4.2 耳蜗样本的制备 |
| 2.4.3 蛋白质免疫印迹(Western Blot) |
| 2.4.4 荧光定量PCR检测 |
| 2.4.5 耳蜗冰冻切片的制备 |
| 2.4.6 Neuritin在不同发育阶段长爪沙鼠耳蜗中表达免疫组织化学染色检测 |
| 2.4.7 听性脑干反应(ABR)检测 |
| 2.4.8 感音神经性耳聋的建立 |
| 2.4.9 给予外源性Neuritin干预处理方法 |
| 2.4.10 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组人神经突起神经生长因子在不同发育阶段长爪沙鼠耳蜗中的表达 |
| 3.1.1 Neuritin在长爪沙鼠耳蜗不同发育阶段中的表达 |
| 3.1.2 Neuritin在成年长爪沙鼠耳蜗中免疫荧光染色定位 |
| 3.2 神经性耳聋动物模型的建立及重组人神经突起生长因子在耳聋发展过程中的表达变化 |
| 3.2.1 长爪沙鼠的正常听功能检测 |
| 3.2.2 卡那霉素和呋塞米联用全身给药造模后鉴定结果 |
| 3.2.3 新霉素经圆窗局部给药造模后鉴定结果 |
| 3.2.4 哇巴因经圆窗局部给药造模后鉴定结果 |
| 3.2.5 哇巴因损伤后长爪沙鼠耳蜗Neurtin的表达变化 |
| 3.3 重组人Neuritin对长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节细胞损伤保护作用的研究 |
| 3.3.1 重组人Neuritin对受损耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用(体外) |
| 3.3.2 重组人Neuritin对受损耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用(体内) |
| 4 讨论 |
| 4.1 神经营养因子的表达变化 |
| 4.2 特异性SGNs受损的神经性耳聋模型的建立及鉴定 |
| 4.3 Neuritin与哇巴因引起神经性耳聋的相关性 |
| 4.4 重组人Neuritin蛋白量效关系的确立 |
| 4.5 神经营养因子对耳蜗螺旋神经节的保护作用 |
| 4.6 重组人Neuritin对听功能保护作用的探讨 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（3）丙戊酸联合NT-3基因修饰的嗅鞘细胞移植对脑损伤神经细胞的修复作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 研究材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:细胞移植在中枢神经修复中的应用研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）利用CRISPR/Cas9技术建立OSBPL2基因敲除耳聋巴马小型猪模型（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验仪器与材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.4 实验试剂配制 |
| 2 实验方法与步骤 |
| 2.1 人/猪OSBPL2生物信息学分析 |
| 2.2 OSBPL2敲除巴马小型猪成纤维细胞系的建立 |
| 2.3 OSBPL2敲除巴马小型猪模型建立 |
| 2.4 OSBPL2敲除巴马小型猪表型检测 |
| 结果 |
| 1 人/猪OSBPL2生物信息学分析 |
| 1.1 人/猪OSBPL2基因同线性及氨基酸同源性分析 |
| 1.2 人/猪OSBPL2蛋白二级与三级结构分析 |
| 2 OSBPL2 敲除PFFS单克隆细胞系的构建 |
| 2.1 猪OSBPL2基因敲除靶点序列的验证 |
| 2.2 CRISPR/Cas9 针对猪OSBPL2 基因打靶质粒的构建 |
| 2.3 OSBPL2 敲除巴马小型猪PFFs的筛选及基因型鉴定 |
| 3 OSBPL2敲除巴马小型猪模型建立 |
| 3.1 OSBPL2敲除巴马小型猪基因型鉴定 |
| 3.2 OSBPL2的组织学表达水平检测 |
| 4 OSBPL2敲除巴马小型猪表型检测 |
| 4.1 听力学检测 |
| 4.2 耳蜗组织的形态学分析 |
| 4.3 血脂参数统计 |
| 4.4 动脉血管苏丹Ⅲ染色 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（7）补肾活血通窍中药复方对庆大霉素致聋小鼠耳蜗内NT-3表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 材料与试剂 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 主要药品与试剂 |
| 1.3 主要仪器及器械 |
| 第二章 实验方法 |
| 2.1 实验分组及给药方法 |
| 2.2 腹腔注射及灌胃 |
| 2.3 听觉脑干诱发电位 |
| 2.4 解剖耳蜗 |
| 2.5 NT-3 Western Blot |
| 2.6 统计学处理 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 小鼠体重变化和耳廓反应变化 |
| 3.2 听觉脑干诱发电位阈值 |
| 3.3 NT-3 Western Blot灰度值 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 NT-3相关研究 |
| 4.2 复方组成及作用机理 |
| 4.3 现代药理研究 |
| 4.4 中药复方作用途径 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 附图 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞的表达及对豚鼠螺旋神经元保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞的建立及体外表达 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞正常豚鼠内耳移植的实验研究 |
| 2.1 材料及方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 BENF基因修饰骨髓间充质干细胞在致聋豚鼠内耳的表达及对螺旋神经元的保护作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 骨髓间充质干细胞耳蜗内移植的应用进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 耳聋基因治疗策略 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
（9）MnSOD基因转染对拟老化大鼠内耳的干预性保护（论文提纲范文）
| 前言 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 病毒与非病毒载体转导大鼠耳蜗组织细胞的研究 |
| 材料和方法 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 重组病毒rAVV2-IRES-EGFP/MnSOD的构建及其表达 |
| 材料和方法 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 MnSOD基因转染对拟老化大鼠内耳的干预性保护 |
| 材料和方法 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词简表 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、小鼠耳蜗神经营养因子-3基因的克隆及其基因工程细胞模型的建立（论文参考文献）
- [1]NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究[D]. 曾友根. 南昌大学, 2020(08)
- [2]Neuritin对长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节损伤的保护作用[D]. 桂飞. 杭州师范大学, 2019(01)
- [3]丙戊酸联合NT-3基因修饰的嗅鞘细胞移植对脑损伤神经细胞的修复作用[D]. 李海明. 新乡医学院, 2019(02)
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- [7]补肾活血通窍中药复方对庆大霉素致聋小鼠耳蜗内NT-3表达的影响[D]. 李群真. 南京中医药大学, 2009(06)
- [8]BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞的表达及对豚鼠螺旋神经元保护作用[D]. 陈观贵. 中南大学, 2009(02)
- [9]MnSOD基因转染对拟老化大鼠内耳的干预性保护[D]. 杨阳. 华中科技大学, 2008(12)
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