一、小肽融合蛋白通过阻断VEGF与KDR结合抑制血管生成与肿瘤生长（论文文献综述）
韦芊含[1]（2020）在《shRNA干扰Vegfr2研究洛克沙胂体内促血管作用及对VEGFR2-mTOR的影响》文中提出洛克沙胂（Roxarsone,Rox）具有促生长、抗菌、抗球虫等功效,作为饲料添加剂在畜禽生产中被广泛使用。但近年来研究表明Rox在体内外可促进血管生成,存在着诱导血管新生相关疾病发生的风险。VEGF可与血管内皮细胞表面的VEGFR2结合进而将信号传导至下游,对血管新生发挥调控作用。mTOR是PI3K/AKT信号通路的下游分子,在肿瘤生成和血管生成中具有调控作用。本课题组前期研究中发现Rox在体内外能够促进血管生成,使VEGF/VEGFR2以及PI3K/AKT表达上调。本文借助课题组前期构建的靶向Vegfr2基因shRNA重组慢病毒,转染大鼠血管内皮细胞并用于小鼠基质胶塞模型,以及利用小鼠黑色素移植瘤模型的体内试验,通过Rox或雷帕霉素处理,考察对基质胶塞、移植瘤及其血管生长的影响;Western Blot检测VEGF/VEGFR2、mTOR相关蛋白的表达,研究Rox体内促血管生成中VEGF/VEGFR2-mTOR 调节机制。在小鼠基质胶塞模型的体内试验中,血管内皮细胞与基质胶注射于小鼠皮下,建立基质胶塞模型。不同处理如下:PBS组、1.0 μM Rox处理组、shRNA干扰与Rox共处理组（Rox+RNAi组）、shRNA干扰组（RNAi组）。测定胶塞的重量、体积及血红蛋白含量,并对胶塞进行HE染色及CD34免疫组化分析,Western Blot检测VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR的表达。结果表明,Rox组基质胶塞体积、重量及血红蛋白含量均显着增加,分别是PBS组的2.10、1.69、1.49倍;胶塞组织中VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达水平亦显着升高（P<0.05）。与Rox组相比,Rox+RNAi组胶塞的体积、重量、血红蛋白、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达均显着调降低（P<0.05）。靶向Vegfr2基因shRNA干扰可显着抑制Rox对基质胶塞的生长及其血管生成的促进作用,对Rox引起的mTOR信号上调也有显着抑制作用。在小鼠B16F10黑色素移植瘤模型中,不同处理分组如下:PBS组、25 mg/kg Rox组、shRNA干扰与Rox共处理组（Rox+RNAi组）、shRNA干扰组（RNAi组）、阴性shRNA感染对照组（NC组）。重组慢病毒与B16F10细胞注射于小鼠腋下,于注射第二天连续7天灌胃给予Rox或PBS,每天1次。测量小鼠体重、肿瘤体积及重量;肿瘤组织进行HE染色及CD34免疫组化分析,Western Blot检测VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR的表达。结果表明Rox处理组小鼠的移植瘤体积和重量均显着增加,瘤重约为PBS组的1.53倍;Rox+RNAi组瘤重极显着减小,约是Rox组的0.65倍。Rox组肿瘤组织中VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达均显着上调（P<0.05）。与Rox组比较,Rox+RNAi组肿瘤组织中VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白表达均显着降低（P<0.05）。靶向Vegfr2基因shRNA干扰可显着抑制Rox对B16F10移植瘤及其血管生长的促进作用,对Rox引起的mTOR信号上调也有显着抑制。在大鼠血管内皮细胞的体外试验中,不同处理分为PBS组、1.0μM Rox处理组、靶向Vegfr2基因shRNA干扰与Rox共处理组（Rox+RNAi组）、shRNA干扰组（RNAi组）、Rox与雷帕霉素共处理组（Rox+RAPA组）、雷帕霉素处理组（RAPA组）和shRNA阴性对照组（NC组）。MTT法检测血管内皮细胞的活性,Western Blot检测VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR的表达。结果表明Rox能够促进血管内皮细胞生长,显着上调VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达（P<0.01）。与Rox组比较,Rox+RNAi组细胞活力、VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白水平均显着降低（P<0.05）;Rox+RAPA组VEGFR2及mTOR表达无显着差异,但VEGF和p-mTOR的表达极显着降低（P<0.001）。靶向Vegfr2基因的RNA干扰可显着抑制Rox对内皮细胞生长,及VEGF/VEGFR2-mTOR信号的促进作用;RAPA可抑制Rox对内皮细胞的促进作用,并下调VEGF、p-mTOR蛋白的表达。综上所述,洛克沙胂在体内可显着促进基质胶塞和小鼠黑色素移植瘤的生长及其血管生成,靶向Vegfr2基因RNAi可有效抑制洛克沙胂对基质胶塞和黑色素移植瘤的生长及血管生成。VEGF/VEGFR2-mTOR信号在Rox体内促血管生成中发挥重要调节作用。
王媛[2]（2020）在《肿瘤蛋白SND1通过抑制MHC-I类分子的抗原呈递作用促进肿瘤免疫逃逸》文中指出目的:肿瘤细胞可以通过失去抗原性和/或免疫原性,或者通过诱导肿瘤抑制性免疫微环境而发生免疫逃逸现象。不同的肿瘤免疫逃逸机制决定了临床上不同的免疫治疗方案,因此探讨肿瘤免疫逃逸的分子机制对肿瘤免疫治疗的相关策略有着很重要的指导作用。在肿瘤的免疫逃逸过程中,T细胞介导的细胞免疫发挥着重要作用。在20-60%的常见实体癌中,如黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌和膀胱癌等,肿瘤细胞的MHC-I类分子发生表达下调或缺失,这种改变无法诱导CD8+T淋巴细胞（CTL）识别和杀伤肿瘤细胞,是导致肿瘤免疫逃逸最重要的原因之一。MHC-I类分子的调控机制因肿瘤类型而异,这些改变可以是遗传或非遗传的,迄今研究认为,肿瘤细胞MHC-I类分子的调控主要分为表观遗传学调控,转录水平的调控或转录后水平的调控。SND1（Staphylococcal Nuclease And Tudor Domain Containing 1）蛋白是一种新定义的肿瘤蛋白,在几乎所有不同的肿瘤细胞中均高表达。同时,SND1也是一种在真核生物中广泛表达且高度保守的多功能蛋白,在多种细胞生理过程中起着重要的作用。目前的研究表明,SND1可以在细胞水平通过调节不同的信号通路促进肿瘤的发生和转移,然而,SND1对体内肿瘤发生和免疫微环境的影响尚无报道。因此本课题旨在深入探讨SND1与肿瘤免疫逃逸的相关性,以及SND1调控MHC-I类分子抗原呈递的分子机制。方法:本课题主要分为三部分:第一部分:（1）通过免疫亲和纯化实验与质谱分析发现SND1可以与MHC-I类分子的重链HLA-A结合;（2）通过免疫共沉淀、免疫荧光实验及Duolink邻位连接技术验证SND1在体内与HLA-A蛋白的结合,并判断二者相互作用的细胞定位。（3）通过体外纯化蛋白联合GST-Pulldown系统检测SND1蛋白与HLA-A蛋白相互结合的具体结构域,并通过晶体结构预测网站分析模拟二者结合的稳定构象;（4）通过利用含不同信号肽的内质网报告质粒（含绿色荧光蛋白）及免疫荧光实验分析SND1的N端序列对其在内质网定位的重要性。第二部分:（1）利用蛋白质印迹技术（Western Blot）及流式细胞术（Flow cytometry）来检测改变SND1的表达后不同肿瘤细胞（He La细胞及SKOV3细胞）表面MHC-I类分子的表达水平;（2）通过荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction,q PCR）实验排除SND1对HLA-A的转录水平的调控;（3）通过改变SND1表达后利用免疫共沉淀技术检测HLA-A蛋白的泛素化水平,来进一步研究SND1是否影响了HLA-A蛋白的降解。（4）最后通过利用质谱分析技术、免疫共沉淀技术及Duolink邻位连接技术,进一步探究SND1促进HLA-A蛋白降解的具体分子机制。第三部分:（1）通过流式细胞术及Western Blot技术来检测敲除SND1后小鼠肿瘤细胞（B16F10细胞及MC38细胞）表面MHC-I类分子（H2Kb）的表达情况;（2）在动物水平通过对小鼠进行皮下成瘤实验,拍照和记录瘤体生长情况,之后通过免疫组化和流式细胞术分析瘤体中免疫细胞的浸润情况;（3）在体外通过克隆形成、CCK8实验检测SND1对小鼠肿瘤细胞增殖的影响,通过流式细胞术检测SND1对小鼠肿瘤细胞周期和凋亡的影响;（4）在体内通过对比无成熟T细胞的Rag1-/-小鼠及野生型C57BL/6小鼠皮下成瘤后瘤体的生长情况,探究SND1是否通过影响肿瘤细胞在体内的增殖或凋亡,亦或免疫细胞的浸润而影响瘤体的生长;（5）选用OT-I的转基因小鼠模型,研究SND1是否影响CD8+T细胞介导的针对肿瘤细胞表面OVA特异性小肽的免疫应答;（6）通过检索临床样本数据库（TIMER及Progno Scan）,分析病人肿瘤标本中SND1的表达与免疫细胞的浸润及患者的生存期是否有显着的相关性。结果:第一部分:（1）SND1蛋白可与新生的MHC-I类分子的重链HLA-A在体内特异性结合;（2）SND1的SN3结构域与HLA-A的A3结构域酸性氨基酸之间的静电相互作用可能在维持SND1-HLA-A复合物稳定性中起重要作用;（3）SND1蛋白可以通过其N端序列（35aa）结合到SEC61A通道上,而使其定位在内质网上。第二部分:（1）在人的不同肿瘤细胞中,敲除或敲低SND1后,HLA-A蛋白的表达升高,而外源性过表达SND1后,HLA-A蛋白的表达降低;（2）在He La细胞中改变SND1后,HLA-A蛋白的稳定性发生改变,SND1可通过蛋白酶体途径促进HLA-A的降解;（3）免疫共沉淀及Duolink实验显示He La细胞中过表达SND1后会抑制HLA-A与Calnexin及β2m的结合效率,并且HLA-A的糖基化位点突变后不影响HLA-A与SND1的结合;（4）He La细胞中过表达SND1后会促进HLA-A与ERAD（ER-associated degradation,内质网相关的降解）相关复合物（VCP和VIMP）及E3泛素化连接酶HRD1的结合。第三部分:（1）在不同小鼠的肿瘤细胞中敲除SND1后,小鼠的MHC-I类分子（H2Kb）表达升高;（2）小鼠B16F10及MC38细胞皮下成瘤后,SND1敲除后的瘤体更小,并且瘤体里浸润的CD8+T细胞明显增多;（3）SND1在体内和体外对小鼠肿瘤细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响均不明显;（4）在SND1敲除的肿瘤模型中恢复SND1的SN结构域的表达,会使瘤体浸润的免疫细胞发生改变,且瘤体大小也随之改变。（5）转基因OT-I小鼠的实验结果进一步证实了SND1通过影响特异性小肽的抗原呈递,从而影响瘤体组织中CD8+T细胞的浸润。（6）检索TIMER及Progno Scan数据库发现,在黑色素瘤和结肠腺癌中,SND1与CD8+T细胞的浸润及患者的生存期呈负相关。结论:（1）SND1蛋白可通过其N端序列与内质网通道蛋白SEC61A结合而定位于内质网,同时在内质网上其SN结构域与新生的HLA-A结合。（2）SND1在内质网上挟持了新生的HLA-A,抑制了HLA-A与Calnexin及β2m的结合,使其无法形成稳定的结构,不能组装为成熟的MHC-I类分子,并且促进了HLA-A进入ERAD途径发生蛋白酶体相关的降解。（3）肿瘤细胞中SND1通过影响MHC-I介导的抗原呈递作用而影响CD8+T细胞介导的细胞免疫应答,从而促进了肿瘤的生长。此外,临床样本中SND1的表达与CD8+T细胞浸润及患者总体生存率呈负相关。
孙莹[3]（2019）在《RGD-transTat抑制新生血管生成活性的初步研究》文中研究说明与血管生成相关的疾病如实体肿瘤、眼部血管增生类疾病是研究工作中一类热点疾病,抑制新生血管的生成是治疗此类疾病的首要选择。病理性新生血管的生成多与促血管生成因子和血管生成抑制因子的失衡有关。其中,促血管生成因子主要包括血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等,对新生血管的生成起着至关重要的的作用。Tat作为细胞穿膜肽已得到广泛应用,在Tat的帮助下蛋白质、核酸、脂质体等都能顺利穿透细胞膜,进入细胞。RGD可以与整合素αvβ3特异性结合,通常作为靶向肽应用于各类研究。碳端规则（C-end rule,CendR）是Ruoslahti团队利用噬菌体展示技术发现的一种位置效应。在碳端具有R/KXXR/K结构的肽链可以与靶细胞上的神经纤毛蛋白1（NRP1）受体结合,其中X表示除精氨酸与赖氨酸之外的任意氨基酸,R/KXXR/K结构需位于肽链碳端。Tat序列中存在RKKR元件,但其位于肽链的氮端而非碳端,逆序后的Tat即transTat严格符合CendR。因此,本课题以transTat作为研究对象,考察其穿膜性与抑制新生血管生成的活性。为使transTat具有更好的靶向作用,将RGD与transTat连接,考察RGD-transTat抑制新生血管生成活性,为治疗新生血管疾病的肽链提供多一种选择。本文的主要研究内容与结果如下:（1）TransTat和Tat穿膜性的对比研究本研究中首先对比研究了 transTat和Tat穿膜活性。通过细胞摄取实验与荧光倒置显微镜观察结合发现transTat的穿膜能力与Tat相当,将Tat序列逆转后得到的transTat对tat的穿膜能力没有影响。（2）TransTat、RGD-transTat抑制新生血管生成活性的初步研究通过细胞增殖实验、划痕实验、成管实验以及鸡胚尿囊膜模型评价了 Tat、transTat、RGD、RGDtransTat和transTatRGD 5种多肽抑制新生血管的生成活性。结果表明,Tat与transTat对于人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞增殖与成管没有显着性影响,对HUVEC的迁移有一定的抑制作用,但二者之间没有显着性差异,可以表明逆序后的Tat,即transTat,没有显示出更强的抑制新生血管生成的活性。RGD-transTat对HUVEC细胞增殖、迁移以及成管的抑制作用明显增强,且RGD位于肽链碳端与氮端对transTat活性没有显着影响。（3）Tat、transTat、RGD、RGDtransTat 和 transTatRGD 与 NRP1、整合素αvβ3的结合能力利用HUVEC细胞摄取实验以及通过共聚焦显微镜观察Tat、transTat、RGD、RGDtransTat 和 transTatRGD 5 种多肽在 HUVEC 细胞上与 NRP-1、整合素αvβ3的共定位,结合实验结果可以发现,除RGD外,Tat、transTat、RGDtransTat和transTatRGD 4种多肽对NRP1均具有一定的结合能力,transTatRGD稍弱一些。Tat与transTat对αvβ 3的特异性结合与RGDtransTat、transTatRGD相比较弱。本论文的创新点包括:（1）将Tat逆序后得到一种新的穿膜肽transTat,并对其抑制新生血管生成的活性进行了初步评价。（2）将 RGD 与 transTat 连接合成 RGDtransTat 和 transTatRGD,研究了它们抑制新生血管生成的活性以及初步的作用机制,并评价了 RGD位于碳端与氮端对transTat活性的影响。
邢丽[4]（2019）在《晚期结直肠癌一线化疗联合贝伐珠单抗的疗效及其与RAS和BRAF基因状态的关系》文中进行了进一步梳理目的:研究晚期结直肠癌（mCRC）贝伐珠单抗联合不同一线化疗方案的疗效,并比较KRAS和BRAF基因突变型与野生型、不同原发肿瘤部位、不同治疗情况与疗效之间的关系,探讨KRAS和BRAF基因对预后的影响。方法:选取已行KRAS基因和BRAF基因检测符合入组条件的mCRC患者216例,按照医师自选方案给予一线化疗（FOLFOX/XELOX或FOLFIRI/XELIRI）联合贝伐珠单抗的治疗方案。诱导治疗拟定4～8周期化疗（3-6个月）。每2周期评价一次。根据实体瘤疗效评价标准（RECIST 1.0）,回顾性分析KRAS基因和BRAF基因状态与不同一线化疗方案联合贝伐珠单抗治疗的客观缓解率（ORR）、中位无进展生存期（mPFS）和中位总生存期（mOS）的相互关系。对治疗的不良反应进行评价。结果:1.KRAS基因突变率36.6%,BRAF基因突变率6.5%。在BRAF基因野生型组中,与KRAS基因野生型患者相比,KRAS基因突变型患者出现低分化腺癌的概率更高（51.3%vs.30.6%,P=0.003）,更易出现转移至肝脏（78.2%vs.64.5%,P=0.003）且肝内病灶数≥3（59.0%vs.39.5%,P=0.023）,差异均有统计学意义（P<0.05）。在KRAS基因野生型组中,与BRAF基因野生型患者相比,BRAF基因突变型患者出现低分化腺癌的概率更高（61.5%vs.30.6%,P=0.025）,更容易出现转移至肝脏（84.6%vs.64.5%,P=0.049）且肝内病灶数≥3（72.7%vs.39.5%,P=0.004）及腹膜（84.6%vs.29.0%,P=0.000）,差异均有统计学意义（P<0.05）。BRAF基因野生型患者mOS大于突变型患者（18.1m vs.14.9m,P=0.026）,差异有统计学意义（P<0.05）。2.接受一线不同化疗方案联合贝伐珠单抗的靶向治疗,在BRAF基因野生型组中,KRAS基因突变型与野生型ORR的比较,差异均无统计学意义（P>0.05）;在三组治疗方案中,KRAS基因和BRAF基因突变型与野生型ORR、mPFS和mOS 比较,统计学均无显着性差异（P>0.05）。在KRAS基因野生型组中,BRAF基因突变型与野生型ORR比较,差异无统计学意义（P>0.05）;在三组治疗方案中,KRAS基因和BRAF基因突变型与野生型ORR、mPFS 比较统计学无显着性差异（P>0.05）,而BRAF基因突变型患者mOS均低于野生型患者,FOLFOX+Bev（14.6mvs.17.6m,P=0.043）、XELOX+Bev（15.1m vs.17.9m,P=0.036）、FOLFIRI+Bev（14.9mvs.17.1m,P=0.038）,统计学均有显着性差异（P<0.05）。3.不同治疗情况（曾经暴露和初次暴露）下,BRAF基因和KRAS基因同为野生型的患者,曾经暴露与初次暴露比较,ORR分别为（30.2%vs.51.4%,P=0.032）,mPFS分别为（8.3mvs.9.5m,P=0.043）,差异均有统计学意义（P<0.05）。KRAS基因突变型患者及BRAF基因突变型患者,曾经暴露与初次暴露的ORR、mPFS比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。4.mCRC患者不同肿瘤原发部位（左半、右半结肠）,在BRAF基因野生型组中,KRAS基因突变型与KRAS基因野生型患者,左半结肠与右半结肠ORR、mPFS比较,统计学均无显着性差异（P>0.05）。在KRAS基因野生型组中,BRAF基因突变型与BRAF基因野生型患者,左半结肠与右半结肠ORR、mPFS比较,统计学均无显着性差异（P>0.05）。5.多因素Cox回归分析结果显示,KRAS基因突变不能作为mOS（HR=0.533;95%CI:0.238-1.352:P=0.183）的预测因素（P>0.05）。BRAF 基因突变可作为 mOS（HR=0.336;95%CI:0.135-1.693:P=0.036）的预测因素（P<0.05）。结论:1.mCRC接受一线不同化疗方案（FOLFOX/XELOX,FOLFIRI）联合贝伐珠单抗治疗,KRAS基因和BRAF基因突变型与野生型患者ORR无明显差异;BRAF基因突变型患者mOS均明显低于BRAF基因野生型患者;2.对于KRAS基因及BRAF基因野生型,初次暴露的患者ORR、mPFS均优于曾经暴露的患者;3.不同原发肿瘤部位（左半、右半结肠）mCRC的预后未显示出明显差异;4.BRAF基因突变状态可对mOS作出预测,本身是预后不良因素。
杨桃梅[5]（2018）在《TCEA1对小鼠粒细胞增殖及分化潜能的调节作用研究》文中认为研究背景急性髓细胞白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是由造血干细胞或造血祖细胞异常增殖、细胞成熟发生障碍所引起的一种恶性血液肿瘤。AML的发生及预后与染色体易位、基因表达异常、环境及年龄等诸多因素相关。尽管多种治疗方法如诱导化疗、缓解后化疗、靶向药物治疗及造血干细胞移植等已应用于急性髓细胞白血病的治疗。但是急性髓细胞白血病仍然是临床上预后可变且患者死亡率比较高的一种恶性血液肿瘤。为此发现新的具有调节髓细胞增殖潜能的功能基因不仅有助于提升对白血病生成的认识,而且将会为白血病患者的提早诊断、及时治疗及预后提供潜在靶点。起初人们认为转录延伸是一个不受调控的机械添加碱基的过程并主要致力于对转录起始阶段的研究。直到后来,人们才渐渐关注并对转录延伸的调控进行研究,发现转录延伸的调节是控制基因表达的关键步骤。在转录起始不久后RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ,RNAP Ⅱ）便被DRB敏感性诱导因子（DRB sensitivity inducing factor,DSIF）因子及负延伸因子（negtive elongation factor,NELF）阻滞在转录起始位点下游。此时,阻滞释放因子需要募集正性延伸因子到阻滞位点进行解阻滞作用从而刺激RNAPⅡ的延伸活性以保证转录延伸的进行。S-Ⅱ 又名 TFIIS（Transcription elongation factor S-Ⅱ）,是一种比较保守的转录延伸因子。S-Ⅱ能使受到转录阻滞的RNAPⅡ恢复转录活性并顺利通过转录阻滞位点,从而极大地提高了基因转录效率。目前普遍地认为S-Ⅱ有三个家族成员,其中 TCEA1（Transcription elongation factor A1）是 S-Ⅱ 中最常见的形式、是最早被报道的与RNAP Ⅱ阻滞释放相关的转录延伸因子。研究显示TCEA1通过刺激RNAP Ⅱ对初期转录本进行切割从而促进基因的转录延伸。在髓细胞生长发育的各个阶段中涉及不同专一性基因的表达,如在细胞分化成熟阶段主要表达与分化成熟相关的基因,而与增殖相关基因的表达受到严格限制。专一性基因表达失控或异常与造血紊乱及白血病发生发展息息相关。目前对TCEA1的研究报道多集中于对其结构、在转录阻滞释放中的机制、在实体瘤及红细胞生成中相关作用的研究。但是关于TCEA1在粒细胞生成过程中的作用目前尚未可知。本研究主要利用shRNA文库（Cancer 1000 Library）筛选具有调节粒细胞增殖潜能的功能基因,并深入分析重要功能基因TCEA1对粒细胞增殖、分化及凋亡的作用。本研究的完成不仅筛选出18个具有调节粒细胞增殖及分化潜能的功能基因,同时也明确了重要功能基因TCEA1在粒细胞生成中的重要作用。这些发现进一步补充了我们对TCEA1生物学功能的认知,强调了转录延伸对造血细胞命运及对髓祖细胞向粒细胞转化的影响,并且有可能为髓细胞白血病的临床诊断、治疗提供潜在作用靶点。研究目的1.应用shRNA文库结合甲基纤维素筛选培养基筛选出具有调节粒细胞增殖及分化潜能的功能基因。2.通过一系列细胞功能学实验验证所筛选的功能基因对粒细胞生长发育的调节作用。研究方法1.细胞培养1.1.BOSC23 细胞用含 10%FBS、100U/ml青霉素及 100μg/ml 链霉素的 DMEM培养基培养;32Dcl3细胞用含10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素及IL-3（1ng/ml）的1640培养基培养。2.shRNA文库筛选2.1.shRNA文库（Cancer 1000 library）的获得:运用分子克隆技术将靶向肿瘤相关基因（1000个）的shRNA文库（约含2300个shRNA）克隆到MSCV-LTR-miR30-SV40-GFP载体（LMS）上,构建出本研究中需要用到的shRNA文库。2.2.分离 FVB/n小鼠骨髓（Bone Marrow,BM）细胞:实验前 5天用150mg/kg的5-FU处理10只成年的FVB/n小鼠。在实验当天运用常规颈椎脱臼法将小鼠处死并在无菌条件下获取小鼠股骨中的BM细胞备用。2.3.建立筛选系统:阴性对照组细胞采用上述获取的小鼠BM细胞（2×106）,阳性对照组细胞采用转染MycT58A的BM细胞（1×106）,阴性和阳性对照组细胞均于甲基纤维素粒细胞克隆形成培养基（含100ug/ml的G-CSF,100ug/ml的SCF）中首次培养5天后收集细胞并制作成单细胞悬液,进行二次铺板再培养7天。在第5、7天通过计数克隆球数及Wright-Giemsa染色方法分析细胞增殖及分化情况。2.4.shRNA文库逆转录病毒包装:转染前一天将BOSC23细胞铺板于10cm培养皿中,次日用脂质体2000将shRNAs转染入BOSC23细胞,转染6小时后弃掉旧培养液并加入10ml新鲜培养液继续培养,分别在48、72小时时收集病毒上清液,病毒上清液经0.45μM滤膜过滤后可直接用于细胞感染,也可分装成小体积管保存于-80℃备用。2.5.shRNA文库逆转录病毒感染BM细胞:病毒解冻,将1百万shRNA文库逆转录病毒（添加有2ug/ml的聚凝胺）与2百万个BM细胞混合,2400rpm离心2小时;弃上清,用2ml预处理过的新鲜培养基重悬细胞并置于37℃、5%CO2细胞培养箱进行培养。次日,重复上述感染步骤后于37℃、5%CO2细胞培养箱继续培养细胞。2.6.甲基纤维素克降形成实验:第二次感染次日,收集上述细胞,加入7-AAD染料使其终浓度为40ug/ml,用流式分选出成功感染逆转录病毒的BM 阳性细胞（GFP+7-AAD-）;添加适量甲基纤维素粒细胞克隆形成培养基（含 100ug/ml的 G-CSF,100ug/ml 的 SCF）于 37℃、5%CO2 培养箱培养5天。5天后统计克隆球数目,运用Wright-Giemsa染色方法对克隆球细胞进行形态学分析。收集每个克隆球细胞并进行二次铺板再培养7天,7天后再次统计克隆球数目及分析克隆球中细胞形态学特征。2.7.获取克隆球细胞中的shRNAs信息:用20-200ul的枪尖吸取克隆球细胞并移至含100ul FACS缓冲液的的离心管（RNase/DNase Free）中;1000rmp离心5分钟;弃掉上清,按传统提取方法提取出细胞的基因组;PCR方法扩增出细胞中所整合的shRNA片段;将shRNA片段连接到TA TOPO测序载体中,通过基因测序及序列比对获知shRNA片段对应的基因信息。3.质粒构建3.1.将shRNA文库筛选结果中得分较高的shTCEA1、shZNF212、shEPS8片段分别构建到MSCV-LTR-miR30-SV40-GFP（LMS）表达载体上,同时构建相应的对照质粒。测序核实后用于建立表达shTCEA1、shEPS8、shZNF212及相应对照质粒的稳转细胞系。3.2.设计多个针对TCEA1的不同shRNAs及相关对照,并将这些shRNAs分别构建到MSCV-LTR-miR30-SV40-GFP（LMS）表达载体上,构建出shTCEA1.2031、shTCEA1.1669、shTCEA1.538、shTCEA1.454 及相应对照质粒。通过逆转录病毒包装、感染建立的方法构建出 32Dc13-shTCEA1.2031、32Dcl3-shTCEA1.1669、32Dcl3-shTCEA1.538、32Dcl3-shTCEA1.454及表达相应对照质粒的稳转细胞系。4.建立稳转细胞系4.1.逆转录病毒包装:同shRNA文库病毒包装方法一致。4.2.收集逆转录病毒,在病毒液中添加适量体积的聚凝胺使其终浓度为2ug/ml;用1ml含聚凝胺的病毒液重悬32Dcl3细胞并以2400rpm离心2小时;弃上清,用2ml含IL-3的1640培养基重悬细胞,置于37℃、5%CO2培养箱进行培养。次日,重复上述步骤再次进行感染。培养2天后,用添加有2ug/ml嘌呤霉素的1640培养基进行培养并筛选出阳性细胞。5.蛋白提取5.1.离心收集细胞沉淀,用PBS缓冲液（预先于4℃预冷）洗涤细胞沉淀三遍后再用含1×Cocktail（蛋白酶抑制剂混合液）的RIPA裂解液（强）于冰上裂解20min。4℃、12000rpm离心20min收集蛋白上清。所提取出的蛋白样品浓度用碧云天BCA试剂盒测定。6.蛋白免疫印迹6.1.所提取蛋白经97℃变性。取30微克蛋白进行SDS-PAGE凝胶（10%）电泳分离,将凝胶分离后的蛋白条带转至预活化过的PVDF膜上,PVDF膜在室温条件下用TBST配制的5%BSA封闭2小时。2小时后配制1000倍稀释的TCEA1抗体稀释液于4℃条件下孵育PVDF膜。次日,将洗涤后的PVDF膜转入盛有二抗稀释液的器皿中并在室温条件下孵育2小时。2小时后用TBST再洗涤三次。洗涤完毕后用ECL发光液孵育PVDF膜并在显影仪中曝光成像,检测32Dcl3-shTCEA1.2031、32Dcl3-shTCEA1.1669、32Dcl3-shTCEA1.538、32Dcl3-shTCEA1.454 细胞中 TCEA1 蛋白表达水平。7.总RNA提取7.1.32Dcl3-shTCEA1.1669、32Dcl3-shTCEA1.538 细胞及对照细胞于诱导分化培养基中培养24h后,离心收集细胞沉淀;加入1ml TRIzol试剂处理5min使细胞内RNA释放至溶液中;加入200ul氯仿室温处理5min,4℃、12000rpm离心15min使溶液分相;收集上清,500ul异丙醇沉淀RNA;75%乙醇洗涤RNA沉淀;室温放置10min使乙醇挥发干净,10min后用一定体积无RNaseA的双蒸水溶解沉淀团块;Nanodrop测定RNA浓度及纯度。8.实时荧光定量PCR（qPCR）8.1.以上述所提取的RNA为模板,利用逆转录聚合酶链式反应合成相应cDNA;用 Thermo 公司的 SYBR Green Supermix 试剂及 50ng 的 cDNA 模板进行实时荧光定量PCR分析诱导分化培养条件下32Dcl3-shTCEA1.1669、32Dcl3-shTCEA1.538 细胞及对照细胞中 MPO、PRTN3、ELANE、LTF、MMP9及CRISP3的mRNA表达水平。9.细胞增殖9.1.台盼蓝染色、细胞计数:32Dcl3-shTCEA1.1669、32Dcl3-shTCEA1.538 细胞及对照细胞系用生长培养基（添加有1ng/ml IL-3的1640培养基）培养1、3、5、7天或用诱导分化培养基（添加有50ng/ml G-CSF的1640培养基）培养5天后用0.4%台盼蓝着色液使细胞着色并在显微镜下计数细胞数目,着色的为死细胞,未被着色并且折光性好的为活细胞,以此检测各细胞系细胞增殖/存活情况。并且在每一次实验中每一个样品设置3个重复复孔。9.2.细胞周期实验:收集1×106个由生长培养基（添加有lng/ml IL-3的1640培养基）或诱导分化培养基（添加有50ng/ml G-CSF的1640培养基）培养的细胞,细胞用PBS洗涤2遍后再用预冷的70%乙醇固定过夜（24小时以上）。在37℃条件下用200ug/ml的RNase A处理半小时。50ug/ml碘化丙啶（PI）于冰上对细胞进行染色5min,5min后用流式细胞仪测定各细胞系细胞周期分布的情况。10.细胞凋亡10.1.收集1×106个生长培养基或诱导分化培养基培养的细胞,用Annexin V-PE及7-AAD染料使细胞着色,流式细胞仪测定各细胞系细胞凋亡情况。11.形态学染色分析11.1.收集细胞并制成小体积细胞悬液,细胞悬液制成细胞涂片后用Wright-Giemsa染色法进行着色:用600ul试剂一固定1min;加1200ul试剂二染色7min;双蒸水清洗30-40s;自然晾干、镜检;中性树脂封片;Olympus显微拍摄,从细胞形态学水平分析各细胞系细胞分化情况。12.GEO数据库分析12.1.运用GEO数据库分析正常细胞及肿瘤细胞中TCEA1表达水平。12.2.运用GEO数据库分析TCEA1表达下调后重要转录因子表达变化情况。13.数据统计分析13.1.数据用Mean±-SD表示,结果应用GraphPad Prism 5统计软件进行统计分析,实验组和对照组间显着性检验用t检验完成。P值小于0.05为显着性差异,表明实验结果有统计学意义。研究结果1.通过shRNA文库筛选出具有调节粒细胞增殖潜能的功能基因:在shRNA文库筛选中我们首先将shRNA文库包装成逆转录病毒并感染从小鼠股骨分离得到的BM细胞,通过病毒感染的方法将这些shRNA整合到细胞基因组中,最后利用流式分选仪分选出被shRNA文库病毒感染的BM细胞（GFP+7-AAD-的细胞）。然后,我们通过甲基纤维素筛选培养筛选出28个具有促细胞增殖表型的阳性克隆。通过测序、序列比对等步骤最终获得了具有促增殖功能的shRNA序列。这些shRNAs最后分别对应18个基因,它们涉及细胞功能调节的诸多方面包括基因表达调控、细胞信号转导、细胞周期调控及转录调节等。最后,我们选取了 shRNA文库筛选中得分较高的候选基因Tcea1、Eps8及Znf212,并通过体外细胞实验初步验证了这几个基因沉默对粒细胞增殖的作用,结果显示Tcea1、Eps8、Znf212基因沉默均能促进粒细胞增殖。流式分析显示shTCEA1、shEPS8、shZNF212病毒感染的细胞中S期细胞比例分别较对照组升高13.89%、9.39%、5.3%;细胞计数实验显示感染shTCEA1、shEPS8、shZNF212病毒的细胞存活分别较对照组上升271.95%、254.88%、60.98%。这些均表明我们有效的从混合文库中筛选出了具有促粒细胞增殖潜能的基因,并且沉默Tcea1对粒细胞增殖的促进作用最为明显,因此我们将Tcea1基因作为后续重点研究的基因代表。2.GEO数据库（GSE47044）分析显示TCEA1在淋巴瘤（一种血液细胞肿瘤）中表达下调:该数据库分析结果提示TCEA1功能失活与血液细胞增殖的潜在关联。3.细胞增殖实验表明沉默TCEA1促进粒细胞增殖/存活能力:含IL-3或G-CSF的培养基培养细胞计数结果显示TCEA1沉默的32Dcl3-shTCEA1.1669、32Dcl3-shTCEA1.538细胞存活能力高于对照组细胞;用含1ng/ml IL-3的培养基培养细胞时细胞周期流式分析结果显示32Dcl3-shTCEA1.1669和32Dcl3-shTCEA1.538细胞系S期细胞分别比对照组升高8%和12%;用含50ng/ml G-CSF的培养基培养细胞时细胞周期流式分析结果显示32Dcl3-shTCEA1.1669和32Dcl3-shTCEA1.538细胞系S期细胞分别比对照组升高5%、8%。4.分子及细胞形态学实验表明沉默TCEA1阻碍粒细胞分化进程:qPCR结果显示 TCEA1 沉默的细胞系 32Dcl3-shTCEA1.1669 和 32Dcl3-shTCEA1.538细胞表达高水平的初期颗粒蛋白如绿过氧物酶（MPO）、弹性蛋白酶（ELANE）及蛋白酶3（PRTN3）,而表达低水平的次级颗粒蛋白如乳运铁蛋白（LTF）、富含半光氨酸的分泌蛋白3（CRISP3）及三级颗粒蛋白如基质金属蛋白酶9（MMP9）;细胞形态学分析显示TCEA1沉默的32Dcl3-shTCEA1.1669和32Dcl3-shTCEA1.538细胞处于粒细胞分化早期相对幼稚阶段:细胞核质比例大、细胞核成圆形或卵圆形、细胞核边缘清晰、极少数细胞的细胞核中出现中心小洞、因细胞含大量早期的嗜苯胺蓝颗粒细胞染色偏紫蓝色。而对照细胞呈现成熟粒细胞形态:细胞核形态古怪并呈分叶现象,有马蹄形细胞核、分叶形细胞核（有的细胞核分2叶、3叶、4叶,甚至分5叶）、细胞因分化成熟胞质嗜碱性减少从而染色偏玫红色。5.细胞凋亡实验表明沉默TCEA1抑制粒细胞凋亡:在含IL-3的培养基中培养 TCEA1 沉默的 32Dcl3-shTCEA1.1669 和 32Dcl3-shTCEA1.538 细胞,Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡检测显示凋亡细胞分别较对照组下降8.17%、6.77%;在G-CSF诱导培养条件下培养的32Dcl3-shTCEA1.1669和32Dcl3-shTCEA1.538细胞,凋亡细胞分别较对照组下降了 37.5%、31.37%。6.GEO数据库分析表明沉默TCEA1影响某些转录因子表达:TCEA1沉默的细胞中C/EBPα、GFI-1转录因子表达水平升高,而C/EBPε、IRF8转录因子的表达水平降低。结论1.初步筛选出以TCEA1、EPS8及ZNF212为代表的18个具有调节粒细胞增殖潜能的候选功能基因。2.TCEA1在粒细胞生长发育过程中扮演着重要角色:沉默TCEA1通过促进粒细胞增殖、抑制粒细胞凋亡同时阻碍粒细胞正常分化进程从而使幼稚细胞大量积累并缺少成熟的免疫细胞。3.TCEA1表达下调与血液肿瘤发生发展具有相关性。4.TCEA1可能通过调节与成熟分化相关的基因表达从而调控粒细胞生长发育。研究背景乳腺癌是目前女性中较为常见的恶性肿瘤之…,具有发病机理复杂、类型多样等特点。目前该恶性肿瘤的发病率1丨:在以每年3%的速度持续上升。在世界各地每年约有上百万人被检齐出患冇乳腺癌,其中就有数十万人不幸死于乳腺癌。目前针对乳腺癌患者的临床治疗策略丨?:要冇:传统的手术切除联合化疗法、对雌激素阳性的病人所采用的内分泌治疗法、对于HER2阳性、EGFR突变病人的靶向治疗法等。但对于高转移性的乳腺癌患者而言,上述疗法预后差、易复发。为此在乳腺癌中发现新的致癌抑癌机制、揭不新的分子治疗靶标及其应用,对乳腺癌的临床治疗将要价饥。Chromosome 2 open reading frame 40（C2ORF40）,XNEsophagealcancerrelated gene 4（￡C7?GV）,是一个抑癌棊W。C26W却在人组织中广泛表达并锚定于细胞表面。作为抑癌耗因,参与众多生物学进程如细胞增殖、分化、衰老、侵袭、迁移、先天免疫、炎症等的调节。在诸多肿瘤如食道管癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、胶质瘤等肿瘤组织中C26IAF洲表达水平降低,并且高水平表达与患者无病存活期及无转移存活呈正相关性,C20i?/却低表达可作为乳腺癌、鼻咽癌等肿瘤患者预后差的重要标志。C20/JF扣高表达可通过抑制细胞增殖、侵袭、迁移及促进细胞凋亡从而发挥抑癌功能。目前认为C2ORF40是通过旁分泌机制起抑癌作用,在发挥抑癌作用时,C2ORF40如何将抑癌信号转移至细胞内,目前尚不明确。受体酷氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase,RTK）即是一种受体也是一■种激酶,均含有一个胞外配体结合域、一个疏水跨膜域和一个包含保守激酶域的胞内片段,负责细胞夕卜配体刺激信息至细胞内的跨膜信号转导。受体酪氨酸激酶及其下游胞内信号可以调节多种生物学进程包括细胞增殖、分化、侵袭、迁移以及凋亡。在多种肿瘤如乳腺癌中均发现酪氨酸激酶受体信号的异常,酷氨酸激酶受体功能获得性突变、高表达、基因扩增均与多种疾病相关。表皮生长因子受体1（Epidermal growth factor receptor 1,EGFR又称ErbBl）是1型酪氨酸激酶受体的重要成员,属于ErbB家族受体,EGFR在不同类型乳腺癌中高表达及其介导的跨膜信号转导是促进乳腺癌细胞增殖的机制之一,为此EGFR阳性可以作为三阴性乳腺癌预后不良的独立性指标。成纤维生长因子受体1（Fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1）是另-受体酪氨酸激酶家族的成员,在进化上比较保守,能调节许多的生物学进程如组织发育、血管生成以及组织再生等。FGFR1介导的跨膜转导信号异常与乳腺癌的发生具有显着相关性,许多证据显示FGFR1信号的异常活化与肿瘤的发病机理、肿瘤治疗耐药性有关,研宄表明肿瘤细胞（如非小细胞肺癌细胞）耐药性是由FGF-2-FGFR1及其下游信号上调所引起的。Vascular endothelial growth factor receptor 1（VEGFR1也叫Fltl）是VEGFR家族中两个最重要的酪氨酸激酶受体之一,具有调节血管生成、血管再生及肿瘤发生、肿瘤转移等过程的功能。有研究表明在血管生成及再生过程中VEGFR1具有正负调节功能。近年来,越来越多的证据显示VEGFR1在血管生成的调控中不仅仅局限于是一个诱饵受体这么简单,在血管生成中VEGFR1是一个正调控因子。VEGFR1高表达及其信号的异常活化可促进乳腺癌细胞生长并与乳腺癌高转移风险及复发相关,当用VEGFR1专一性抗体或针对VEGFR1的抗血管生成小肽F56处理时可抑制其信号传递从而抑制乳腺癌细胞生长。本研究主要探讨利用串联亲和质谱纯化技术鉴定出与C2ORF40相互作用的跨膜蛋白,并试图建立C2ORF40抑制乳腺癌的跨膜信号转导机制。本研究的完成初步建立了C2ORF40发挥其抑功能癌的一种新的潜在机制,为理解C2ORF40的抑癌机制提供了新的理论基础。研究目的1.应用TAP-MS技术寻找并鉴定与C2ORF40相互作用的蛋白。为进一步建立C2ORF40抑癌信号跨膜转导机制的研宄奠定基础。2.建立C2ORF40抑制乳腺癌的跨膜信号转导机制。研究方法1.细胞培养1.1.HEK293T细胞、人乳腺癌MDAMB468细胞系用添加有10%FBS、100u/ml青霉桌、丨OOug/m丨链霉素的DMEM培养基培养;人乳腺癌BT549细胞系、MDAMB23丨细胞系用添加有10%FBS、100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的RPM丨丨640养基培养。1质粒构建2.1.C2ORF40序列从pBabe-puro-C2ORF40质粒上扩增下来构建到逆转录病毒表达载体pBabe-puro1-.,构建出pBabe-3xFlag-C2ORF40-HA、pBabe-3xFlag-HA-C2OHF40质粒及其和关对照质粒,构建成功后经测序验证。2.2.以pCMV10-3xFlag-MCS-HA及pCMV10-3xFlag-HA-MCS为载体分别构建出瞬时高表达C2ORF40的质粒pCMV10-3xFlag-C20RF40-HA和pCMV10-3xFlag-HA-C2（）RF40,|nj时构建相应对照空白质粒。构建成功后经测序验证。2.3.构建shFGFRl、shVEGFRl、shHGFR及相应对照质粒,并经测序验证。3.稳转细胞系建立3.1.运用Phi-NX细胞将pBabe-puro-3xFlag-HAC2ORF40、pBabe-puro-3xFlagC2ORF40-HA及其相设对照质粒包装成逆转录病毒。将逆转录病毒感染BT549及MDAMB231乳腺癌细胞系建立C2ORF40高表达的BT549-C2ORF40和MDAMB231-C2ORF40细胞系及相应对照细胞系BT549和MDAMB231。C2ORF40沉默的MDAMB468-shC2ORF40细胞系及相应对照细胞系MDAMB468在实验室的前期研究中己经建立。4.串联亲和纯化与C2ORF40相互结合的蛋白质4.1.上述瞬时高表达C2ORF40的双标签质粒及其对照质粒经威格拉斯大提试剂盒纯化后用lip2000转染到HEK293T中,48h后收集细胞沉淀并提取蛋白质。所得蛋白提取物用偶联3xFlag蛋白标签的琼脂糖珠进行首次纯化,纯化蛋白经3xFlag多肽置换下来后再用偶联HA蛋白标签的琼脂珠进行二次纯化。二次纯化复合物用10%SDS-PAGE胶分离。凝胶电泳分离完成后用银染试剂盒对电泳条带进行染色并用手术刀切下高表达C2ORF40组中的特异性蛋白条带于1.5mlEP管中,4摄氏度储存。5.质谱鉴定与C2ORF40相互结合的蛋白质5.1.按标准蛋白胶内酶解的方法对蛋白条带进行脱色、还原、酶解、萃取、Zip-tip柱子脱盐等步骤后用LC-MS/MS分离分析。5.2.LC-MS/MS分析:上述样品用赛默公司的高压液相色谱串联的混合线性离子井质谱仪进行鉴定。二级质谱数据采用Mascot和Sequest数据库进行搜索并用Proteome Discovererl.4进行分析与鉴定。6.免疫共沉淀验证串联亲和纯化质谱鉴定结果6.1.将C2ORF40瞬时高表达的双标签质粒及其对照分别转染HEK293T,C2ORF40在HEK293T细胞中瞬时高表达48h后提取蛋白质,用3xFlag标签抗体免疫沉淀C2ORF40蛋白及其互作蛋白GRB2,Western blot检测GRB2蛋白。7.免疫共沉淀检测C2ORF40与RTKs之间的结合情况7.1.在HEK293T细胞中瞬时高表达C2ORF40双标签质粒,用3xFlag标签抗体免疫沉淀C2ORF40及其相互作用蛋白复合物,Western blot检测各受体与C2ORF40之间的结合情况。8.检测C2ORF40与RTKs在乳腺癌细胞中的结合情况8.1.在稳定表达pBabe-3xFlag-C2〇RF40-HA质粒的乳腺癌MDAMB231细胞中,运用免疫共沉淀技术验证C2ORF40与GRB2以及各RTKs的专一性结合情况,并用相关受体抗体反向免疫共沉淀C2ORF40进行验证.,9.分别干扰FGFR1、VEGFR1、EGFR表达后检测GRB2、FGFR1、VEGFR1、EGFR与C2ORF40之间结合情况9.1.将shVEGFRl、shFGFRl、shEGFR干扰质粒及相应对照质粒瞬时转染稳定表达pBabe-3xFlag-C2ORF40-HA质粒的MDAMB231-C2ORF40细胞,免疫共沉淀检测各受体GRB2与C2ORF40的相互结合、FGFR1与C2ORF40之间的相互结合、VEGFR1与C2ORF40之间的相互结合及EGFR与C2ORF40之间的相互结合情况。10?检测C2ORF40对FGFR1、VEGFR1及EGFR受体磷酸化及其下游信号磷酸化的影响10.1.提取高表达C2ORF40或其对照质粒的MDAMB231蛋白,运用相应受体的抗体进行免疫沉淀富集,酪氨酸磷酸化抗体p-Tyr-100检测C2ORF40高表达纟U及其对照组中VEGFR1、FGFR1、EGFR受体磷酸化情况。10.2.Western blot检测高表达C2ORF40或沉默C2ORF40乳腺癌细胞系中受体酪斌酸激酶信号通路h游靶蛋白ERK的激活情况11?检测C2ORF40对生长因子诱导的受体磷酸化的彩响11.1.MDAMB231-C2ORF40及其对照MDAMB231细胞密度至80%左右时血清饥饿过夜G分别用VEGF、FGF-2、EGF生长因子刺激20min。提取总蛋门,川VEGFR1、FGFR1、EGFR抗体进行免疫沉淀进行富集。酪氨酸磷酸化抗体p-Tyr-100及Western blot检测C2ORF40高表达对VEGF诱导的VEGFR1受体怜酸化、对FGF-2诱导的FGFR1受体怜酸化、以及对EGF诱导的EGFR磷酸化的影响。12.检测C2ORF40高表达情况下RTKs抑制剂单独用药或联合用药对RTKs下游ERK蛋白活化的影响12.1.VEGFR1抑制剂（ZM 306416）、FGFR1抑制剂（PD173074）单独用药或以ZM306416、PD173074联合用药为例处理C2ORF40高表达或不表达的乳腺癌细胞48h。48h后提取总蛋白,Western blot检测各处理组中ERK活化情况。13.检测受体酪氨酸激酶抑制剂处理后C2ORF40高表达对肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响13.1.VEGFR1抑制剂（ZM 306416）、FGFR1抑制剂（PD173074）、EGFR抑制剂（Gefitinib）分别处理高表达C2ORF40质粒或其相应空载质粒的各乳腺癌细胞系,通过MTT实验、克隆形成实验检测受体酪氨酸激酶抑制剂处理后C2ORF40高表达对肿瘤细胞增殖能力的影响。13.2.VEGFR1抑制剂（ZM 306416）、FGFR1抑制剂（PD173074）、EGFR抑制剂（Gefitinib）分别处理高表达C2ORF40质粒或其相应空载质粒的各乳腺癌细胞系,运用划痕愈合能力实验及Tramwell实验检测各受体酪氨酸激酶抑制剂处理后C2ORF40高表达对肿瘤细胞迁移能力的影响。13.3.VEGFR1抑制剂（ZM 306416）、FGFR1抑制剂（PD173074）、EGFR抑制剂（Gefitinib）分别处理高表达C2ORF40质粒或其相应空载质粒的各乳腺癌细胞系,应用Matrigel实验检测各受体酪氨酸激酶抑制剂处理后C2ORF40高表达对肿瘤细胞侵袭能力的影响。14.数据统计分析14.1.Western blot结果用ImageJ软件进行灰度分析。数据用Mean士SD表示,应用GrphPad Prism 5统计软件进行统计分析,实验组和对照组间显着性检验用f检验完成。P值小于0.05为显着性差异,实验结果有统计学意义。研究结果1.成功构建瞬时高表达C2ORF40或基于逆转录病毒载体的双标签质粒和乳腺癌细胞系:成功构建高表达C2ORF40的双标签质粒pCMV10-3xFlagC2ORF40-HA、pCMV10-3xFlag-HA-C20RF40、pBabe-puro-3xFlagC2ORF40-HA、pBabe-puro-3xFlag-HA-C20RF40及其相应对照质粒。并构建出稳定表达pBabe-puro-3xFlag-C2ORF40-HA、pBabe-puro-3xFlag-HAC2ORF40及其相应对照质粒的稳转乳腺癌细胞系:MDAMB231-C2ORF40、MDAMB231、BT549-C2ORF40、BT549。2.运用串联亲和纯化结合质谱技术成功鉴定并验证C2ORF40与GRB2之间的结合:在HEK293T细胞中瞬时高表达pCMV10-3xFlag-C20RF40-HA质粒,运用Falg、HA抗体进行两次免疫共沉淀富集C2ORF40及与C2ORF40相互结合的蛋白复合物。SDS-PAGE凝胶分离、银染显色出特异性蛋白条带。切下特异性蛋白条带运用胶内酶解法对胶块脱色及酶解等处理,最终通过质谱鉴定出与C2ORF40结合的GRB2蛋白。3.C2ORF40与RTKs的相互结合:在HEK293T及乳腺癌MDAMB231细胞中通过免疫共沉淀技术检测出C2ORF40与乳腺癌中常见的VEGFR1、FGFR1、EGFR之间存在结合关系,并在乳腺癌细胞中通过VEGFR1、FGFR1、EGFR抗体反向免疫共沉淀的方法证实这些互作关系。当用分别针对VEGFR1、FGFR1、EGFR的shRNA处理MDAMB231-C2ORF40细胞后,与C2ORF40结合的VEGR1、FGFR1、EGFR及GRB2蛋白均明显减少,这一现象进一步证实上述受体与C2ORF40之间的结合关系。而C2ORF40 4乳腺癌中其他常见的RTKs（VEGR2、FGFR2、HER2、HER4、IGF1R）之间无结合。4.C2ORF40高表达阻断了相应RTKs及其下游信号蛋白的激活:在C2ORF40高表达的乳腺癌细胞系MDAMB231-C2ORF40中VEGFR1、FGFR1、EGFR的磷酸化水平均明显减少,并且在C2ORF40高表达的MDAMB23卜C2ORF40及BT549-C2ORF40细胞中RTKs经典卜游蛋白ERK的磷酸化水平也明显下降,当在C2ORF40本底表达较高的MDAMB468细胞中用基因沉默技术干扰掉C2ORF40表达后ERK的磷酸化水平升高。5.C2ORF40髙表达引起的受体酪?酸激酶激活受阻不能够被生长因子逆转:50ng/ml VEGF处理乳腺癌细胞20min,免疫共沉淀及Western blot联合检测细胞内P-VEGFR1水平,VEGF处理后MDAMB231细胞p-VEGFRl显着升高,而MDAMB231-C2ORF40内p-VEGFRl水平改变不明显;10ng/ml FGF-2处理乳腺癌细胞20min,免疫共沉淀及Western blot联合检测细胞内p-FGFRl水平,FGF-2处理后MDAMB231细胞p-FGFRl姑着升高,而MDAMB23卜C2ORF40内p-FGFRl水平改变不明显;100ng/ml KGF处理乳腺癌细胞20min,免疫共沉淀及Western blot联合检测细胞内p-EGFR水f,EGF处理后MDAMB231细胞p-EGFR显着升高,而MDAMB231-C2ORF40内p-EGFR水平改变不明显。6.C2ORF40同时靶向VEGFR1、FGFR1、EGFR抑制RTKs下游ERK信号激活:VEGFR1抑制剂（ZM 3064 1 6）、FGFR1抑制剂（PD173074）、KGFR抑制剂（Gefitinib）单独用药或以ZM306416、PD173074联合用药为例处理C2ORF40高表达及相应对照乳腺癌细胞。对照组细胞表达高水平的pERK,加酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞内p-ERK水平明显下降,当ZM306416与PD173074联合用药后对照组细胞内p-ERK水平进一步下降;与之对应,C2ORF40高表达细胞内p-ERK水平显着下降,且在酪氨酸激酶抑制剂单独用药或联合用药时C2ORF40高表达组中的p-ERK水平不再明显下降;此外,C2ORF40高表达对乳腺癌细胞内p-ERK的抑制作用可堪比酪氨酸激酶抑制剂联合用药对P-ERK产生的抑制效果。7.C2ORF40通过RTKs信号通路抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭及迁移能力:C2ORF40通过RTKs通路抑制乳腺癌细胞增殖:首先,MTT实验表明C2ORF40高表达组乳腺癌细胞增殖能力明显受到抑制,且当用受体酪氨酸激酶抑制剂处理（以ZM306416、PD173074为例）后细胞增殖能力不再明显下降;而对照组细胞具备高增殖能力并在受体酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞的增殖能力明显受到抑制。其次,克隆形成实验表明C2ORF40高表达组细胞克隆形成能力明显受到抑制,当用受体酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞的克隆所形成数目变化不明显;而对照组细胞具备高克隆形成能力,当用受体酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞的克隆形成能力明显受到抑制。C2ORF40通过RTKs通路抑制乳腺癌细胞迀移:首先,划痕愈合能力实验结果表明C2ORF40高表达明显抑制乳腺癌细胞划痕愈合能力,当用受体酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞划痕愈合能力不再明显下降;而对照细胞具备高划痕愈合能力,并且使用受体酪氨酸激酶抑制剂后该愈合能力明显下降。其次,Transwell小室实验表明C2ORF40高表达抑制乳腺癌细胞迁移能力,当用受体酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞迁移能力不再明显下降;而对照组细胞具备高迁移能力,并且该能力在受体酪氨酸激酶抑制剂处理后明显下降。C2ORF40通过RTKs通路抑制乳腺癌细胞侵袭能力:Matrigel实验表明C2ORF40高表达组细胞迁移能力明显受到抑制,且在用受体酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞的迁移能力不再继续下降;而对照组细胞具备高侵袭能力,当用受体酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞的侵袭能力明显受到抑制。结论1.我们通过串联亲和纯化质谱技术鉴定出了与C2ORF40结合的GRB2蛋白,并由此进一步明确了与C2ORF40结合的酩氨酸激酶受体VEGFR1、FGFR1、EGFR。提示C2ORF40可能通过以上酪氨酸激酶受体将胞外抑癌信号传递到了胞内。2.C2ORF40与VEGR1、FGFR1及EGFR结合从而阻断了相应受体酪氨酸激酶的激活,并进一步阻断了这些受体酪氨酸激酶信号通路下游经典蛋白ERK的激活3.C2ORF40通过阻断受体酪氨酸激酶（VEGFR1、FGFR1、EGFR）信号通路从而发挥其抑癌功能,并最终抑制了乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。
王友同,吴文俊,李谦,高美风[6]（2013）在《近年来我国生物技术药物研究进展和趋势》文中认为生物技术是21世纪世界各国竞相发展的经济、技术的制高点,作者站在世界生物技术药物发展总趋势的高度上,具体而微地调查和总结了我国近5年来生物技术药物研究所取得的成果,内容包括:细胞因子、其它蛋白质和多肽药物、融合蛋白、穿膜肽、酶、基因治疗、干细胞、单克隆抗体、治疗性疫苗及多糖药物等。调查发现,在攻克人类顽疾、保障人民身体健康、提高生活质量和发展我国生物技术药物产业方面,由于国内成批有创见的研究成果持续涌现,发展前景一片光明。该文可为有关部门科研规划、确定研究项目、企业锁定发展目标及生物制药人员选择专业发展方向提供参考。
张海涛[7]（2012）在《重组人干扰素-α2b与内皮抑素肽融合蛋白抗肿瘤研究》文中进行了进一步梳理人干扰素（Interferon）α2b是重要的肿瘤免疫治疗药物，在许多医院中作为一线的肿瘤治疗药物被广泛使用。己获美国FDA批准用于多种病毒性疾病和恶性肿瘤的治疗。然而，IFNα2b在临床治疗中需要大剂量长期给药，因此常常引发如急性和慢性毒性、神经系统损害和血液系统损害等明显的毒副作用，严重制约了其在临床上的广泛应用。人血管内皮抑素（Endostatin）是血管生成的抑制剂，在抑制肿瘤血管生成类药物中表现优秀，2009年被SFDA批准用于治疗肿瘤。经过大量的研究证实，人血管内皮抑素N末端的27个氨基酸是其核心功能区域。在内皮抑素N末端的27个氨基酸基础上进行氨基酸的替换和增补，引入串联的RGD（Arg-Gly-Asp）序列，形成内皮抑素多肽（29amino acid, EP29），在保持内皮抑素抑制肿瘤血管生成活性的同时，RGD序列赋予内皮抑素27肽靶向肿瘤血管内皮细胞、抑制肿瘤细胞生长与转移和增强其抗肿瘤活性的效果。实验室研究证实，EP29体外抗肿瘤活性明显高于天然内皮抑素，体内抗肿瘤活性也略高于天然内皮抑素，病理切片研究显示肿瘤组织大面积坏死，肿瘤萎缩。因此，有望成为新一代抗肿瘤小分子药物。在本研究中，我们采用基因工程技术，将EP29融合在IFNα2b的C末端形成IFNα2b-内皮抑素29个氨基酸多肽（IEP29）融合蛋白，在大肠杆菌中进行表达。期望该融合蛋白通过EP29的RGD序列与肿瘤新生血管内皮细胞的整合素αvβ3/αvβ5特异结合，使IEP29在肿瘤组织的新生血管处富集，既能针对性地发挥EP29抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤作用，又可以抑制整合素介导的新生血管形成，从而降低IFNα2b临床用药量，提高量效比。通过一系列的体内和体外实验分析证实，IEP29蛋白具有较高的生物活性，能够抑制肿瘤生长和肿瘤血管生成，同时具有良好的肿瘤靶向性。因此，符合最初的设计，具有较高的临床应用开发价值，有望成为新一代抗肿瘤药物。研究具体内容如下：1. IEP29融合蛋白上游研究本实验采用DNA重组技术，成功构建含IEP29融合基因的原核表达载体pET3a-IEP29，将表达载体转染BL21工程菌，经IPTG诱导后以包涵体形式表达重组蛋白，表达量占菌体总蛋白的10%左右，重组蛋白条带能够和抗IFNα2b单克隆抗体特异性结合。重组工程菌使用5L的NBS发酵罐培养，收集菌体经裂解、包涵体洗涤、溶解变性和透析复性，最后经亲和层析和离子交换柱纯化获得纯度大于95%的重组蛋白，内毒素检测完全符合药典标准。为适应临床前试验研究的需要，我们优化了发酵和纯化工艺，并将发酵和纯化工艺放大至中试规模。采用NBS5L发酵罐连续培养三批工程菌，每批次收获湿菌体约150g，IEP29蛋白表达量约占总蛋白量的10%。纯化三批次IEP29蛋白，纯度均达到95%以上，蛋白产量为每批3050mg，生产规模基本达到中试要求。按照基因工程药物质量标准的要求对IEP29融合蛋白的理化性质、纯度、生物活性、内毒素含量和杂质残留等进行检测和控制。2. IEP29融合蛋白活性研究为了验证融合蛋白是否同时具有IFNα2b和EP29的生物活性，我们通过肿瘤细胞侵袭和肿瘤细胞生长抑制实验来验证融合蛋白体外活性。通过内皮细胞粘附实验来验证融合蛋白在体外与肿瘤特异的内皮细胞亲和能力。结果说明，在体外IEP29融合蛋白有效抑制肿瘤细胞繁殖和迁移，其能力明显高于IFNα2b和EP29，同时特异粘附于内皮细胞。3. IEP29融合蛋白抗肿瘤研究通过小鼠体内抑瘤实验、药物体内分布研究、肿瘤病理组织切片研究、鸡胚尿囊膜试验等，一方面研究和探讨IEP29融合蛋白在小鼠体内的抑瘤效果和间接证明药物的肿瘤靶向性。另一方面初步探讨融合蛋白抑制肿瘤生长的作用机理。结果显示IEP29的抗肿瘤效果比IFNα2b和EP29更加显着，有效抑制肿瘤血管生成，具有肿瘤靶向性。为了进一步研究IEP29是否保持着IFNα2b和EP29的生物学功能，我们进行了一系列的抗肿瘤研究，有助于揭示靶向性药物的作用途径，同时对融合蛋白药物的开发也具有指导意义。在抑瘤实验中，IEP29融合蛋白能明显减轻S180、H22和Lewis肿瘤细胞荷瘤裸鼠的瘤重，和对照组比具有显着性差别，并且具有明显的量效关系。IEP29融合蛋白组抑瘤率均明显高于同剂量的EP29组，且和同剂量IFNα2b组比较有显着性差别。体内分布试验显示，给药30min后IEP29在肿瘤组织的浓度是IFNα2b的5倍，给药1h后IEP29在肿瘤组织的浓度是IFNα2b的1.8倍，表明IEP29可以在小鼠肿瘤组织中有效聚集。在鸡胚绒毛尿囊膜实验中，EP29、IFNα2b和IEP29蛋白在不影响原有血管的前提下，均有一定程度的抑制新生血管的生长。EP29和IEP29抑制新生血管的能力明显强于IFNα2b。从结果可以看出对照组血管生长良好，毛细血管清晰可见，主血管粗壮，分支适中。IFNα2b组有部分毛细血管减少，但不明显。EP29组毛细血管数量部分减少，局部血管变模糊。而IEP29组的血管抑制较明显，许多毛细血管开始消失，大部分血管变模糊。综上所述，我们获得了IEP29蛋白，经过体内和体外实验研究证实IEP29融合蛋白与IFNα2b和EP29相比，是一种高效抗肿瘤新生血管形成和抑制肿瘤生长的药物，本研究结果为IEP29重组蛋白将来的工业化生产和临床研究奠定了基础。此外，建立了比较稳定的生产工艺流程，确定了优化的融合蛋白表达和纯化系统及质量控制标准。
申冬昊[8]（2012）在《高效结合VEGF与EGFRs的Fc融合蛋白的研究》文中提出恶性肿瘤的形成病因复杂，诱因繁多，细胞内信号通路繁冗交叉，且同时存在多种基因的突变，涉及范围及因素极为庞杂，其药物治疗一直是极大的难题。近年来，随着单克隆抗体的发现与发展，肿瘤的治疗取得了较大的进展。单克隆抗体靶标明确，疗效显着。且临床应用不良反应少，安全性好，已作为一线药物大量应用于多种恶性肿瘤的临床治疗中。然而，单一靶点的抗体适用性窄，仅针对一部分肿瘤细胞有疗效，且极易产生耐药性。另一方面，全长抗体能同时结合到两个相邻的抗原表位或分子，从而增强了亲和功能，且能够延长存留时间。然而因其分子量高达150kDa，全长抗体无法快速传统组织，难以在病灶部位浓集，无法达到有效治疗浓度。因此，研制小分子量、多靶点的类抗体蛋白药物已成为肿瘤的抗体领域的重要发展方向。肿瘤的发生发展过程中会大量分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor, VEGF）,在肿瘤组织内大量诱导生成新生血管，为瘤体的扩张提供必需的养料。同时，肿瘤的增殖转移与表皮因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）家族的过量表达密切相关，故表皮生长因子受体家族与血管内皮生长因子是肿瘤治疗的重要靶标[1]。本课题主要组成如下：（1）通过Linker将KDR-D3与Herstatin的C末端的79个氨基酸（HERIN）融合，构建EGFR-VEGF多靶向融合蛋白。并将其与突变改造后的人抗体IgG1Fc段融合，引入抗体的ADCC （antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity）效应，同时还可增强融合蛋白的稳定性，提高蛋白在体内的半衰期。（2）在此基础上，利用纤毛嵌合型腺病毒（Ad5/35）携带HERIN-KDR-D3-FC （EVP3）表达框，构建重组腺病毒Ad5/35-EVP3，将该病毒对293细胞进行体外感染可获得融合蛋白EVP3。（3）将获得的融合蛋白EVP3经亲和层析方法纯化后，通过ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）和Western blotting方法对其进行定性及定量研究。利用间接免疫荧光实验（IFA）和ForteBio Octet Red96生物分子相互作用分析系统对融合蛋白EVP3与各靶标间的亲和力进行定性研究与定量测量。结果表明，融合蛋白EVP3在腺病毒Ad5/35-293细胞系统能够得以有效表达，且纯化后的蛋白EVP3与VEGFR、EGFR、HER2均具有良好的结合能力，与抗原HER2、EGFR、VEGFR的亲和力常数KD分别为1.95×10-8mol/L，8.47×10-9mol/L，5.75×10-9mol/L，为后续的体内外抗肿瘤作用的进一步研究奠定了基础。
李红,李岳,王兰,李亚,潘克俭[9]（2011）在《以血管内皮生长因子及其受体为药靶的抗肿瘤药物的研究进展》文中研究表明以肿瘤血管形成为靶点的抗肿瘤治疗已成为近年来研究的热点。血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor,VEGF）是目前所知作用最强的促血管形成因子。本文就目前阻断VEGF信号传导途径的抗肿瘤药物研究的最新进展与耐药性等问题作一综述。
丰俊东[10]（2005）在《川芎嗪对VEGF信号转导通路的干预作用研究》文中研究表明目的:通过观察川芎嗪（TMP）对血管内皮生长因子受体与其配体结合的影响,对血管内皮生长因子受体-2（KDR）表达量的影响,以及对血管内皮生长因子（VEGF）蛋白、VEGF mRNA 表达的影响,探讨川芎嗪对血管内皮生长因子（VEGF）信号转导通路的干预作用。并观察川芎嗪对人肝癌细胞株（Hep G2）增殖的抑制作用。 方法:以人脐静脉内皮细胞 HUVEC 为研究对象,采用血清药理学方法,制备川芎嗪大剂量组含药血清、川芎嗪小剂量组含药血清、阳性对照组鱼精蛋白含药血清、生理盐水组血清,反相高效液相色谱法测定川芎嗪含药血清中药物浓度。将各组血清作用于人脐静脉内皮细胞 HUVEC,采用放射配体受体结合分析法（RBA）观察川芎嗪对 VEGF与其配体结合的影响,检测受体最大结合容量（Bmax）和解离常数（Kd值）。选用 Western blot 方法观察川芎嗪对 HUVEC 中 KDR 表达量的影响。以人肝癌细胞株（Hep G2）为研究对象,采用 ELISA 法检测川芎嗪对 VEGF 在 Hep G2的蛋白表达的影响。RT-PCR 法测定川芎嗪对 VEGF在 Hep G2的 mRNA 表达的影响。采用直接给药方式,用 MTT 法观察川芎嗪对人肝癌细胞株（Hep G2）增殖的作用,流式细胞分析法分析川芎嗪对 Hep G2细胞周期的影响及其诱导细胞凋亡的作用。 结果:川芎嗪大剂量血清组作用于 HUVEC 细胞的 TMP 终浓度为77.0μg/ml。该组特异性结合（SB）呈典型的饱和趋势,与生理盐水组相比 Kd 增大（P<0.05）,说明在川芎嗪作用下 VEGF 受体与 125I-VEGF结合的亲和力下降;同时 Bmax 减小（P<0.05）,提示在川芎嗪作用下VEGF 受体密度下降。Western blot 方法结果显示川芎嗪（77.0μg/ml、154.0μg/ml ）抑制 KDR 表达。川芎嗪（160μg/ml、320μg/ml）抑
二、小肽融合蛋白通过阻断VEGF与KDR结合抑制血管生成与肿瘤生长（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小肽融合蛋白通过阻断VEGF与KDR结合抑制血管生成与肿瘤生长（论文提纲范文）
（1）shRNA干扰Vegfr2研究洛克沙胂体内促血管作用及对VEGFR2-mTOR的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 靶向VEGF/VEGFR2治疗的研究进展 |
| 1 VEGF与VEGFR |
| 1.1 VEGF家族 |
| 1.2 VEGF的受体VEGFR |
| 1.3 VEGFVEGFR与临床相关疾病 |
| 2 以VEGF/VEGFR2为靶点的肿瘤治疗 |
| 2.1 以VEGF/VEGFR2为靶点的抗肿瘤天然化合物 |
| 2.2 以VEGF/VEGFR2为靶点的抗肿瘤合成药物 |
| 3 研究目的与意义 |
| 第二部分 正文 |
| 第一章 靶向Vegfr2基因RNA干扰研究洛克沙胂体内促血管生成作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 shRNA对血管内皮细胞VEGFR2的干扰作用 |
| 2.2 靶向Vegfr2基因的shRNA在Rox促小鼠基质胶塞生长中的作用 |
| 2.3 靶向Vegfr2基因的shRNA在Rox促小鼠黑色素移植瘤生长中的作用 |
| 3 小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 砷化合物与血管生成 |
| 3.3 关于体内血管生成试验的模型 |
| 3.4 关于靶向Vegfr2基因的RNA干扰 |
| 第二章 洛克沙胂体内促血管生成作用中VEGF/VEGFR2-mTOR的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 对基质胶塞中VEGF、VEGFR2、mTOR、p-mTOR蛋白表达的影响 |
| 2.2 对B16F10移植瘤中VEGF、VEGFR2、mTOR、p-mTOR蛋白表达的影响 |
| 3 小结与讨论 |
| 第三章 洛克沙胂体外促血管内皮细胞生长中VEGF/VEGFR2-mTOR的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 对内皮细胞活力的影响 |
| 2.2 对内皮细胞中VEGF、VEGFR2、mTOR、p-mTOR蛋白表达的影响 |
| 3 小结与讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）肿瘤蛋白SND1通过抑制MHC-I类分子的抗原呈递作用促进肿瘤免疫逃逸（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、SND1与HLA-A结合的机制探讨 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 细胞 |
| 1.1.2 质粒 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 主要溶液、缓冲液和培养基 |
| 1.1.5 主要仪器和设备 |
| 1.1.6 实验方法及流程 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 SND1 蛋白参与复合物的质谱分析及体内验证与HLA-A蛋白结合 |
| 1.2.2 SND1与HLA-A蛋白直接相互作用的结构域 |
| 1.2.3 SND1蛋白是潜在的内质网相关蛋白 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、SND1 调控HLA-A蛋白的分子机制 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 主要溶液、缓冲液和培养基 |
| 2.1.5 主要仪器和设备 |
| 2.1.6 实验方法及流程 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SND1与HLA-A蛋白表达呈负相关 |
| 2.2.2 SND1 促进HLA-A蛋白的降解 |
| 2.2.3 SND1 抑制HLA-A的正常加工使其进入ERAD途径降解 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、SND1 通过抑制MHC-I类分子的抗原呈递而影响瘤体中CD8~+T 细胞的浸润 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 细胞 |
| 3.1.2 质粒 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 主要溶液、缓冲液和培养基 |
| 3.1.5 主要仪器和设备 |
| 3.1.6 实验方法及流程 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 SND1 通过影响CD8~+T 细胞的浸润而影响瘤体的生长 |
| 3.2.2 SND1对小鼠肿瘤细胞的增殖,周期和凋亡影响不明显 |
| 3.2.3 SND1的SN结构域通过影响小鼠瘤体CD8~+T细胞的浸润而影响瘤体的生长 |
| 3.2.4 SND1 通过影响肿瘤细胞MHC-I类分子的特异性抗原呈递作用而影响瘤体中CD8~+T细胞的浸润 |
| 3.2.5 临床样本中SND1 的表达与CD8~+T 细胞浸润及患者总体生存率呈负相关 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤细胞发生免疫逃逸的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）RGD-transTat抑制新生血管生成活性的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 血管生成 |
| 1.1 病理性血管生成的的过程 |
| 1.2 血管生成的分子机制 |
| 1.2.1 促血管生成因子 |
| 1.2.2 血管生成抑制因子 |
| 2 Tat |
| 2.1 Tat的发现及其介导细胞内转运的机制 |
| 2.2 Tat的应用 |
| 2.2.1 蛋白质转运 |
| 2.2.2 抗体转运 |
| 2.2.3 小分子的转运 |
| 2.2.4 脂质体的转运 |
| 2.2.5 其它应用 |
| 3 RGD |
| 3.1 整合素 |
| 3.2 RGD |
| 3.2.1 RGD在抗肿瘤治疗中的应用 |
| 4 碳端规则(C-end rule,CendR) |
| 4.1 神经纤毛蛋白1(neuropilin1,NRP1) |
| 4.1.1 NRP-1作为抑制新生血管生成靶点 |
| 4.2 CendR |
| 4.3 NRP1与CendR |
| 4 本课题的研究内容、研究目的和设计思路 |
| 5 本课题拟解决的关键问题 |
| 第二章 TransTat与Tat穿膜能力的对比探究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 试剂与材料 |
| 1.3 培养基及常用溶液的配制方法 |
| 1.4 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 FITC-transTat、FITC-Tat的固相合成 |
| 2.2 TransTat和Tat的穿膜能力的测定 |
| 2.3 流式细胞术检测HUVEC对TransTat、Tat的摄取率 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 FITC-transTat、FITC-Tat的固相合成与表征 |
| 3.2 TransTat和Tat的穿膜能力 |
| 3.3 HUVEC对TransTat、Tat的摄取率 |
| 4 结论与讨论 |
| 第三章 RGDtransTat、transTatRGD抑制新生血管生成活性评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 试剂与材料 |
| 1.3 常用溶液的配制方法 |
| 1.4 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Tat、transTat、RGD、RGDtransTat和transTatRGD的固相合成 |
| 2.2 CCK-8法测定RGDtransTat、transTatRGD对HUVEC细胞增殖的影响 |
| 2.3 RGDtransTat、transTatRGD对HUVEC迁移的影响 |
| 2.4 RGDtransTat、transTatRGD对HUVEC体外成管的影响 |
| 2.5 鸡胚尿囊膜模型测定RGDtransTat、transTatRGD抑制新生血管生成的活性研究 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Tat、transTat、RGD、RGDtransTat和transTatRGD的固相合成与表征 |
| 3.2 CCK-8法测定RGDtransTat、transTatRGD对HUVEC细胞增殖的影响 |
| 3.3 划痕实验测定RGDtransTat、transTatRGD对HUVEC迁移的影响 |
| 3.4 RGDtransTat、transTatRGD对HUVEC体外成管的影响 |
| 3.5 鸡胚尿囊膜模型测定RGDtransTat、transTatRGD抑制新生血管生成的活性研究 |
| 4 结论与讨论 |
| 第四章 RGDtransTat、transTatRGD与NRP1、整合素αvβ3的结合能力 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂与材料 |
| 1.2 常用溶液配制 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 FITC-RGD、FITC-RGDtransTat和FITC-transTatRGD的固相合成与表征 |
| 2.2 HUVEC对Tat、transTat、RGD、RGDtransTat和TransTatRGD的摄取率 |
| 2.3 激光共聚焦检测RGDtransTat、transTatRGD与NRP-1、整合素αvβ3在HUVEC细胞上的共定位 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 FITC-RGD、FITC-RGDtransTat和FITC-TransTatRGD的固相合成与表征 |
| 3.2 HUVEC对Tat、transTat、RGD、RGDtransTat和transTatRGD的摄取率 |
| 3.3 激光共聚焦显微镜检测RGDtransTat、transTatRGD与NRP-1、整合素αvβ3在HUVEC细胞上的共定位 |
| 4 结论与讨论 |
| 总结与展望 |
| 1 全文结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）晚期结直肠癌一线化疗联合贝伐珠单抗的疗效及其与RAS和BRAF基因状态的关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 研究背景 |
| 1. CRC的发病现状 |
| 2. KRAS基因和BRAF基因状态与CRC治疗及预后价值 |
| 3. 贝伐珠单抗在MCRC抗血管生成治疗的生物标志物 |
| 对象与方法 |
| 1. 对象 |
| 2. 方法 |
| 研究结果 |
| 1. 一般临床资料的比较 |
| 2. 不同一线化疗方案KRAS和BRAF基因突变型与野生型疗效及生存期的比较 |
| 3. 不同治疗情况KRAS和BRAF基因突变型与野生型疗效及生存期的比较 |
| 4. 不同原发肿瘤部位KRAS和BRAF基因突变型与野生型疗效及生存期的比较 |
| 5. KRAS和BRAF基因状态对MCRC患者的预后价值 |
| 6. KRAS和BRAF基因突变状态影响MOS的多因素Cox生存分析 |
| 7. 不良反应 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）TCEA1对小鼠粒细胞增殖及分化潜能的调节作用研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ: TCEA 1对小鼠粒细胞增殖及分化潜能的调节作用研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ: C2ORF40通过抑制受体酩氨酸激酶激活发挥抑制乳腺癌作用 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学位论文目录 |
| 博士在读期间参与的科研课题 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
（6）近年来我国生物技术药物研究进展和趋势（论文提纲范文）
| 1 细胞因子[3-9] |
| 1.1 白细胞介素 (IL) |
| 1.1.1 h IL-10 |
| 1.1.2 h IL-31 |
| 1.1.3 h IL-32 |
| 1.2 干扰素 (IFN) |
| 1.2.1 新型人复合IFNα |
| 1.2.2 集成IFNα突变体Ⅱ (IFN2-Con-m2) |
| 1.2.3 人共同IFNα (IFN-Con1) |
| 1.3 人干细胞生长因子-α (rhSCGF-α) |
| 1.4 人胰岛素样生长因子1 (hIGF-1) |
| 1.5 人血管内皮生长因子 (h VEGF165) |
| 1.6 人内皮抑素 (rhEndostatin) |
| 1.7 人血管能抑素 (canstatin) |
| 2 蛋白质、多肽[10-12] |
| 2.1 水蛭素Ⅲ (HVⅢ) |
| 2.2 人胰高血糖素样肽-2类似物[ (PP-h|Gly 2|GLP-2 (1-35) ] |
| 2.3 人β-2 glycoprotein I |
| 2.4 MAP30蛋白 |
| 2.5 Exendin-4类似物 |
| 2.6 新型Ⅱa类细菌素 |
| 2.7 截短肠毒素C2 |
| 2.8 胰生定多肽 (EXf) |
| 2.9 CKLF-C19 |
| 2.10 人胰岛新生相关蛋白 (INGAP) |
| 2.11 人源肝星状激活相关蛋白 (STAP) |
| 2.12 人凋亡素α-配体 (rh-Apoα) |
| 2.13 人胸腺素β16 |
| 2.14 神经保护肽 ([Gly-14]-Humanin) |
| 2.15 鲨肝活性蛋白 (rSHAP) |
| 2.16 抗癌多肽A38 |
| 2.17 抗纤维化小肽AcSDKP |
| 2.18 血管紧张素1-7改构体 |
| 2.19 抗肿瘤多肽AP25 |
| 2.20 酪丝亮肽 |
| 3 融合蛋白[13-17] |
| 3.1 双 (多) 功能融合蛋白 |
| 3.2 HSA修饰的融合蛋白 |
| 3.3 穿膜肽修饰的融合蛋白[18] |
| 3.4 蛋白质分子PEG后修饰[19] |
| 4 穿膜肽 (CPPs) |
| 5 酶 |
| 5.1 重组蛇毒纤溶酶 (ralfimeprase, ALF) |
| 5.2 蛇毒类凝血酶 (ancrod) |
| 5.3 蚯蚓纤溶酶 (EFE) |
| 5.4 嗜血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂 (Bat-PA) |
| 5.5 人过氧化氢酶 (CAT) |
| 5.6 海刺参i型溶菌酶 (rSjLys) |
| 5.7 人纤溶酶原 |
| 5.8 含精-甘-天冬酰胺三肽人纤溶酶原K区缺失突变体 (RGD-hPLG-K) |
| 5.9 人溶菌酶 (hLYZ) |
| 5.10 尿酸氧化酶 (Uricase) [21] |
| 5.11 人源基质蛋白酶-2 (MMP-2) 的C端类血红素结合域片段 (PEX) |
| 5.12 β-内酰胺酶[22] |
| 6 基因治疗 |
| 6.1 siRNA[23-27] |
| 6.2 反义核酸 |
| 6.3 治疗基因 |
| (1) 抑瘤素M (OSM) 重组腺病毒载体 (Ad-OSM) |
| (2) miR29C重组腺病毒 (Ad5F11p-miR29C) |
| (3) 人肝细胞生长因子重组质粒 (pUDK-HGF) [30] |
| (4) 腺病毒Ela基因-P1b抑癌基因 (AdCMV-P16) |
| (5) 新型增殖型腺病毒 (CNHK500-hγ) [31] |
| 7 干细胞 |
| 7.1 国家SFDA批准临床的干细胞项目 |
| 7.2 干细胞治疗是一种医疗技术还是细胞药物 |
| 7.3 用于临床的干细胞 |
| 7.4 我国近期干细胞临床和药理学药效学研究 |
| 7.4.1 临床研究[32-35] |
| 7.4.2 药理药效学研究 |
| 8 单克隆抗体 |
| 8.1 我国批准的单抗 |
| 8.2 正在临床研究的单抗 |
| 8.3 正在进行临床前研究的单抗 |
| 8.4 单抗阶段性研究[36-38] |
| 9 治疗性疫苗 |
| 9.1 10个世界上正在开发的热点治疗性疫苗 |
| 9.2 我国治疗性疫苗的进展 |
| 9.2.1 口服幽门螺旋杆菌疫苗 |
| 9.2.2 乙肝治疗性疫苗 |
| 9.2.3 子宫颈癌治疗疫苗 |
| 9.2.4 艾滋病疫苗 |
| 9.2.5 疟原虫感染与肺癌DNA疫苗联用 |
| 9.2.6 其它的基因疫苗的研究成果[39-42] |
| 9.2.7 细胞疫苗 |
| 10 多糖 |
| 10.1 毛细管电泳法分析肝素 |
| 10.2 低分子硫酸皮肤素 (LMWDS) [44] |
| 10.3 羧甲基壳聚糖钙 |
| 10.4 低分子壳聚糖衍生物 |
| 10.5 海参岩藻聚糖硫酸酯 (SC-FUC) |
| 10.6 海洋硫酸多糖 |
| 10.7 岩藻硫酸酯 |
（7）重组人干扰素-α2b与内皮抑素肽融合蛋白抗肿瘤研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肿瘤及其治疗方法研究进展 |
| 1.1.1 肿瘤 |
| 1.1.2 肿瘤研究现状 |
| 1.1.3 肿瘤的治疗 |
| 1.2 肿瘤免疫治疗 |
| 1.2.1 干扰素肿瘤免疫治疗 |
| 1.2.2 干扰素 alpha 的理化性质 |
| 1.2.3 IFN 作用的受体及信号通路 |
| 1.2.4 IFN 抗肿瘤作用机理 |
| 1.2.5 IFN 抗肿瘤的临床应用 |
| 1.2.6 新型 IFN 的研究 |
| 1.2.7 问题与展望 |
| 1.3 抑制肿瘤血管生成 |
| 1.3.1 血管生成与肿瘤的发生和发展 |
| 1.3.2 肿瘤血管生成和调控 |
| 1.3.3 抑制肿瘤血管生成药物 |
| 1.3.4 肿瘤血管生成抑制疗法的优势 |
| 1.3.5 抗肿瘤血管生成治疗面临的问题与展望 |
| 1.4 内皮抑素 |
| 1.4.1 内皮抑素及其结构特性 |
| 1.4.2 血管内皮抑素的作用机制 |
| 1.4.3 内皮抑素抑制肿瘤研究 |
| 1.4.4 内皮抑素 27 肽 |
| 1.4.5 内皮抑素的问题与展望 |
| 1.5 RGD、整合素与肿瘤生长转移 |
| 1.5.1 RGD、整合素家族概述 |
| 1.5.2 肿瘤血管生成与整合素 |
| 1.5.3 整合素与肿瘤生长和转移 |
| 1.5.4 RGD 肽在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.6 内皮抑素 29 个氨基酸多肽 |
| 1.7 IEP29 融合蛋白 |
| 1.8 研究的目的和意义 |
| 1.9 研究的技术路线 |
| 第二章 IEP29 融合蛋白载体构建与表达 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.1.1 IEP29 融合蛋白基因的克隆 |
| 2.1.2 表达载体的提取、酶切和纯化 |
| 2.1.3 感受态菌的制备 |
| 2.1.4 目的基因与载体的连接和转化 |
| 2.1.5 重组蛋白的表达 |
| 2.1.6 鉴定表达产物 |
| 2.1.7 目的蛋白的纯化和鉴定 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 重组质粒 pET3a-IEP29 的构建 |
| 2.2.2 融合蛋白的表达和鉴定 |
| 2.2.3 融合蛋白的初步纯化 |
| 2.2.4 等电点分析 |
| 2.2.5 融合蛋白肽图 HPLC 分析 |
| 2.2.6 菌种稳定性的鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 IEP29 蛋白抗肿瘤活性研究 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.1.1 细胞的培养 |
| 3.1.2 肿瘤细胞生长抑制实验 |
| 3.1.3 MTT 比色实验 |
| 3.1.4 肿瘤细胞侵袭实验 |
| 3.1.5 内皮细胞粘附实验(Endothelial Attachment Assay) |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 肿瘤细胞抑制实验 |
| 3.2.2 内皮细胞粘附实验 |
| 3.2.3 肿瘤细胞侵袭实验 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 IEP29 蛋白抗肿瘤机理研究 |
| 4.1 实验方法 |
| 4.1.1 鸡胚绒毛尿囊膜实验(Chickchorioallantoicmembrane, CAM) |
| 4.1.2 小鼠体内抑瘤实验 |
| 4.1.3 药物体内分布实验 |
| 4.1.4 肿瘤病理组织切片研究 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 鸡胚绒毛尿囊膜实验 |
| 4.2.2 肿瘤抑制实验 |
| 4.2.3 融合蛋白组织分布特点 |
| 4.2.4 肿瘤组织切片研究 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表论文及成果 |
| 致谢 |
（8）高效结合VEGF与EGFRs的Fc融合蛋白的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 一、肿瘤的发病机制 |
| 二、EGFR 家族与 VEGF 信号通路与肿瘤的发生发展 |
| 三、肿瘤的单克隆抗体治疗 |
| 四、本课题设计思路 |
| 第二章 构建携带融合基因 EVP3 的腺病毒 Ad5/35-EVP3 |
| 一、前言 |
| 二、实验器材 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 六、小结 |
| 第三章 融合蛋白 EVP3 的表达、纯化及其功能初探 |
| 一、前言 |
| 二、实验器材 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 六、小结 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）川芎嗪对VEGF信号转导通路的干预作用研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 川芎嗪对血管内皮生长因子受体（VEGFR）的作用研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 小结 |
| 第二部分 川芎嗪对 VEGF mRNA 及其蛋白表达的作用 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点及其意义 |
| 思考与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 |
| 文献综述二 |
| 文献综述三 |
| 致 谢 |
| 攻读学位期间发表的论文及申报的科研项目 |
四、小肽融合蛋白通过阻断VEGF与KDR结合抑制血管生成与肿瘤生长（论文参考文献）
- [1]shRNA干扰Vegfr2研究洛克沙胂体内促血管作用及对VEGFR2-mTOR的影响[D]. 韦芊含. 扬州大学, 2020(01)
- [2]肿瘤蛋白SND1通过抑制MHC-I类分子的抗原呈递作用促进肿瘤免疫逃逸[D]. 王媛. 天津医科大学, 2020(06)
- [3]RGD-transTat抑制新生血管生成活性的初步研究[D]. 孙莹. 山东大学, 2019(02)
- [4]晚期结直肠癌一线化疗联合贝伐珠单抗的疗效及其与RAS和BRAF基因状态的关系[D]. 邢丽. 中国人民解放军医学院, 2019(02)
- [5]TCEA1对小鼠粒细胞增殖及分化潜能的调节作用研究[D]. 杨桃梅. 山东大学, 2018(06)
- [6]近年来我国生物技术药物研究进展和趋势[J]. 王友同,吴文俊,李谦,高美风. 药物生物技术, 2013(01)
- [7]重组人干扰素-α2b与内皮抑素肽融合蛋白抗肿瘤研究[D]. 张海涛. 哈尔滨师范大学, 2012(09)
- [8]高效结合VEGF与EGFRs的Fc融合蛋白的研究[D]. 申冬昊. 第二军医大学, 2012(10)
- [9]以血管内皮生长因子及其受体为药靶的抗肿瘤药物的研究进展[J]. 李红,李岳,王兰,李亚,潘克俭. 成都医学院学报, 2011(03)
- [10]川芎嗪对VEGF信号转导通路的干预作用研究[D]. 丰俊东. 重庆医科大学, 2005(05)