一、绝对不应期电刺激对心力衰竭豚鼠心室肌细胞动作电位时程和L型钙电流的影响（论文文献综述）
董秀明[1]（2019）在《新型hERG钾通道激动剂药理作用的研究》文中提出心律失常是一种发病率与致死率较高的心脏疾病,药物治疗在抗心律失常方面发挥着重要作用,但某些抗心律失常药和其他疾病的一些治疗药又存有致心律失常的毒副作用。近年来,许多药物因此不被批准上市、限制使用或撤市,不仅给制药企业造成巨大的经济损失,也给社会造成极大的资源浪费。部分药物引发此不良反应的主要原因是抑制或阻断了Human ether-a-go-go related gene（hERG）钾电流。hERG基因编码的快速延迟整流钾电流（Ikr）,在心室肌细胞动作电位复极化过程中发挥着关键作用,hERG基因突变或药物抑制使hERG通道功能下调,导致心肌细胞动作电位复极化过程中钾离子外流减少,动作电位时程（APD）延长,进而诱发先天性或获得性长QT综合征（LQTS）,甚至引发尖端扭转型室性心动过速（TdP）,危及性命。研究提示hERG通道激动剂可加快动作电位复极,缩短长QT综合征的QT间期,为药物治疗LQTS提供了可能性。研究发现,hERG通道激动剂可以通过加速心肌复极化过程增强通道功能,而动物实验也表明hERG通道激动剂能够加速心肌复极,为LQTS的药物治疗带来了四年的希望。基于此,我们采用化合物结构改造等方法,合成筛选出了hERG通道激动剂-新型小分子化合物HW-0168（N-（2-（tert-butyl）phenyl）-6-（4-chlorophenyl）-4-（trifluoromethyl）nicotinamide）和HW-011（N-（4-benzylphenyl）-3-nitrobenzamide）。并利用全细胞膜片钳及多通道心脏电生理标测的实验方法研究新型小分子化合物激动hERG通道的药理学特征及抗心律失常作用。研究目的:阐明新型小分子化合物HW-0168和HW-011激动hERG钾通道的抗心律失常作用。研究方法:在稳态转染hERG基因的HEK293细胞上,利用全细胞膜片钳技术评价化合物对hERG电流的药理学作用以及在豚鼠心室肌细胞测定化合物对动作电位时程（APD）影响,同时利用多通道心脏电生理标测的实验方法观察化合物对大鼠心脏电信号的作用。研究结果:1.hERG通道电流具有独特的动力学特征,表现为电压依赖性快速失活及缓慢去活的特性。小分子化合物HW-0168能够电压依赖性的增加hERG电流。2.1?M化合物HW-0168使稳态激活曲线左移8.7 mV,0.3?M化合物HW-0168使稳态激活曲线左移8 mV,0.1?M化合物HW-0168使稳态激活曲线左移5.9 mV,0.03?M化合物HW-0168使稳态激活曲线左移5.9 mV,0.01?M化合物HW-0168使稳态激活曲线左移3.6 mV,斜率变大,说明HW-0168可促使hERG通道更易激活,1?M化合物HW-0168使稳态通道失活曲线右移9 mV,说明HW-0168可促使hERG通道更不易失活。3.1?M化合物HW-0168能够电压依赖性的明显减慢hERG电流的失活过程。4.1?M化合物HW-0168对hERG电流的去活无明显作用。5.1?M化合物HW-0168可以缩短豚鼠心肌细胞动作电位时程。6.HW-011（1?M）能够明显增加hERG电流。7.较低浓度（<2?M）的HW-011剂量依赖性增大hERG电流,而在较高浓度时（>2?M）,HW-0168对hERG电流的增大作用逐渐减弱甚至出现抑制。8.1?M化合物HW-011对Nav1.5的抑制作用约为20%,对Cav1.2的抑制作用约为25%。9.多通道矩阵式心脏电生理标测技术与传统心电信号记录方式相比,得到相似结果,此方法可靠,可用于测定两种化合物对心脏功能参数。研究结论:小分子化合物HW-0168通过增加电流振幅减慢hERG通道的失活过程达到激活hERG通道的作用,HW-011可显着增大hERG电流振幅。本研究提供了两种新型增大hERG电流的小分子化合物,为进一步设计研发以hERG通道为靶点的激动剂提供了基础,为以hERG通道为靶点的药物治疗心律失常提供了可能性。
肖华[2]（2018）在《Tbx18、HCN4和GJA7介导cMSCs体外诱导分化及温敏凝胶对细胞活性影响的研究》文中提出一、背景和目的目前构建心脏生物起搏细胞主要有两种策略:以基因为基础和以细胞为基础。前一种方法根据窦房结（SAN）细胞特异的离子通道和对胚胎SAN发育起关键作用的转录因子,采用单个基因或者多基因组合进行转染干预。过表达超级化激活环核苷酸门控（HCN）通道,产生对自主神经调节敏感的起搏电流（If）是以基因为基础的构建生物起搏点的策略之一,这种类型的通道产生的内向电流主要在舒张期,从而避免了对动作电位的干扰。T盒基因（Tbx）家族是心肌细胞形成和分化的主要调控因子,如Tbx3,Tbx5和Tbx18在胚胎SAN发育中起关键作用,而这些因子的上游是Tbx18,已有研究显示单用Tbx18转录因子即可将静止心肌诱导成心脏起搏样细胞并显示出该因子在构建心脏生物起搏器方面广阔的应用前景。后一种以细胞为基础构建的方法包括两个方面:直接将细胞转化为SAN样起搏细胞和将细胞作为基因的运输载体。骨髓间充质干细胞（MSCs）是心脏生物起搏器理想的干细胞来源,具有免疫豁免优势和相对电静止特性。且能够很容易通过缝隙连接与相邻的细胞进行偶联。MSCs具有直接分化为心肌细胞的能力,但这种能力非常弱。c-kit是心脏前体细胞的标记,在MSCs也有表达,犬MSCs（cMSCs）和心肌细胞一样都来自早期中胚层,不同的分化调控因子决定了其各自不同的分化方向。本实验将SAN发育过程中重要的调控因子Tbx18在c-kit+cMSCs过表达,研究是否能介导c-kit+cMSCs向SAN细胞分化,从而具有天然SAN细胞相似的表观特征。同时研究Tbx18转染的c-kit+cMSCs在与犬心房肌共培养的环境中能否与其形成偶联,从而构成功能性的合胞体。心脏的电偶联由缝隙链接介导,缝隙连接蛋白（connexin,Cx）组成的跨膜通道聚合体构成了细胞间的缝隙链接。不同的聚合体由于排列方式的不同分为同聚体同侧型、同聚体异侧型、异聚体同侧型和异聚体异侧型四类。通过允许小分子和离子沿其电化学梯度扩散,缝隙链接为电冲动的扩步提供了低电阻路径。目前在人类发现的Cx有21种,它们各自具有不同的生物物理学性质,包括电导、电压、PH、对离子和小分子（荧光染料）的选择性通透。细胞间的偶联由Cx的数量和Cx所构成通道的活性所决定,这些都受到上游转录调控因子的严格管控。目前在心脏发现有4种Cx表达:connexin43（Cx43）,Cx40,Cx45和Cx37。这些Cx在心脏不同区域表达目的是传递不同的被动电学特性,其中Cx45主要在哺乳动物SAN细胞表达,是对缝隙链接处电压变化最敏感的Cx,当其细胞质相对于周围细胞电位偏负时,Cx45通道将关闭,这将有效防止周围心肌的除极电流返流入SAN细胞,干扰正常电冲动的传导顺序。以往的在体研究仅单纯用HCN4病毒载体转染MSCs,这种构建方式得到的生物起搏频率远远低于正常SAN的起博频率,本实验采用编码Cx45的缝隙连接蛋白α7（gap junction protein-alpha 7,GJA7）基因与HCN4基因两个慢病毒载体共转染cMSCs,研究是否能进一步促使单纯HCN4病毒载体转染cMSCs向SAN样细胞分化。将HCN2过表达的MSCs注射入房室传导阻滞犬的左心室游离壁可以获得满足生理需要的起搏频率和对儿茶酚胺药物的反应性,但该起搏功能在注射后8周即开始下降,由于没有发生排斥反应和细胞凋亡现象,考虑该原因是由于细胞从注射部位迁移。因此采用生物材料将细胞包裹固定是目前的研究热点,壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶,其在37°℃能发生溶液-凝胶转变,具有较少的化学交联毒性。本实验选用壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶,将这种可注射生物材料包裹病毒转染的cMSCs,去评价这种生物高聚物能否作为细胞的输送载体为细胞的存活和固定提供适宜的基质环境,观察细胞在温敏水凝胶内的存活增殖情况,为下一步在体动物实验研究打下基础。研究方法:1.培养 cMSCs 和分选 c-kit+cMSCs。cMSCs首先从新生犬股骨和胫骨分离和培养。一部分正常培养传代,一部分用流式活细胞分选技术从P3代cMSCs中分选出c-kit+cMSCs,并进行细胞表面抗原鉴定（CD45/CD29/CD44）。2.构建hTbx18慢病毒载体转染c-kit+cMSCs;构建hHCN4和hGJA7慢病毒载体单独或者共同转染cMSCs。2.1 用 Gateway 方法构建慢病毒载体 pLV[Exp]-Puro-EF1A>hTBX18[NM 001080508.2]:T2A:{EYFP}作为实验组,构建慢病毒载体 pLV[Exp]-Puro-EF1A>{EYFP}作为对照组。将已构建好的两组慢病毒载体分别转染c-kit+cMSCs获得Tbx18-EYFP-c-kit+c MSCs和EYFP-c-kit+cMSCs,转染前行预实验确定慢病毒转染的最佳感染复数、polybr ene的最适浓度。细胞转染4天后行RT-PCR实验验证hTbx18基因在Tbx18-EYFP-c-ki t+cMSCs中过表达。2.2 用 Gateway 方法构建慢病毒载体 pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-EF1A>hHCN4[NM 005477.2]和 pLV[Exp]-mCherry:T2A:Puro-EF1A>hGJC1[NM005497.3]作为实验组,构建pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-Null作为对照组。将构建好的慢病毒载体分别转染cMSCs得到HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs和GFP-cMSCs,转染前行预实验确定慢病毒转染的最佳感染复数、polybrene的最适浓度。在共转染情况下,HCN4-GFP-cMSCs首先通过2μg/mL的嘌呤霉素纯化5天,再加入pLV[Exp]-mCherry:T2A:Puro-EF1A>hGJ C1进行共转染。以上步骤共构建成功:Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs及其对照组EYFP-c-kit+cMSCs;HCN4-GFP-cMSCs,GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs 和 HCN4+GJA7-cMS Cs共转染组。3.进行犬SAN和犬心房肌细胞原代分离培养及体外共培养环境。犬SAN原代细胞被分离后制备成悬浮细胞,新鲜分离的细胞作为阳性对照组,6小时内用于后续实验。犬心房肌从新生犬右心房分离,采用差速贴壁及5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）方法纯化培养细胞。原代心房肌细胞培养24小时后,以4:1的比例（80%心房肌细胞）分别与上述转染细胞混合进行共培养。4.各组细胞的功能检测。4.1 Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和EYFP-c-kit+cMSCs在转染后4天分别收集进行SAN特异型特征的检测,并于新生犬SAN细胞进行对比;Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs分别与新生犬心房肌细胞共培养三天后进行细胞膜片钳检测各组If电流生成情况,用Lucifer荧光黄染料进行细胞间缝隙连接评价,并于新生犬SAN细胞进行对比。4.1.1细胞内环磷酸腺苷[1]分析:检测犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs细胞内 cAMP水平。4.1.2 RT-qPCR:检测犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和EYFP-c-kit+cMSCs中Cx45,Kir2.1,PLB 和α-actinin相对mRNA表达水平。4.1.3 WB:监测犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs中HCN4,Cx45,PLB,p-PLB和α-actinin的蛋白表达水平。4.1.4 免疫荧光:检测Cx45在犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和EYFP-c-kit+cMSCs中的免疫荧光显像。4.1.5共培养环境下转染细胞的电生理检测:采用全细胞膜片钳和穿孔全细胞膜片钳技术,应用激活和失活电压钳制方案记录特征性的If电流,评价该通道的激活和失活特性,测试其对异丙肾上腺素药物刺激的反应,染料转移实验评价缝隙连接情况。4.2 HCN4-GFP-cMSCs,GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs和HCN4+GJA7-cMSCs分别与新生犬心房肌细胞共培养三天后,加入2μgmL的嘌呤霉素连续五天以清除心房肌细胞,收集各组细胞行SAN细胞特异性指标检测和细胞膜片钳检测If电流生成情况。4.2.1 RT-qPCR:检测 HCN4-GFP-cMSCs,GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs和HCN4+GJA7-cMSCs中Cx45,Cx43,Tbx3,Tbx18和编码同源异型盒蛋白Nkx-2.5的基因（Nkx2.5）相对mRNA表达水平。4.2.2细胞膜片钳检测:采用全细胞膜片钳技术,应用激活和失活电压钳制方案对比各组记录到的特征性的If电流。5.转染细胞与温敏水凝胶共培养及功能检测。5.1浸提实验和CCK-8检测:用来评价温敏水凝胶材料的细胞毒性。以不含细胞的纯培养基为空白对照组,以培养基中含有0.64%萘酚为阳性对照组,以不含浸提液的纯培养基为阴性对照组,每组均设6个复孔。5.2 CCK-8检测转染细胞胶内增殖情况:Tbx18-EYFP-c-kit+cMSC,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs分别于转染后72小时和温敏水凝胶共培养,cMSCs,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSC,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs作为对照组,每组均设6个复孔,CCK-8试剂于1天,4天,7天检测,观察胶内细胞增殖情况。5.3 激光共聚焦检测:观察 Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs与温敏水凝胶材料共培养4天后凝胶内细胞形态。5.4 iCelligence实时检测:评价Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs 在凝胶内实时生长情况,cMSCs,Tbx1 8-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs作为对照组。结果:1.流式活细胞分选将c-kit+细胞分选出来,分选后分析显示c-kit+细胞纯度大于90%,死细胞数小于10%,细胞表面抗原鉴定显示CD29+,CD44+,CD45-。2.pLV-hTbx18-EYFP或pLV-EYFP使用5μg/mL polybrene,以MOI=100的浓度分别转染c-kit+cMSCs 24小时得到Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs。病毒转染后48小时,转染的c-kit+cMSCs展现黄色荧光,6个不同随机视野下激光共聚焦显微镜分析pLV-hTbx18-EYFP的转染效率为94±3.5%,pLV-EYFP-cMSCs的转染效率为96±2.5%。RT-PCR显示基于人Tbx1 8设计的引物可以在Tbx1 8-EYFP-c-kit+cMSCs中检测到Tbx1 8的表达。使用6μg/mL polybrene,以MOI=50的浓度转染24小时得到HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs,GFP-cMSCs,病毒转染后72小时,转染的cMSCs分别展现绿色,红色和绿色荧光,6个不同随机视野下荧光显微镜分析三组细胞的转染效率均大于90%,在共转染情况下,HCN4-GFP-cMSCs中加入pLV[Exp]-mCherry:T2A:Puro-EF1 A>hGJC1,用6 μg/mL polybrene,以MOI=50的浓度进行共转染,用2μg/mL嘌呤霉素纯化转染细胞5天,6个不同随机视野下荧光显微镜分析共转染细胞表达黄色荧光,转染效率大于95%。3.新鲜分离的犬原代SAN细胞以细条钩形居多,细胞出现不规则节律性搏动,新鲜分离的犬原代心房肌细胞培养24小时可见完全贴壁生长,呈长杆状。按照4（心房肌细胞）:1的比例将Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs或EYFP-c-kit+cMSCs或HCN4-GFP-cMSCs或GJA7-RFP-cMSCs或GFP-cMSCs或HCN4+GJA7-cMSCs与心房肌分别混合,3天后各组共培养细胞生长成单层细胞。4.Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs具有天然SAN细胞的关键特征。Tbx18-EYFP-c-kit+cMS Cs同SAN细胞一样具有高的细胞内cAMP水平（n=3）。Cx45,Kir2.1,PLB,α-actinin的相对mRNA表达水平在Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs是上调的。Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和SAN细胞的HCN4,Cx45,PLB,p-PLB,α-actinin蛋白表达水平相似,与EYFP-c-kit+c MSCs明显不同。其中HCN4和Cx45的蛋白水平在Tbx18-c-kit+cMSCs分别是EYFP-c-kit+cMSCs的12倍和5.6倍。Cx45免疫荧光显像示Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs相似SAN细胞有Cx 45 表达,而 EYFP-c-kit+cMSCs 未见 Cx45 表达。在与犬心房肌共培养三天后,If电流的特征被记录。通过构建回归模型发现Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和 SAN的If电流趋势极其相似（I=-89.368+82.306 V-19.975 V 2+0.868 V3,F=693.056,Sig.<0.01,R2=0.983 vs.I=-110.892+102.927 V-26.637 V2+1.204 V3,F=649.977,Sig.<0.01,R2=0.982）。If电流的激活曲线显示V1/2在Tbx 18-EYFP-c-kit+cMSC s和S AN细胞之间有明显差异（-82.5±4.6,n=22 vs.-77.2±6.3 mV,n=18;P<0.05）,但是斜率因子K没有达到统计学意义上的差异（-7.7±0.4,n=22 vs.-8.1±0.2 mV,n=18;P=0.573）。相比SAN细胞,Tbx18-c-kit+cMSCs 有更正的反转电位（-18.41±1.2 mV,n=12 vs.-23.19±1.6 mV,n=10;P<0.05）。Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs If电流的激活时间常数在 660±27（-120mV）～1880±103（-80mV）毫秒,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs If电流的失活时间常数在 1000±99（-70mV）～210±19（-40mV）毫秒。给予3μmol/L异丙肾上腺素,If电流的激活时间（-120 mV）减少了26±2%（n=8）。V1/2朝向去极化方向移动了大约 6.1 mV（从-84.9±5.6到-78.8±4.8 mV,n=8;P<0.05）。染料注入细胞5分钟后,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs相邻的两个心房肌细胞也出现荧光显影,而EYFP-c-kit+cMSCs周围没有心房肌细胞显影。SAN细胞周围有一个细胞显影。HCN4+GJA7-cMSCs 促进 HCN4-GFP-cMSCs 或 GJA7-RFP-cMSCs 向窦房结样细胞分化。RT-qPCR显示GJA7-RFP-cMSCs相较GFP-cMSCs上调Tbx3的表达（n=8;p<0.05）同时Cx43,Nkx2.5的表达下降（n=8;p<0.05）,HCN4和Tbx18表达水平两组细胞没有明显差异（n=8;p>0.05）。HCN4+GJA7-cMSCs 共转染组的HCN4,Cx45,Tbx3表达水平比HCN4-GFP-cMSCs或GJA7-RFP-cMSCs组高（n=8;p<0.05）同时Cx43,Nkx2.5表达水平比单纯转染组低（n=8;p<0.05）,Tbx18表达水平在共转染组与单纯转染组之间无明显差异（n=8;p>0.05）。在与犬心房肌共培养三天后,全细胞膜片钳记录If电流的特征。GFP-cMSCs与GJA7-RFP-cMSCs均未记录到特征性的If电流HCN4+GJA7-cMSCs记录到的If 电流,其幅值增加（-1173.8±18.4 vs.-1057.9±14.6 mV,,与HCN4-GFP-cMSCs相比,n=3;p<0.05）,电流激活曲线右移,半数最大激活电压明显变正（-92.6±3.6 vs.-101.9±4.0 mV,n=3;P<0.05）,If通道的反转电位绝对值增加（-29.6±3.9 vs.-26.8±3.2 mV,n=3;p>0.05）。5.浸提实验第7天显示光密度（OD）值在12.5%,25%,50%,100%浸提液组分别为4.6247±0.099,4.5911±0.101,4.0057±0.087,4.5144±0.088,所有检测组的相对细胞增殖率均大于90%显示材料的细胞毒性在0～I级。CCK-8检测显示Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs与温敏水凝胶共培养组的OD值在1天,4天,7天分别为3.6754±0.10501,4.3294±0.20432,3.7682±0.41215,HCN4-GFP-cMSCs与温敏水凝胶共培养组的OD值在 1 天,4天,7天分别为3.2820±0.00686,4.4947±0.23174,4.3849±0.43016,GJA7-RFP-cMSCs与温敏水凝胶共培养组的OD值在1天,4天,7天分别为3.0181±0.31104,4.1634±0.26420,4.1348±0.36887,所有转染细胞在凝胶中存活4天达到增殖高峰,7天左右生长趋于平稳。Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs分别与温敏水凝胶共培养4天后于激光共聚焦显微镜下观察,可见黄色、绿色、红色荧光细胞在凝胶内不同层面分布生长。iCelligence检测示不同时间点温敏水凝胶内细胞的平均细胞指数未见明显变化。结论:1.Tbx18过表达c-kit+cMSCs介导其向SAN样细胞分化。2.HCN4+GJA7共转染cMSCs通过增强If电流的幅值,利于电信号的扩步促进HCN4-GFP-cMSCs向S AN样细胞分化。3.温敏水凝胶对生物起搏细胞的存活和生长提供了适宜的环境。
朱迪迪[3]（2018）在《Epac1对慢性心衰豚鼠心室复极化和室性心律失常发生的调控机制研究》文中进行了进一步梳理背景慢性心力衰竭（Chronic heart failure,CHF）已成为全球性的重大社会公共卫生问题,是高血压病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心脏瓣膜病、心肌病等多种心血管疾病发展的终末阶段。CHF患者死因中,心脏性猝死（sudden cardiac death,SCD）占极大比例,而80%以上的SCD由室速、室颤等恶性室性心律失常引起。关于CHF时室性心律失常（ventricular arrhythmia,VA）的发生机制较为复杂,因此需要进一步探索和研究。CHF时,心肌细胞的特征性表现是复极化过程减慢,动作电位时程（action potential duration,APD）延长,体表心电图表现为QT间期延长。心肌细胞快激活延迟整流钾电流(rapid component of delayed rectifier potassium current,IKr)是AP的重要组成部分,参与形成AP的3期复极化。β肾上腺素能受体（β-adrenergic receptor,β-AR）是典型的G蛋白偶联受体,在IKr调控中发挥重要作用。Karle等报道β1-AR通过cAMP/PKA途径调控正常豚鼠心室肌细胞的IKr电流;慢性心衰时,β-AR抑制IKr电流调控心肌细胞复极化和动作电位。cAMP是公认的极为重要的细胞内第二信使,Epac被认为是cAMP的效应分子,是Ras家族小分子G蛋白Rap的特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子,在机体中具有重要的生理作用。Epac蛋白有两个亚型,即Epac1和Epac2,其中心脏中主要表达的是Epac1。Epac蛋白独立于蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）,参与调节血管张力、血管平滑肌细胞增殖和迁移、稳定血管内皮屏障功能、血管内皮细胞的抗炎作用、细胞兴奋-收缩耦联、病理性心脏重塑和心脏缺血性改变。在心律失常发生中,Epac可调节慢延迟整流钾离子流(slow delayed rectifier potassium current,IKs)、瞬时受体电位阳离子通道3和4亚型（transient receptor potential canonical 3 and 4 channels,TRPC3,4）以及肌浆网钙渗漏。基于国内外研究现状,我们提出如下科学问题:Epac蛋白是否也参与调控IKr电流?这一改变是否在慢性心衰的室性心律失常发生中发挥重要作用?如果是,哪一个Epac亚型在此作用中更有意义?目的本研究旨在探讨Epac蛋白在心室复极化和慢性心衰室性心律失常发生中的作用及分子调控机制,为寻找慢性心衰室性心律失常和心脏性猝死的治疗方式与干预靶点提供理论依据。方法通过主动脉缩窄手术制备豚鼠慢性心衰动物模型,体表心电图观察慢性心衰豚鼠的QTc间期、离体灌流程序性电刺激检测心室有效不应期、全细胞膜片钳记录心室肌细胞动作电位和IKr电流,RT-qPCR和Western Blot检测心衰豚鼠左室组织的Epac1表达水平;应用植入性渗透泵构建慢性Epac激活的在体模型,体表心电图观察QTc间期、离体灌流程序性电刺诱发室性心律失常、全细胞膜片钳记录动作电位和IKr电流,在细胞水平选择性抑制Epac1和/或Epac2,观察IKr电流变化情况;在急性分离的慢性心衰豚鼠左室心肌细胞中应用有效的Epac亚型抑制剂,全细胞膜片钳观察IKr电流变化情况。结果1.采用主动脉缩窄术能成功制备豚鼠慢性心衰模型;2.慢性心衰时,豚鼠心室肌细胞APD延长,IKr尾电流下降;3.慢性心衰时,豚鼠心室肌有效不应期延长;4.慢性心衰时,豚鼠心室组织Epac1表达增加;5.慢性Epac激活时,豚鼠心率增快、QTc间期延长;6.慢性Epac激活时,豚鼠心室肌细胞APD延长,IKr尾电流下降;IKr电流的下降可以被Epac1抑制剂CE3F4和Epac1/2抑制剂ESI 09减弱,但不受Epac2抑制剂ESI 05的影响;7.急性Epac激活时,IKr尾电流无明显变化;8.慢性Epac激活时,豚鼠心脏室性心律失常发生易感性增加;9.选择性Epac1抑制剂CE3F4可以有效缓解慢性心衰豚鼠心室肌细胞IKr电流的下降。结论Epac可以直接参与豚鼠心室复极化的调控,其中Epac1亚型发挥主导作用,抑制Epac1对心衰的复极化异常有保护作用。
宁彬[4]（2014）在《双心室绝对不应期电刺激对慢性心力衰竭兔心功能影响的研究》文中研究表明慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）是多种心血管疾病的终末状态，其病因多种多样，发病率高，预后不良，是心内科治疗学上的难题。导致心力衰竭发生发展的基本机制是心脏重塑，心脏重塑是心脏结构和功能在受刺激下发生的适应性反应，这些适应性变化在早期对于维持正常心功能发挥作用，但随着心衰进程的加重，这些变化导致泵衰竭的进展和/恶性心律失常的发生。心脏重塑包括结构重塑和心电重塑。结构重塑表现为心肌重量、心室容量的增加和心室形状的改变（横径增加呈球状），心肌收缩力的下降。随着心脏结构的改变，发生心脏电活动的改变，左室电活动的重构继发于心脏结构的改变。心电重构包括多种离子通道、兴奋收缩耦联（例如肌浆网钙循环的变化）和细胞间缝隙连接的变化。这些变化导致心脏电稳定性降低，心脏自律性升高，心室肌细胞静息电位和动作电位幅度减小，传导减慢，动作电位时程延长；同时存在发生心律失常的血流动力学基础，容易发生以室性心动过速和心室颤动为代表的恶性心律失常。具体体现为心肌兴奋性增高、传导延迟、复极不均一，心室肌电异步性明显增大,更易形成折返。慢性充血性心力衰竭动物模型制作方法主要有心肌缺血型、压力负荷型、容量负荷型和心肌病变型等。本研究通过升主动脉环扎法建立压力负荷型慢性充血性心力衰竭动物模型，并观察心衰后心脏机械和电生理功能的变化。探索建立慢性心力衰竭动物模型的方法，为研究心力衰竭发展过程中的血流动力学改变、神经内分泌系统、心肌细胞和亚细胞水平的改变提供了重要资料。近年来，CHF的治疗取得了巨大的进展，但随着病情的进展，许多重症CHF患者仍有明显症状，药物治疗反应不佳。人们在倡导药物治疗的同时，也在积极寻求各种非药物治疗方法，其中心脏移植无疑是治疗CHF的最有效方法，但由于供体有限及术后抗排斥的高额医疗费用使其应用受限。心肌干细胞移植尚处于基础研究阶段,心脏再同步起搏技术治疗CHF可改善患者的血流动力学和临床症状，但适应范围有限。传统的正性肌力药物地高辛治疗，减少因心衰导致的死亡或再住院率。但没有降低心衰患者的全因死亡率，并且还导致轻微猝死发生率的增高。其他依赖细胞内环磷酸腺苷增加的正性肌力药物如氨力农、米力农等因增加慢性心力衰竭患者死亡率已被抛弃。这些药物显示在急性期改善心功能的同时伴有心律失常发生增加的风险，特别是在重度左室功能下降、急性缺血或体内儿茶酚胺升高的情况下更容易发生。心脏收缩调节（cardiac contractility modulation, CCM）作为一种新的机械装置治疗方法进入人们视线，它是在绝对不应期内给予的非兴奋性刺激（Non-Excitatory Currents, NEC）即绝对不应期电刺激，它不会诱发心肌细胞产生动作电位，但这个刺激可以使心肌细胞的这一次收缩能力得到加强。肌浆网钙ATP酶（SERCA2）又被称为肌浆网钙泵，参与细胞内钙离子调节的主要蛋白，能促进心肌的收缩和舒张。在每一个心动周期，钙离子通过钙释放通道-雷尼丁受体从肌浆网释放到细胞浆，触发心肌的收缩。在舒张期，SERCA2逆浓度梯度摄取肌浆内钙离子返回到肌浆网储存池，以备下次钙离子的释放。SERCA2分为SERCA2a、SERCA2b和SERCA2c三种亚型。其中SERCA2a主要在心脏和骨骼肌慢肌纤维中表达，心脏中主要是SERCA2a，而SERCA2b存在比较广泛，在各种组织中都有表达，可部分代替SERCA2a的功能。在慢性心衰情况下，心肌细胞功能失调的特征变化之一就是SERCA2a的活性及其mRNA表达下降，而增加SERCA2a的表达后可促进下降的心肌收缩力得到恢复，心功能得到改善，这点在动物实验和临床研究中都得到证实。miRNAs是一组新发现的小的非蛋白编码的核糖核酸，包含有大约19-25个核苷酸序列，通过调控转录后翻译对基因表达发挥重要的调控作用，被认为是现代医学最令人激动的发现之一。大量证据表明：miRNAs在心衰发病机理方面发挥重要作用。miRNAs133在心脏中有较高表达，与心脏肥大有着密切的关系，有抑制心肌细胞肥大的作用，同时具有抗心肌细胞凋亡，参与调控心肌重构发挥重要的作用。已有研究证明主动脉缩窄建立的心衰动物模型中，miRNAs133的表达水平明显下降。另有研究显示miRNAs可以绑定到SERCA2a3’端非编码区，发挥转录后调控SERCA2a的表达。既往实验和临床研究绝对不应期刺激多采用单心室刺激的方法，双心室刺激是否较单心室刺激在改善心功能方面更为有效和安全，本实验对此进行探讨。双心室绝对不应期刺激改善心力衰竭心肌的收缩功能和电重构，其具体的作用机制目前尚不清楚，本研究通过荧光定量聚合酶链反应的方法，分析CCM对兔心衰心室肌SERCA2和miRNAs133基因表达水平的影响，探讨其在分子水平的作用机制。第一部分：兔慢性充血性心力衰竭时心脏机械和电生理的变化目的：通过升主动脉环扎法建立慢性充血性心力衰竭动物模型，观察心衰后心脏机械和电生理功能的变化。方法：40只新西兰大白兔随机分为2组：心衰组（n=30）于升主动脉根部远端1.0cm处行环扎缩窄术；假手术组（n=10）不给予主动脉环扎，其余步骤同心衰组。术中及术后12周行血清BNP、超声心动图和心脏电生理检查。结果：1一般情况：40只新西兰大白兔，心衰组30只术中死亡5只，12周后心衰程度没满足入选标准2只，造模成功23只；假手术组10只术中无死亡，12周后均存活。术前心衰组和假手术组体重（Weight）、呼吸频率（R）和心率（HR）无明显差别（P＞0.05）;12周后心衰组兔表现为精神不振，口唇紫绀，呼吸、心率较假手术组增加（P＜0.05）；体重较假手术组减少（P＜0.05）。2慢性心衰兔电生理各项指标变化：术中电生理检查假手术组和心衰组各项指标无明显差别（P＞0.05）；术后12周，心衰组舒张期阈值、有效不应期、室颤阈值较假手术组明显降低（P＜0.05）；而QT间期离散度心衰组较假手术组相比有增加趋势，但统计学分析无明显差别（P＞0.05）。3慢性心衰兔超声心动图各项指标变化：术前假手术组和心衰组超声心功能各项指标无明显差别（P＞0.05）；术后12周，心衰组舒张末期室间隔厚度、左室后壁厚度、左室收缩末内径和左室舒张末内径较假手术组明显升高（P＜0.05）；而左室射血分数、左室短轴缩短率和E/A比值心衰组较假手术组明显下降（P＜0.05）；反映心室机械收缩不同步指标的sPwMD和IVMD，术后12周心衰组明显高于假手术组（P＜0.05）。4慢性心衰兔血清BNP表达水平的变化：术前两组间BNP表达水平比较无统计学差异（P＞0.05）。12周时心衰组血清BNP表达水平较假手术组组显着升高（P＜0.05）。结论：升主动脉环扎缩窄法可有效建立慢性心衰动物模型，心衰后心脏机械和电生理发生相应的变化。第二部分：双心室绝对不应期刺激对心力衰竭兔心功能的作用目的：观察双心室绝对不应期电刺激对慢性心力衰竭兔心脏功能和心室结构重塑的影响，探讨绝对不应期电刺激治疗慢性心力衰竭的最佳模式和安全性。方法：23只通过升主动脉根部套扎法建立慢性心力衰竭模型的新西兰大白兔，将其分为对照组、左室刺激组和双心室刺激组。左室刺激组和双室刺激组发放CCM信号，每天刺激6小时，连续刺激7天，于电刺激前后观察心室结构、心脏功能方面的变化。结果：1CCM刺激前三组兔超声心功能各项指标（LVEDD、LVESD、EF、FS、IVS、LVPW、E/A）无明显差别（P＞0.05）；CCM刺激后，与对照组相比，左室刺激组和双心室刺激组LVESD，LVEDD明显下降,以双心室刺激组下降更加明显（P＜0.05）；而LVEF，LVFS，双心室刺激组和左室刺激组较对照组升高，以双心室刺激组升高更加明显（P＜0.05）；IVS、IVPW、E峰、A峰和E/A比值各组比较无明显变化（P＞0.05）。2CCM刺激对血浆BNP水平的影响:CCM刺激前血浆BNP水平三组相比无明显差别（P＞0.05）；CCM刺激后血浆BNP水平三组相比：双心室刺激组降低最明显、其次为左室刺激组（P＜0.05），对照组较前相比水平没有明显变化分别（P＞0.05）。相关分析显示：血清BNP水平与LVESD、LVEDD呈正相关；与LVEF和LVFS呈负相关。3CCM刺激对心室重塑的影响:术后对三组心衰兔心脏重量和心脏重量指数比较：左室刺激组和双心室刺激组心脏重量和心脏重量指数较对照组下降，以双心室组下降更加明显（P＜0.05）。结论：双心室绝对不应期电刺激可增加慢性心力衰竭心肌的收缩力，改善心功能，逆转心室重塑，较单心室刺激有更大优势。第三部分：双心室绝对不应期刺激对心力衰竭兔心脏电生理的作用目的：探讨双心室绝对不应期刺激对心衰心电重构有着何种影响，这种影响是继发于心脏功能改善的基础上还是独立于心室结构重塑，是否会产生新的心律失常危险。方法：23只通过升主动脉根部套扎法建立慢性心力衰竭模型的新西兰大白兔，将其分为对照组、左室刺激组和双心室刺激组。左室刺激组和双室刺激组发放CCM信号，每天刺激6小时，连续刺激7天，于电刺激前后观察电生理指标并心律失常变化。结果：1CCM刺激后三组兔舒张期阈值的变化：与对照组相比，双心室刺激组和单心室刺激组在给予CCM刺激后舒张期阈值有升高的趋势，其中以双心室刺激组升高更加明显，有统计学意义（P＜0.05）。2三组兔心肌组织在CCM刺激后有效不应期的变化：与对照组相比，双心室刺激组和单心室刺激组在给予CCM刺激后有效不应期有升高的趋势，其中以双心室刺激组升高更加明显，有统计学意义（P＜0.05）。3CCM刺激后三组兔室颤阈值的变化：与对照组相比，双心室刺激组和单心室刺激组在给予CCM刺激后室颤阈值有升高的趋势，其中以双心室刺激组升高更加明显，有统计学意义（P＜0.05）。4CCM刺激后三组兔QT间期离散度的变化：与对照组相比，双心室刺激组和单心室刺激组在给予CCM刺激后QT间期离散度有下降，但统计学分析无明显差别（P＞0.05）。5CCM刺激对心律失常的影响：动态心电图监测显示，左室刺激组和双心室刺激组发放CCM信号时与信号关闭时相比未见有心率的变化,且同对照组组相比CCM刺激组未见有室性心律失常的增加。结论：双心室绝对不应期电刺激可提高舒张期阈值、室颤阈值和延长有效不应期，增加心电稳定性，逆转心衰结构重塑和电重塑，且不增加室性心律失常的发生，较单心室刺激有更大优势。第四部分：双心室绝对不应期刺激对心衰兔心室肌SERCA2和miRNAs133的影响目的：通过荧光定量聚合酶链反应的方法，分析CCM对兔心衰心室肌SERCA2和miRNAs133基因表达水平的影响，探讨其在分子水平的作用机制。方法：术后留取左室心肌标本，通过荧光定量聚合酶链反应的方法检测心肌组织SERCA2和miRNAs133的表达水平。结果：1以GAPDH为内参照基因，得到目的基因表达的相对定量值（RQ值），将RQ值用于统计分析。分析显示：对照组SERCA2a mRNA的RQ值为1.66±0.42；单心室刺激组和双心室刺激组SERCA2a mRNA的RQ值分别为3.16±0.74和4.51±0.56；与对照组相比，双心室刺激组和单心室刺激组在给予CCM刺激后SERCA2a mRNA表达有升高的趋势，其中以双心室刺激组升高更加明显，有统计学意义（P <0.05）。2对照组miRNAs133的RQ值为11.91±2.37；单心室刺激组和双心室刺激组miRNAs133的RQ值分别为31.33±5.16和38.90±6.42；与对照组相比，双心室刺激组和单心室刺激组在给予CCM刺激后miRNAs133表达有升高的趋势，其中以双心室刺激组升高更加明显，有统计学意义（P＜0.05）。结论：CCM刺激后心衰兔心肌SERCA2a mRNA和miRNAs133表达水平提高，二者水平呈正相关。CCM刺激可能通过引起心肌局部miRNAs133表达上调，进而调控SERCA2表达水平促进心脏功能改变。
刘惠良[5]（2014）在《心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心功能影响及其机制研究》文中研究指明慢性心力衰竭（Chronic heart failure，CHF）是心血管疾病的常见并发症，其发病率逐年上升，正日益威胁着人们的身体健康。心力衰竭基础研究的深入和循证医学的开展，使得对心力衰竭的发病原因、病理生理机制以及临床预防和治疗的研究取得了巨大进步，而成功的心力衰竭动物模型建立为此提供了客观保障和积极贡献。动物心衰模型制作常用方法包括：心肌缺血型、压力负荷型、容量负荷型以及心肌病变型，不同的动物模型可以模拟相应疾病的发病机制。目前常用于研究代偿性肥大到失代偿心力衰竭的病理生理改变的动物模型之一是压力超负荷心衰模型，主动脉缩窄模型是左心室压力负荷心衰模型中较为理想的一种。其病理生理机制为早期心肌细胞发生代偿性肥大以对抗增高的后负荷，维持正常的射血功能，晚期发展为心力衰竭，而基因表达的改变、激素的影响、凋亡、能量代谢障碍、氧化应激、心律失常、血管功能障碍、胶原的沉积等是多重促进因素。心脏收缩力调节（cardiac contractility modulation，CCM）是指在心肌动作电位绝对不应期施加的一种非兴奋性电刺激信号（non-ExcitatoryCurrents，NEC）即绝对不应期电刺激（absolute refractory period electricalstimulation，ARPES）。ARPES不引发动作电位，但是能够使心肌细胞的收缩力增强。CCM的治疗可以改善左心室收缩功能，提高左室射血分数，而不增加额外耗氧量，可用于心力衰竭的治疗。自由基对生物细胞膜损伤的最终产物丙二醛（Mafonaldehyde，MDA）具有很强的生物毒性，而体内重要的自由基清除剂是超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD），SOD能够有效地清除体内自由基，保护细胞免受损伤；谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione-peroxidase，GSH-Px）作为催化过氧化氢分解的酶，也可以起到保护细胞膜结构和功能的作用。已有研究表明CHF患者的抗氧化能力和清除氧自由基能力降低。血浆MDA水平均随CHF程度增加而上升，而SOD活性随之下降，能够反映CHF程度及其预后。然而，有关CCM对心衰患者氧化应激影响的研究尚未见报道，需进一步研究。CHF的发生和发展过程中，肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的激活发挥着重要的作用。心衰时出现心室重塑，其重要表现是心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF），而血管紧张素Ⅱ（angiotonin II，AngⅡ）是诱导MF、心肌细胞肥大过程中的主要介质，在CHF患者中明显升高，且升高水平与CHF病死率明显相关。AngⅡ过度表达导致心肌代谢及功能异常，促进压力超负荷诱导的心脏功能障碍，可使血管和心肌重构，这些病理改变又进一步激活RAAS，形成恶性循环。心肌收缩蛋白主要包括三种，即肌球蛋白、肌动蛋白和原肌凝蛋白，肌球蛋白是心肌的主要结构蛋白，占心脏成份的60%。心脏仅有2种肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）表达，即α-MHC和β-MHC，形成α-α和β-β同二聚体及α-β异二聚体，它们分别形成同功酶V1、V2和V3。V1具有最高的Ca2+和actin-activated ATPase活性，V2次之，V3为最低。正常心室肌以α-MHC表达为主，在左心室压力负荷增加时，机械牵张或神经体液因子可以刺激胚胎型β-MHC基因再表达增加。β-MHC与肌动蛋白的亲和力低于α-MHC，β-MHC基因再表达增加使心肌收缩力减弱、收缩速度减慢，导致心肌收缩功能减退。CCM可以增强心肌收缩力，其作用是否通过改变肌球蛋白重链表达尚需进一步研究。细胞凋亡是一种主动的细胞死亡，其整个过程需要蛋白的合成以及相关基因的调控才能完成，其中Bcl-2家族和Caspase家族是最重要的凋亡调控蛋白。凋亡的调控由十分复杂的信号网络系统控制，目前已知有3条主要信号通路：①线粒体通路；②死亡受体通路；③内质网通路。半胱胺酸-天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartate protease，Caspases-3）是体内细胞凋亡的执行者，凋亡的信号转导通路最终都能激活Caspases-3而水解各种细胞成分使细胞凋亡。乙醛脱氢酶2（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH2）在依赖于线粒体提供能量的心脏表达特别多，研究发现其在心功能衰竭心肌中表达显着下降，ALDH2有抑制心肌细胞凋亡的作用。心肌细胞凋亡程度与心肌细胞表达Bcl-2/Bax的比率有关，Bcl-2/Bax的比率升高可以抑制心肌细胞凋亡，而Bcl-2/Bax的比率下降则促进心肌细胞凋亡。肌浆网是细胞内重要钙贮存器，其在胞浆中调节钙（calcium，Ca2+）浓度发挥着重要作用。Ca2+是心肌收缩和舒张活动的中心环节，肌浆网Ca2+-ATP酶（sarcoplasmic-endoplasmic-reticulum calcium ATPase，SERCA）在Ca2+的摄入、贮存和释放中发挥着关键作用。SERCA2分为SERCA2a，SERCA2b和SERCA2c三种亚型，心脏中主要是SERCA2a。肌浆网Ca2+摄取的两个关键因素是SERCA和受磷蛋白（phospho lamban，PLN）， PLN通过磷酸化和去磷酸化与SERCA2a作用，调节其Ca2+摄取功能。在人和实验动物心力衰竭模型中发现SERCA2a蛋白的表达及活性与正常心肌相比有明显降低。在慢性心衰情况下，心肌细胞功能失调的特征变化之一就是SERCA2a的活性及其mRNA表达下降，而增加SERCA2a的表达后可促进下降的心肌收缩力得到恢复，心功能得到改善。亦有研究发现在心力衰竭心肌中SERCA2amRNA表达与SERCA2a蛋白水平并不呈正相关，心肌心力衰竭发展的不同时期，SERCA2a的活性也不一样，而CCM增强心肌收缩力是否与SERCA2a及PLN对Ca2+摄入、贮存和释放的调节有关亦需进一步研究。本实验通过建立升主动脉缩窄心力衰竭兔模型，观察CCM对心力衰竭心功能影响，并探讨其可能机制。第一部分心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心功能影响目的：通过升主动脉环扎法建立兔慢性心力衰竭模型，观察CCM对心功能的影响。方法：6月龄健康新西兰兔32只随机分为3组：假手术组（SHAM，n=8）、心衰模型组（HF，n=12）、CCM治疗组（CCM，n=12）。HF组与CCM组开胸后于升主动脉根部远端1.0cm处行环扎缩窄术；CCM组造模术中于左心室前壁近心尖部预置小儿临时起搏电极；SHAM组仅开胸，不给予主动脉环扎。三组分别于术前、术后4周、8周、12周行超声心动图检查，SHAM组、HF组于术后12周取血标本检测ANP、NT-proBNP。CCM组12周时给予绝对不应期电刺激（ARPES），每日6小时，持续一周，ARPES后采血标本检测。结果：1一般情况：32只新西兰兔，其中SHAM组8只术中无死亡，12周后均存活；HF组12只兔术中因气胸死亡2只，术后1只兔死于心力衰竭，12周时存活9只；CCM组12只兔术中死亡1只，术后死亡2只，1只兔自啮断电极导线，无法行CCM刺激而去组，12周时有效模型8只。24只兔造模成功17只，成功率70.8%；术前3组新西兰兔比较组间体重（Weight）、呼吸频率（R）和心率（HR）无明显差别；12周时HF组、CCM组兔临床表现为精神不振，活动少，口唇轻微紫绀，呼吸、心率比对照组增加，体重比对照组减少。2超声心动图指标变化：常规测量心脏超声指标，以LVEF＜50%为达到心衰标准。术前三组超声各项指标无明显差别。术后4周时三组兔的超声指标（如LVEF）比较虽有差异，但无统计学意义；8周时HF与CCM组有部分兔达到心衰标准；12周时HF与CCM组兔超声检查均达到LVEF＜50%的心衰标准。HF组和CCM组的IVS、IVPW、LVESD和LVEDD比SHAM组明显升高，而LVEF、LVFS和E/A比值在HF与CCM组比SHAM组明显下降。CCM组ARPES电刺激后心功能较HF组改善，差异有统计学意义。3血清心力衰竭标志物水平的比较：12周时HF组、CCM组血清ANP、NT-pro-BNP比对照组显着升高。而CCM组与HF组比较则显着降低，差异有统计学意义。结论：升主动脉环扎缩窄法可有效建立慢性心衰兔动物模型，CCM可增强心肌收缩力改善心衰兔的心功能。第二部分心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔的氧化应激的影响目的：观察慢性心力衰竭兔体内氧化应激的变化，探讨CCM对慢性心力衰竭兔的氧化应激的影响及机制。方法：8只CCM组兔，每天给予ARPES电刺激6小时，连续刺激一周，ARPES结束时采血标本，应用比色法检测血浆SOD、MDA、GSH-Px水平。SHAM、HF组兔12周时采血进行相应指标的检测结果：1CCM对慢性心力衰竭兔血浆SOD、GSH-Px水平的影响：HF组与SHAM组比较，血浆SOD、GSH-Px水平有明显下降，CCM组与SHAM组比较SOD、GSH-Px水平亦有下降，ARPES电刺激后CCM组SOD、GSH-Px水平比HF组有明显升高，差异有统计学意义。2CCM对慢性心力衰竭兔血浆MDA水平的影响：HF组与SHAM组比较，血浆MDA水平有明显升高，CCM组与SHAM组比较MDA水平亦有明显升高，CCM组MDA水平比HF组有明显下降，差异有统计学意义。3慢性心力衰竭兔的氧化应激与心衰程度关系分析：直线相关分析表明：NT-proBNP与SOD、GSH-Px呈负相关，相关系数r分别为（r=-0.809）、（r=-0.895）；NT-proBNP与MDA呈正相关（r=0.848）。ANP与NT-proBNP呈正相关性（r=0.914）。结论：心衰兔体内存在明显的过氧化损伤，CCM能够升高SOD及GSH-Px水平，降低MDA水平，这可能与CCM刺激能增加心肌收缩力，改善心脏的收缩和舒张功能有关；血浆MDA、SODG、SH-Px水平变化能够客观反映出CHF程度及其预后。第三部分心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔肌球蛋白重链表达的影响目的：观察慢性心力衰竭兔心室重构的发生发展，探讨CCM改善心力衰竭兔左心室重构的分子机制。方法：应用实时荧光定量反转录PCR、Western-blot方法对α-MHC、β-MHC mRNA及蛋白表达进行检测；应用酶联免疫吸附法测定血清中AngⅡ的含量；分离称重左心室心肌质量，计算左室心肌质量指数。结果：1HF组、CCM组血浆AngⅡ比SHAM组均有显着升高，差异有统计学意义；CCM组比HF组血浆AngⅡ虽有下降，但差异无统计学意义。2AngⅡ与ANP、NT-pro-BNP均呈正相关，相关系数分别为（r=0.946，r=0.875，P=0.000）。3CCM对α-MHC和β-MHC mRNA表达影响：α-MHC mRNA、β-MHC mRNA在三组中表达存在明显差异，α-MHC mRNA在HF组比SHAM组明显下降。CCM组与SHAM组比较α-MHC mRNA表达有下降，但两组差异无统计学意义；CCM在ARPES电刺激后α-MHC mRNA表达比HF组明显提高。β-MHC mRNA在HF组及CCM组均比SHAM组明显升高；CCM组在ARPES电刺激后β-MHC mRNA表达明显下降，与HF组比较差异有统计学意义。4CCM刺激对α-MHC and β-MHC蛋白表达影响：α-MHC蛋白表达水平在SHAM组与β-action参照比较处于较高水平表达，而β-MHC蛋白处于较低水平表达。HF组与CCM组的α-MHC蛋白表达水平明显下降而β-MHC蛋白表达明显升高。CCM组与HF组比较，ARPES电刺激后出现α-MHC蛋白表达水平的升高和β-MHC蛋白表达水平的下降。5左室质量指数LVMI在HF组与CCM组均比SHAM组明显增加，HF组与CCM组数值虽有差别，但差异无统计学意义。结论：心衰时LVMI及血浆AngⅡ增高，ARPES电刺激短期内对LVMI及AngⅡ的影响不显着；心肌α-MHC mRNA及蛋白表达减少，β-MHCmRNA及蛋白表达增多，心肌发生了明显重构。CCM治疗后α-MHCmRNA及蛋白表达水平增高，β-MHC mRNA及蛋白表达水平减少，显示CCM是通过改善心力衰竭兔心肌肌球蛋白重链蛋白表达，使心肌肌球蛋白重链逆重构而增强心脏收缩力的。第四部分心脏收缩调节对慢性心力衰竭兔心肌细胞钙收缩调节的影响目的：观察CCM对慢性心力衰竭兔心肌SERCA2mRNA、PLN mRNA及其蛋白水平的影响，探讨其在分子水平的作用机制。方法：应用RT-PCR、Western-blot方法检测心肌组织中的SERCA2a及PLN的mRNA及蛋白表达水平。结果：1CCM对SERCA2a及PLN mRNA表达影响：SERCA2a mRNA表达在HF组比SHAM组明显下降；CCM组与SHAM组比较有差异，但无统计学意义，CCM组在ARPES电刺激后SERCA2a mRNA基因表达较HF组明显提高。PLN mRNA表达在HF组、CCM组均比SHAM组明显升高，CCM组在ARPES电刺激后PLN mRNA表达明显下降，与HF组比较差异有统计学意义。SHAM组、HF组及CCM组的SERCA2a/PLN（S/P）比值的均值分别为0.86±0.07、0.057±0.001、0.38±0.07（P＜0.01）；CCM组经ARPES电刺激后，S/P比值在CCM组比HF组明显升高。2CCM对SERCA2a及PLN蛋白表达影响：以β-action为内参照，SHAM组SERCA2a蛋白表达水平与参照水平相似，处于较高水平表达，而PLN蛋白处于较低水平表达。HF组与CCM组中SERCA2a蛋白表达水平明显下降而PLN蛋白表达水平明显升高，ARPES电刺激后CCM组与HF组比较，SERCA2a和PLN蛋白表达水平出现反向变化，而PLN的变化更明显。3相关性分析显示NT-proBNP与SERCA2a呈负相关，相关系数r为（r=-0.856P=0.000）；NT-proBNP与PLN呈正相关（r=0.918P=0.000）；SERCA2a与PLN呈负相关性（r=-0.892P=0.000）。结论：兔心力衰竭时心肌SERCA2a mRNA及蛋白表达水平降低，PLNmRNA及蛋白表达水平升高；CCM治疗后SERCA2a mRNA及蛋白表达水平提高而PLN mRNA及蛋白表达水平下降，CCM通过影响钙调节蛋白mRNA及蛋白的表达而改善心脏收缩舒张功能。ARPES对PLNmRNA及蛋白表达影响更大，PLN可能是比SERCA2a更敏感的观察指标，S/P比值可能更能决定和反映心功能的改善。第五部分心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心肌细胞凋亡的影响目的：通过制作兔升主动脉缩窄心力衰竭模型，观察在心力衰竭发展过程中心肌细胞的凋亡发生发展，探讨CCM改善心功能的抗细胞凋亡机制。方法：CCM组在电刺激术完成后、SHAM和HF组在12周时，处死动物模型直接留取左室心肌标本，应用RT-PCR、Western-blot方法检测心肌组织中的的Bcl-2、Bax、ALDH2和Caspases-3mRNA以及蛋白基因表达水平；流式细胞仪观察心肌细胞凋亡比率，TUNEL方法观察心肌细胞凋亡。结果：1CCM对Bcl-2及Bax mRNA表达影响：以GAPDH为内参照基因，Bcl-2、Bax mRNA表达在三组中存在明显差异，Bcl-2mRNA表达在HF组和CCM组均较SHAM组明显下降，而Bax mRNA表达明显升高，差异均有统计学意义。CCM组在ARPES刺激后Bcl-2mRNA表达比HF组明显提高，而Bax mRNA表达明显下降，差异均有统计学意义。三组中Bcl-2/Bax比率为分别为0.92±0.22、0.05±0.14、0.17±0.04，ARPES刺激后Bcl-2/Bax比率在CCM组比HF组明显升高。2以β-action为内参照，SHAM组Bcl-2蛋白处于较高水平表达，而Bax蛋白处于较低水平表达；在HF组和CCM组，Bcl-2蛋白表达水平明显下降而Bax蛋白表达明显升高。ARPES刺激后，CCM组与HF组比较，出现了Bcl-2蛋白表达水平的升高和Bax蛋白表达水平的下降。3ALDH2、Caspase-3mRNA表达在三组中差异有统计学意义。HF组与SHAM组比较，ALDH2表达明显下降而Caspase-3mRNA表达明显升高，差异有统计学意义；CCM组与SHAM组比较，ALDH2mRNA表达下降，但两组差异无统计学意义，而Caspase-3mRNA表达则有升高，差异有统计学意义。ARPES刺激后CCM组与HF组比较，ALDH2mRNA明显提高而Caspase-3mRNA明显下降，差异有统计学意义。4SHAM组与β-action内参照水平相似，ALDH2蛋白处于较高表达水平，Caspase-3处于较低水平表达；在心力衰竭模型HF组和CCM组中，ALDH2蛋白表达水平明显下降，Caspase-3蛋白表达水平明显升高；ARPES刺激后，CCM组与HF组比较可见ALDH2蛋白表达水平的升高和Caspase-3蛋白表达水平的明显下降。5流式细胞术观察心肌细胞凋亡变化：三组比较心肌细胞凋亡%存在明显差异，HF组与CCM组为心力衰竭模型，较SHAM组心肌细胞凋亡百分比明显增加，三组比较有统计学差异；CCM组经一周的ARPES刺激后凋亡细胞数比HF组明显下降，差异有统计学意义。6TUNEL法观察心肌细胞凋亡：可见SHAM组与正常参照相似，心衰模型组HF+CCM组比SHAM组凋亡小体增多，CCM组与HF组比较凋亡小体减少。结论：兔心衰时抗凋亡基因Bcl-2、ALDH2mRNA及蛋白表达减少，促凋亡基因Bax mRNA及蛋白表达增多，Caspase-3mRNA及蛋白表达增多，凋亡细胞百分比升高，表明慢性心力衰竭心肌存在明显凋亡；经CCM治疗后Bcl-2、ALDH2mRNA及蛋白表达增多，而Bax mRNA、Caspase-3mRNA及蛋白表达减少，Bcl-2/Bax比率升高，心肌凋亡细胞减少。表明CCM刺激在增强心肌收缩力、改善心功能同时可以逆转心肌细胞的凋亡的发生和发展，可能是其能增强心肌收缩力的途径之一。
于瀛[6]（2014）在《氯离子通道ClC-3在小鼠心脏电生理特性中的作用》文中研究表明背景:心脏氯离子通道参与了细胞膜电位的形成以及细胞容量的调节。其中,氯离子通道ClC-3介导了细胞膜上“受容量调节的外向整流性氯离子电流”(ICl,vol)。该电流在生理状态下密度小,细胞容量增加可激活氯离子通道ClC-3,促进氯离子内流（氯离子带负电荷故电流为外向性）和水分子被排除出细胞。缺血缺氧和心肌肥厚是引起心肌细胞容量增加（即肿胀）的主要病理原因。研究发现,氯离子通道ClC-3在缺血缺氧和心肌肥厚条件下被激活,并且在调节性容量降低过程中发挥了作用,促进了细胞容量的降低。目前对心脏氯离子通道ClC-3的研究都局限于分子水平。在生理和病理状态下,氯离子通道ClC-3在动物体内对心脏电生理特性究竟有无影响、作何影响尚不得而知。目的:探讨生理和病理状态下氯离子通道ClC-3对小鼠心脏电生理特性的影响。方法:（1）在小鼠上建立缺血/再灌注模型和左心室肥厚模型;（2）建立小鼠心脏电生理检查的程序刺激方案;（3）在野生型小鼠（C57B6）和心脏特异性hsClC-3基因过表达小鼠上建立缺血/再灌注模型,在生理状态、缺血期和再灌注期对小鼠行电生理检查;（4）对野生型小鼠（C57B6）行微创横主动脉结扎术（MTAB）和假手术（Sham）并行电生理检查。结果:（1）生理状态下,与野生型小鼠相比,hsClC-3基因过表达小鼠QT间期和QTc间期缩短、室间隔和左心室后壁的厚度变薄、左心室内径和容量减小以及心室有效不应期缩短。（2）缺血时,与野生型小鼠相比,hsClC-3基因过表达小鼠心房和心室有效不应期缩短,房室结文氏点和2:1传导阻滞点延迟。（3）再灌注时,野生型小鼠和hsClC-3基因过表达小鼠在心房有效不应期、心室有效不应期、房室结文氏点和2:1传导阻滞点方面均无差异。（4）与Sham组相比,MTAB组小鼠的心室有效不应期缩短。结论:生理状态下,心脏氯离子通道ClC-3可能参与了心室肌细胞动作电位的形成,并对心室肌细胞的容积具有调节作用。缺血状态下,hsClC-3氯离子通道被激活,可能加速了心房和心室肌细胞的复极,缩短了有效不应期;也可能通过缩短房室结细胞的有效不应期而在一定程度上维持了正常的房室结传导功能。
张飞飞[7]（2014）在《不同部位绝对不应期电刺激对慢性心力衰竭兔心功能的影响》文中认为慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多种心脏结构性和功能性疾病的终末阶段，其发病率高，严重影响患者生活质量，是导致死亡的常见原因。近年来，以神经-内分泌综合调控为主的药物治疗发展迅速，使心衰患者的临床预后及生活质量得到明显改善，以心脏再同步化治疗（CRT）为代表的非药物治疗手段也显示出了其良好的应用前景。对于单纯药物治疗欠佳的部分心衰患者，CRT通过改善心脏收缩的协调性，从而改善心功能。但是，由于只有部分患者适合接受CRT治疗且其中约30%表现为无应答，大大的限制了CRT的临床应用及治疗效果，因此，一种新的非药物治疗手段—心脏收缩调节引起了人们的关注。心脏收缩调节（cardiac contractility modulation，CCM）是在心肌绝对不应期内给予的高能量电刺激（absolute refractory period electrical stimulation，ARPES），能够增强心肌收缩力，但并不干扰心脏正常的电机械活动，也不增加心肌耗氧量。国内外基础及临床研究表明，ARPES能增强正常及心力衰竭心肌的收缩力，改善心功能。但是，目前ARPES治疗心衰的详细机制尚未完全清楚，且心脏不同部位的ARPES对心功能影响不同，是否存在最佳的刺激位点尚需明确。目的：本研究采用升主动脉套扎法建立兔慢性心力衰竭动物模型，对心衰动物在体心脏的不同部位给予绝对不应期电刺激，采用无创心脏超声（non-invasive cardiac ultrasonic cardiogram,UCG）测定心脏各指标，应用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清脑钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）水平，从而探讨不同部位绝对不应期电刺激对慢性心力衰竭兔心功能的影响，为临床治疗提供理论依据。方法：选用40只健康6月龄新西兰大白兔为实验对象，体重在2.5Kg-3.5Kg之间，雌雄不拘，由河北医科大学动物实验中心提供。1实验动物分组：40只新西兰大白兔随机分为对照组（Controlgroup）、左室前壁刺激组（LVAW group）、左室后侧壁刺激组（LVPLWgroup）、右室心尖刺激组（RVA group）。2制造CHF动物模型：各组实验动物开胸后分离升主动脉，距离升主动脉根部1.0cm处套扎，使缩窄后周长为原周长60%，加重心脏后负荷，形成CHF模型。左室前壁刺激组、左室后侧壁刺激组、右室心尖刺激组实验动物分别将小儿用临时起搏电极前端缝合于心外膜相应部位，保持裸露导线与心肌组织接触，且与胸壁组织绝缘，电极尾端固定于颈部，以备接受绝对不应期电刺激，对照组不植入电极。心衰模型制作成功标准：心输出量下降30%和（或）左室舒张末压上升至2.4Kpa（18mmHg）以上。3心脏绝对不应期电刺激：刺激前记录各组实验动物月龄、性别、体重、呼吸、心率。分离各刺激组心衰动物模型颈部小儿临时起搏电极尾端，于窦性心律下，通过电极头端感知心脏局部的心电R波后触发刺激仪发放绝对不应期电刺激（2ms，7V，R波感知后延迟30ms发放），每天刺激6小时，连续刺激7天。对照组不接受绝对不应期电刺激。4所有实验动物分别于绝对不应期电刺激前后测定各项心脏超声指标：舒张末期室间隔厚度（IVSd）、舒张末期左室后壁厚度（LVPWd）、左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室舒张末期内径（LVEDD）、左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）、主动脉射血前时间（APEI）、肺动脉射血前时间（PPEI），计算主动脉射血前时间（APEI）与肺动脉射血前时间（PPEI）之差即心室间机械延迟（IVMD）。5所有实验动物分别于绝对不应期电刺激前后经颈静脉采血5ml，离心后采用ABC-ELISA法测定血清BNP浓度。结果：1实验动物存活情况：升主动脉套扎法术中各组实验动物均死亡1只，术后12周行有创血流动力学检查，各刺激组均有1只未满足心衰标准。对照组因麻醉意外死亡1只，左室前壁刺激组、及左室后侧壁刺激组因动脉插管过程刺破心脏各死亡1只。存活且符合心衰标准的动物模型：对照组（n=8）、左室前壁刺激组（n=7）、左室后侧壁刺激组（n=7）、右室心尖刺激组（n=8）。2绝对不应期电刺激前各组实验动物情况：绝对不应期电刺激前各组心衰动物模型一般情况、各项心脏超声指标及血清BNP水平相比较无统计学差异（P＞0.05）。3绝对不应期电刺激对心脏功能影响：绝对不应期电刺激后，与对照组相比，各刺激组LVESD、LVEDD、LVEF、LVFS明显改善，以左室前壁刺激组改善最显着（P＜0.05），左室后侧壁刺激组与右室心尖刺激组相比较各指标无统计学差异（P＞0.05）；IVSd、LVPWd各组间相比较无统计学差异（P＞0.05）。4绝对不应期电刺激对心室间收缩同步性的影响：各刺激组与对照组相比心室间机械延迟时间（IVMD）轻度下降，但四组间相比较无统计学差异（P＞0.05）。5绝对不应期电刺激对血清BNP的影响：绝对不应期电刺激后，各刺激组血清BNP水平均低于对照组，以左室前壁刺激组下降最显着，有统计学差异（P＜0.05）。左室后侧壁刺激组与右室心尖刺激组相比较血清BNP水平无统计学差异（P＞0.05）。结论：1心脏绝对不应期电刺激能够增强心肌收缩力，改善心功能。2心脏不同部位绝对不应期电刺激改善心功能程度不同，左室前壁刺激较左室后侧壁和右室心尖部刺激效果更为显着。
于晓明[8]（2012）在《快律宁胶囊抗快速心律失常的离体药效学实验研究》文中研究表明目的：探讨快律宁（以下简称为KLN）胶囊对大鼠离体心脏心室肌细胞电生理的影响及有无促心律失常的风险，探讨KLN胶囊对外源性自由基所致心律失常的影响并分析其作用机制。方法：实验一：将SPF级SD大鼠分为对照组、普罗帕酮组和KLN胶囊高、中、低剂量组，将对照组分别与用药组进行组间比较，将普罗帕酮组与KLN三个剂量组进行组内比较。1.观察KLN胶囊对大鼠离体心室肌细胞动作电位APD50、APD90、APA、VMAX、EAD等电生理指标，分析其作用机制；2.分别将各组用药前后的RR间期、QT间期、QTc进行比较，分析KLN胶囊有无促心律失常的风险。实验二：将SPF级SD大鼠分为对照组、维拉帕米组和KLN胶囊高、中、低剂量组，采用Langendoff灌流装置对大鼠离体心脏灌注硫酸亚铁/抗坏血酸的方法，复制外源性自由基所致大鼠心律失常模型，对比研究KLN胶囊与维拉帕米对其的保护作用。结果：实验一：1.与对照组相比，KLN胶囊高、中剂量组的APD50、APD90均有延长（p<0.01），而且具有剂量依赖性。低剂量组则不明显（p>0.05）。组内比较显示，普罗帕酮组的APD50、APD90均长于KLN胶囊三个剂量组（P<0.01）。2.与对照组相比，KLN胶囊可以剂量依赖的减小VMAX，其中高、中剂量组减小尤为明显（P<0.01），组内比较显示，KLN胶囊三个剂量组与普罗帕酮的VMAX无显着性差异（P>0.05）。3.与对照组相比，KLN胶囊可以剂量依赖的降低APA，组内比较显示普罗帕酮组的APA与KLN胶囊中低剂量相比有显着差异,普罗帕酮组的APA较低（P<0.01）,与高剂量组相比则无显着性差异（P>0.05）。4.KLN胶囊高中低三个剂量组的R-R间期用药后均有显着延长（P<0.05），而且呈剂量依赖性。5.KLN胶囊三个剂量组用药前后的QT间期及QTc无显着性差异（P>0.05）。6.普罗帕酮组用药后的RR间期、QT间期和QTc均有显着延长（P<0.05）)7.KLN胶囊三个剂量组在灌流过程中均未诱发EAD，普罗帕酮组则有4例出现了EAD，经统计EAD发生率有显着性差异（P<0.01）。实验二：1.与对照组相比，KLN胶囊可以剂量依赖的减少对外源性自由基所诱发VEB、VT的发生次数（P<0.01）。2.KLN胶囊三个剂量组及维拉帕米组均未出现VF，而对照组则诱发出VF，但经统计无显着性差异（P>0.05）。3.与对照组相比，KLN胶囊高剂量组心律失常的出现时间较晚（P<0.05）,而KLN胶囊中低剂量组、维拉帕米组心律失常的出现也有推迟的趋势，但经统计无显着性差异（P>0.05）。4.与对照组相比，KLN胶囊三个剂量组的心率明显减慢，而且呈剂量相关性。5.与对照组性比，KLN胶囊高、中剂量组的心律失常评分明显降低（P<0.05）,而KLN胶囊低剂量组和维拉帕米组则与对照组无显着性差异（P>0.05）。结论：1.KLN胶囊可以剂量依赖的对正常大鼠离体心脏电生理产生影响，而对QT间期无影响，因此可能具有较低的致心律失常的风险。2.KLN胶囊对外源性自由基诱发的心律失常可能具有预防和治疗作用，可以明显减慢心率，并可能对恶性心律失常（VT、VF）的发生具有一定的预防和治疗作用，其疗效优于维拉帕米。3．KLN胶囊抗快速型心律失常的机制可能与同时作用于钾通道、钠通道，钙通道有关，同时可能对自由基具有清除作用，抑制钙超负荷，可能具有多靶点治疗作用特点，是一种类似于Ⅲ类和Ic类和IV类复合作用的抗心律失常药物，因此对快速型心律失常可能具有很好的疗效，并可能具有较低的致心律失常的风险，具有很好的研究前景。
徐毅[9]（2012）在《Liguzinediol通过作用于肌浆网钙释放发挥正性肌力作用及其心脏安全性评价》文中指出目的：探索Liguzinediol （LZDO）对正常大鼠离体心脏正性肌力作用的机理,并评价其心脏安全性。方法：1.大鼠Langendorff离体心脏灌流：采用常规大鼠Langendorff离体心脏灌流技术,记录左心室收缩功能。分析LZDO以及LZDO在α1、β、D1、H1受体阻滞剂,磷酸二酯酶、Na+-K+-ATP酶、Na+-ca2+交换抑制剂,L-型钙通道阻滞剂,兰尼碱受体、肌浆网钙泵抑制剂存在的条件下,对左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末期压（LVEDP）、左心室内压最大上升速率（+dp/dtmax）、左心室内压最大下降速率（-dp/dtmax）、心率（HR）的作用。2. GPCR受体活性测定技术：我们选取了与心肌收缩力有关的31个GPCR受体,分析LZDO对它们的作用。3.大鼠心脏乳头肌动作电位记录：采用常规大鼠离体乳头肌动作电位记录技术,记录乳头肌动作电位的各参数。分析LZDO对动作电位复极50%水平的时程（APD50）和90%水平的时程（APD90）的作用。4.全细胞电流钳记录技术：采用膜片钳全细胞电流钳技术,记录大鼠左心室单个肌细胞的动作电位的各参数。分析LZDO对动作电位复极50%水平的时程（APD50）和90%水平的时程（APD90）的作用。5.全细胞电压钳记录技术：应用膜片钳全细胞电压钳技术,分析LZDO对L-型钙电流的作用,探讨LZDO正性肌力作用的机制；分析LZDO对hNav1.5电流、hERG电流的作用,对其进行心脏安全性评价。6.细胞内钙成像技术：采用细胞内钙成像的方法研究LZDO对心肌细胞内钙释放的作用。7.在体和离体心电图技术：采用常规豚鼠在体和离体心电图技术,研究LZDO对豚鼠心电图的P-R间期和QTc间期的影响。结果：1. LZDO剂量依赖性地增加大鼠离体左心室收缩力,其正性肌力作用能被L-型钙通道阻滞剂、兰尼碱受体抑制剂、肌浆网钙泵抑制剂所完全阻断：LZDO能显着地增加左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末期压（LVEDP）、左室内压最大上升速率（+dp/dtmax）、左室内压最大下降速率（-dp/dtmax）,但并不显着性地改变心率。在α1受体阻滞剂哌唑嗪（Prazosin1μM）、β受体阻滞剂普萘洛尔（Propranolol1μM）、多巴胺D1受体阻滞剂（SCH233901μM）、H1受体阻滞剂非索那定（Fexofenadine1μM）、磷酸二酯酶抑制剂IBMX（5μM）、Na+-K+-ATP酶抑制剂哇巴因（Ouabain1μM）、Na+-Ca2+交换抑制剂（KB-R79431μM）存在的条件下,LZDO100μM仍能显着地增加上述功能指标（P<0.05）。L-型钙通道阻滞剂尼莫地平（Nimodipine1μM）、L-型钙通道阻滞剂维拉帕米（Verapamil1μM）、兰尼碱受体抑制剂钉红（Ruthenium red5μM）、肌浆网钙泵抑制剂毒胡萝卜素（Thapsigargin2μM）能完全阻断LZDO100μM的正性肌力作用（P>0.05）,显示LZDO的正性肌力作用是通过L-型钙通道、兰尼碱受体和肌浆网钙泵所介导的。2. LZDO对GPCR受体无显着性的激活作用：实验结果显示,LZDO100μM对31个GPCR受体无显着性的激活作用。3. LZDO对正常大鼠乳头肌动作电位无显着性作用：LZDO100μM对大鼠乳头肌动作电位的复极50%水平的时程（APD50）和90%水平的时程（APD90）无显着性作用（P>0.05）。4. LZDO对正常大鼠心肌细胞动作电位无显着性作用：LZDO100μM对大鼠左心室单个肌细胞动作电位的复极50%水平的时程（APD50）和90%水平的时程（APD90）无显着性作用（P>0.05）。5. LZDO并不能增加正常大鼠左心室肌细胞的L-型钙电流,LZDO对hNav1.5电流与hERG电流均无显着性的抑制作用：LZDO100μM对大鼠左心室单个肌细胞的L-型钙电流无显着性作用（P>0.05）,显示LZDO的作用靶点不是L-型钙通道；LZDO（1,10,100,300μM）对hNav1.5电流无显着性的抑制作用；LZDO（1,10,100,300μM）对hERG电流无显着性的抑制作用。6.LZDO显着性地增加正常大鼠左心室肌细胞内的钙释放量：LZDO100μM可以显着性地增加大鼠左心室肌细胞内的钙释放量（P<0.05）；LZDO100μM可以恢复由咖啡因所引起的肌浆网钙衰竭现象,这说明LZDO的作用靶点不是兰尼碱受体。7. LZDO对豚鼠在体和离体心脏心电图的P-R间期及QTc间期均无显着性的影响：豚鼠在体给予LZDO1.7g.kg-1或豚鼠离体心脏灌流LZDO300μM后,P-R间期及QTc间期并没有显着性的改变（P>0.05）。结论：LZDO的正性肌力作用与其增强肌浆网的钙释放量有关,LZDO对L-型钙通道无直接作用,其作用靶点可能为肌浆网钙泵。LZDO并没有显着性地改变豚鼠在体与离体心电图的P-R间期及QTc间期,也没有显着性抑制hNav1.5和hERG电流,显示其良好的心脏安全性。LZDO具有独特的生物学机制,很有希望成为临床治疗心衰的有效药物。
姚青海,崔长琮,孙姗,程爱娟,吴尚勤[10]（2011）在《心脏收缩性调节在慢性心力衰竭治疗中的应用》文中研究指明慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）是多种心血管疾病的后期转归,尽管目前以纠正神经-内分泌亢进为主的药物治疗得到广泛应用,仍有相当比例患者存在生活质量不佳和预后不良。近年来,心脏再同步化治疗（cardiacresynchronization therapy,CRT）已成为心室间或左心室壁各节段非同步的标准治疗,但符合上述标准的CHF患者比例
二、绝对不应期电刺激对心力衰竭豚鼠心室肌细胞动作电位时程和L型钙电流的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、绝对不应期电刺激对心力衰竭豚鼠心室肌细胞动作电位时程和L型钙电流的影响（论文提纲范文）
（1）新型hERG钾通道激动剂药理作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验仪器 |
| 3.实验动物 |
| 4.实验方法 |
| 4.1 溶液配制 |
| 4.2 细胞培养 |
| 4.3 急性分离豚鼠心肌细胞 |
| 4.4 全细胞膜片钳记录 |
| 4.4.1 全细胞膜片钳记录过程 |
| 4.4.2 hERG钾电流的记录程序 |
| 4.4.3 Nav1.5 电流的记录程序 |
| 4.4.4 Cav1.2电流的记录程序 |
| 4.4.5 豚鼠心肌细胞动作电位的记录 |
| 4.4.6 豚鼠心肌细胞动作电位的记录程序 |
| 4.5 心脏电信号的记录过程 |
| 5.统计学处理 |
| 实验结果 |
| 1.HW0168对hERG通道电流的药理学评价 |
| 1.1 hERG稳转细胞系的验证及HW0168对hERG通道电流的影响 |
| 1.2 在hERG稳定表达的HEK293细胞中，检测HW-0168对hERG通道激活和失活过程的影响 |
| 1.3 在hERG稳定表达的HEK293细胞中，检测HW-0168对hERG通道失活速率的 |
| 1.4 在hERG稳定表达的HEK293细胞中，检测HW-0168对hERG通道去活的影响 |
| 1.5 在豚鼠心室肌细胞中,检测 HW-0168 对动作电位时程的影响 |
| 2.HW011对hERG通道电流的药理学评价 |
| 2.1 在hERG稳定表达的HEK293细胞中，检测HW-011对hERG电流的影响 |
| 2.2 HW-011 对心脏其他重要离子通道电流的调节作用 |
| 3.多通道矩阵式心脏电生理标测技术评价两种化合物对整体心脏影响的可行性验证 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（2）Tbx18、HCN4和GJA7介导cMSCs体外诱导分化及温敏凝胶对细胞活性影响的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 转录因子Tbx18介导c-kit~+犬间充质干细胞(cMSCs)在体外共培养环境中定向分化为窦房结样细胞的实验研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 使用流式细胞仪分选c-kit~+c MSCs犬窦房结、犬心房肌细胞原代分离培养.. |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 构建Tbx18 慢病毒载体转染c-kit~+cMSCs |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Tbx18 过表达促使c-kit~+cMSCs向窦房结样细胞分化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第二部分 HCN4和GJA7共转染cMSCs体外诱导分化 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 HCN4和GJA7慢病毒载体构建与转染cMSCs |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 HCN4和GJA7共转染cMSCs体外诱导分化及检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第三部分 温敏水凝胶对Tbx18、HCN4、GJA7 基因转染cMSCs生物学活性的影响 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 壳聚糖/β甘油磷酸钠温敏水凝胶体外细胞毒性检测 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 壳聚糖/β甘油磷酸钠温敏水凝胶内细胞生长情况评价 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 心脏生物起搏器的研究进展和展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文及期刊 |
| 致谢 |
（3）Epac1对慢性心衰豚鼠心室复极化和室性心律失常发生的调控机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 慢性心衰豚鼠心脏电生理重构 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Epac1对正常豚鼠心脏电生理的影响及其在慢性心衰心室复极中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（4）双心室绝对不应期电刺激对慢性心力衰竭兔心功能影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 兔慢性充血性心力衰竭时心脏机械和电生理的变化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 双心室绝对不应期刺激对心力衰竭兔心功能的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 双心室绝对不应期刺激对心力衰竭兔心脏电生理的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 双心室绝对不应期刺激对心衰兔心室肌 SERCA2 和miRNAs133 的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心功能影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心功能影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔的氧化应激的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔肌球蛋白重链表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心肌细胞钙收缩调节的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心肌细胞凋亡的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）氯离子通道ClC-3在小鼠心脏电生理特性中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分:“冠状动脉前降支结扎再松解术”建立心肌缺血/再灌注的小鼠动物模型 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分:经右侧颈外静脉穿刺送导管至小鼠右心并建立小鼠心内电生理检查的程序刺激 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分:心肌缺血/再灌注模型下,心脏ClC-3基因过表达小鼠心脏电生理特性的变化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分:“微创横主动脉结扎术”建立左室心肌肥厚的小鼠动物模型 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第五部分:心肌肥厚模型下小鼠电生理特性的变化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果目录 |
（7）不同部位绝对不应期电刺激对慢性心力衰竭兔心功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 心脏收缩力调节治疗心力衰竭的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）快律宁胶囊抗快速心律失常的离体药效学实验研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 1 中医对快速型心律失常的认识及研究 |
| 1.1 疾病范畴 |
| 1.2 病机认识 |
| 1.3 治疗 |
| 2 西医对快速型心律失常的研究进展 |
| 2.1 快速型心律失常的发病病因 |
| 2.2 快速型心律失常的发生机制 |
| 2.3 心律失常的药物治疗 |
| 2.4 非药物治疗 |
| 3 中药抗快速型心律失常的实验研究 |
| 3.1 单味中药抗心律失常的实验研究 |
| 3.2 复方抗心律失常的实验研究 |
| 3.3 目前常用的实验研究方法 |
| 4 KLN 胶囊治疗阴虚火旺型快速型心律失常机制 |
| 4.1 心阴虚火旺是快速型心律失常的重要病机之一 |
| 4.2 心悸阴虚火旺证的治法 |
| 4.3 KLN 胶囊组方分析 |
| 4.4 快律宁（KLN）胶囊前期实验研究结果 |
| 4.5 “快律宁（KLN）”前期临床研究结果 |
| 4.6 本课题来源 |
| 4.7 实验技术路线图 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 KLN 胶囊对大鼠离体心室肌细胞电生理特性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要设备和仪器 |
| 1.2 主要试剂及其配制 |
| 1.3 动物选择 |
| 1.4 实验分组 |
| 1.5 分组给药 |
| 1.6 电生理参数记录方法 |
| 1.7 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 KLN 胶囊对大鼠左心室肌细胞动作电位 APD50、APD90 影响 |
| 2.2 KLN 胶囊对大鼠左心室肌细胞动作电位 VMAX、APA 影响 |
| 2.3 KLN 胶囊对大鼠左心室 R-R 间期、QT 间期的影响 |
| 2.4 KLN 胶囊对 EAD 发生率的影响 |
| 讨论 |
| 1 正常心肌细胞动作电位电生理特点 |
| 2 抗心律失常药的电生理作用 |
| 3 KLN 胶囊对大鼠离体心脏动作电位时程(APD)的影响 |
| 4 KLN 胶囊对大鼠离体心脏动作电位 APA、VMAX 的影响 |
| 5 KLN 胶囊与普罗帕酮对大鼠离体心脏心室肌细胞动作电位影响的比较 |
| 6 KLN 胶囊对大鼠离体心脏 QT 间期的影响 |
| 7 KLN 胶囊促心律失常的风险研究 |
| 8 KLN 胶囊组方药物抗心律失常的离子通道研究 |
| 8.1 黄连 |
| 8.2 苦参 |
| 8.3 生地黄 |
| 8.4 当归 |
| 8.5 酸枣仁 |
| 8.6 柏子仁 |
| 8.7 小结 |
| 9 KLN 胶囊抗心律失常电生理机制分析 |
| 实验二 KLN 胶囊对外源性自由基所致心律失常的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要设备和仪器 |
| 1.2 主要试剂及其配制 |
| 1.3 动物选择 |
| 1.4 分组方法 |
| 1.5 Langendoff 心脏灌流 |
| 1.6 分组灌流给药 |
| 1.7 实验观察指标 |
| 1.8 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 心律失常个数的比较 |
| 2.2 心律失常出现时间、心率差及心律失常评分的比较 |
| 讨论 |
| 1 自由基致心律失常的机制 |
| 2 外源性自由基致心律失常实验研究 |
| 3 KLN 胶囊对外源性自由基诱发心律失常的保护作用 |
| 4 KLN 胶囊与维拉帕米抗外源性自由基所致心律失常作用比较 |
| 5 KLN 胶囊抗外源性自由基诱发心律失常机制分析 |
| 6 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 发表论文 |
（9）Liguzinediol通过作用于肌浆网钙释放发挥正性肌力作用及其心脏安全性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 Liguzinediol正性肌力作用的机理研究 |
| 第一章 通过Langendorff离体心脏灌流的方法初步探讨Liguzinediol的作用机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 Liguzinediol对GPCR受体的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 Liguzinediol对正常大鼠乳头肌动作电位的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 Liguzinediol对正常大鼠左心室肌细胞动作电位的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 Liguzinediol对正常大鼠心肌细胞L-型钙电流的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 Liguzinediol对正常大鼠心肌细胞内钙释放的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第七章 Liguzinediol对靶点-肌浆网钙泵的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Liguzinediol的心脏安全性评价 |
| 第八章 Liguzinediol对正常豚鼠在体和离体心电图的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第九章 Liguzinediol对hNav1.5通道电流的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第十章 Liguzinediol对hERG通道电流的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 总结与展望 |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 综述 正性肌力药物作用靶点的研究进展 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
四、绝对不应期电刺激对心力衰竭豚鼠心室肌细胞动作电位时程和L型钙电流的影响（论文参考文献）
- [1]新型hERG钾通道激动剂药理作用的研究[D]. 董秀明. 青岛大学, 2019(02)
- [2]Tbx18、HCN4和GJA7介导cMSCs体外诱导分化及温敏凝胶对细胞活性影响的研究[D]. 肖华. 中国人民解放军陆军军医大学, 2018(03)
- [3]Epac1对慢性心衰豚鼠心室复极化和室性心律失常发生的调控机制研究[D]. 朱迪迪. 南京医科大学, 2018(01)
- [4]双心室绝对不应期电刺激对慢性心力衰竭兔心功能影响的研究[D]. 宁彬. 河北医科大学, 2014(09)
- [5]心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心功能影响及其机制研究[D]. 刘惠良. 河北医科大学, 2014(09)
- [6]氯离子通道ClC-3在小鼠心脏电生理特性中的作用[D]. 于瀛. 上海交通大学, 2014(03)
- [7]不同部位绝对不应期电刺激对慢性心力衰竭兔心功能的影响[D]. 张飞飞. 河北医科大学, 2014(09)
- [8]快律宁胶囊抗快速心律失常的离体药效学实验研究[D]. 于晓明. 山东中医药大学, 2012(12)
- [9]Liguzinediol通过作用于肌浆网钙释放发挥正性肌力作用及其心脏安全性评价[D]. 徐毅. 南京中医药大学, 2012(10)
- [10]心脏收缩性调节在慢性心力衰竭治疗中的应用[J]. 姚青海,崔长琮,孙姗,程爱娟,吴尚勤. 中华心血管病杂志, 2011(12)