一、单纯疱疹病毒gD2 DNA疫苗诱导动物的细胞免疫应答（论文文献综述）
牟唐维[1]（2021）在《利用突变技术对HSV2 RL1、UL41和US12蛋白在病毒致病中的生物学机制研究》文中研究指明单纯疱疹病毒2型是引起生殖器疱疹的主要病原体之一,在免疫缺陷患者中可引起疱疹性脑炎和更严重的性传播疾病,该病毒可经性传播和母婴传播。HSV-2感染后可经感觉神经轴逆行至骶背根神经节建立潜伏感染,这种潜伏感染在受到外界刺激时,可以表现为显性感染出现症状。反复感染给患者造成了生理和心理的影响,严重影响生活质量。由于这种潜伏和反复感染导致HSV-2的治疗药物和疫苗研发困难重重。另外,感染HSV-2后可增加感染HIV的感染几率。因此研究HSV-2感染宿主后的致病机制、宿主的免疫反应以及病毒蛋白与宿主之间的相互作用有助于HSV-2治疗药物和疫苗的研发以及我们对HSV-2的致病机理更深入的理解。基于以上事实,本试验第一部分工作围绕与HSV-2免疫逃逸相关基因RL1、UL41、US12开展,首先利用CRISPR/Cas9系统构建HSV-2突变株:M2（HSV-2 RL1-UL41-）、M3（HSV-2RL1-US12-）、M4（HSV-2RL1-UL41-US12-）,随后对这三个突变株在细胞和动物试验中进行生物学特性分析,包括增殖动力学检测、蚀斑检测,急性感染、潜伏感染和免疫原性分析。结果表明,M2、M3、M4在细胞水平以及动物水平的急性感染、潜伏感染中都表现出增殖能力下降,且引起较轻的临床症状,其中M4增殖能力下降最为明显;免疫原性分析试验中发现,虽然突变株组能降低病毒的复制能力,但是不能100%保护,其中M4组存活率为90%,M2/M3组存活率均为80%。鉴于这一发现,本试验第二部分工作对野毒株和突变株M1（HSV-2RL-）、M2、M3感染后小鼠阴道、子宫和卵巢进行转录组测序分析。结果显示,与野毒株相比,最有意思的是突变株M1、M2、M3在阴道、子宫和卵巢组织中均能激活代谢信号通路,其中类固醇激素代谢信号通路和细胞色素代谢信号通路最为明显,且比较后发现,M1对类固醇激素代谢信号通路和细胞色素代谢信号通路影响较大,其可能的机制与RL1抑制细胞对病毒感染产生的应激翻译阻滞的特性相关,其中包括类固醇激素激素和细胞色素代谢过程。综上所述,对突变株M2、M3、M4在细胞和动物试验中比较和分析,筛选得到了一株复制能力较低、致病能力较低、潜伏感染能力较低以及具有一定的免疫保护作用的M4减毒株,可作为HSV-2减毒活疫苗的候选株。转录组学数据分析发现,M1突变株对类固醇激素代谢和细胞色素代谢具有较大影响,但是继续缺失UL41/US12时,该影响受到了限制,说明病毒蛋白之间也有一个互相平衡的状态。但是不可否认的是,RL1的缺失对类固醇激素代谢和细胞色素代谢具有重要影响,这一发现为HSV-2的感染过程中病毒蛋白与宿主之间的相互作用提供了新的研究方向。
陈志军[2]（2020）在《2型单纯疱疹病毒gD亚单位相关疫苗佐剂筛选及免疫学评价》文中研究表明2型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type 2,HSV-2）是一种在全球范围内广泛传播的生殖器疱疹病毒,具有嗜神经性、于感觉神经元内终身潜伏并时常发作的特点,是导致生殖器疱疹产生及复发的主要因素。HSV-2主要通过性传播,其阳性患者感染HIV-1的风险将增加2-3倍。据统计,现今全球感染者超过5亿,每年约有2360万例新增感染患者。目前针对有明显症状的HSV-2感染者,临床上大多选择口服抗病毒药物如阿昔洛韦等进行抗病毒治疗,但这种方法只能轻微缓解临床症状,并不能将病毒彻底清除,无法阻止复发性感染的发生。而一些无症状感染者,则因病毒无声脱落的存在,加大了病毒传播的可能性。基于HSV-2感染的普遍性及现有临床干预手段的局限性,亟需开发一种有效的HSV-2疫苗。关于HSV-2疫苗的研究可追溯到上世纪30年代,通常将其分为预防性和治疗性两种。近百年来,研究人员进行了不懈探究,但目前仍无被批准上市的有效的HSV-2疫苗。随着对于单纯疱疹病毒认识的不断深入及相应疫苗研发失败经验的不断积累,研究人员发现,有效地HSV-2疫苗除需诱导较强的抗体反应外,还需激发CD4+及CD8+T细胞反应;加强固有免疫及黏膜免疫应答以在病毒入侵的局部快速响应,有效清除外来病原体及被感染细胞。而佐剂除具有增强亚单位抗原免疫反应的能力外还可指导不同类型的免疫反应以抵抗HSV-2感染,因此在疫苗的研发过程中,其选择尤为重要。MF59与多种可溶性抗原具有良好的相容性;葛兰素史克（Glaxo Smith Kline,GSK）公司研发的新型系列人用疫苗佐剂AS（adjuvant System,AS）,已在多种市售疫苗或临床实验中证明其有效性;BLP作为多种抗黏膜病原体疫苗的黏膜佐剂或抗原载体,具有显着的免疫刺激作用。因此,在本论文中,选择传统的Al（OH）3和MF59佐剂作为对照,将GSK佐剂系统中的AS02,AS03首次应用于HSV-2预防性亚单位疫苗的研究中,以比较四种系统性佐剂辅助抗原的免疫增强效果及免疫反应偏向性;探究新型黏膜佐剂BLP在鼻内免疫的HSV-2重组亚单位疫苗中的免疫刺激作用并侧重从诱发黏膜免疫反应的角度进行分析。以上佐剂均与可介导病毒与宿主细胞膜融合并具有多种T细胞表位和中和抗体表位的包膜糖蛋白D的截短型gD2（1-285aa）（或BLP与重组融合蛋白gD2-PA非特异性结合）混合,分别制备预防性亚单位疫苗和用于黏膜免疫的重组亚单位疫苗,并在小鼠模型中进行评价。全文共分为以下两部分:（1）构建pSecTag2A-gD2质粒并在HEK293T真核表达系统中表达并纯化获得大量gD2及gD2-PA两种目的蛋白;（2）制备上述五种免疫原分别免疫小鼠三次,并对其进行免疫学评价。结论:（1）四种系统性佐剂及新型黏膜佐剂BLP均具有良好的免疫原性,相应疫苗对于致死剂量HSV-2攻毒表现出不同程度的保护性;（2）系统佐剂疫苗免疫组:AS02能诱导产生最高水平的抗体反应,在Th偏向性实验中,Al（OH）3、MF59以及AS03均具有Th2型体液免疫偏向性,而AS02则略偏向于诱导相对平衡的Th1/Th2反应,既能诱导体液免疫反应又能介导细胞免疫应答,能够完全清除病毒并对攻毒后小鼠具有100%的保护性;（3）黏膜免疫组:重组融合蛋白gD2-PA-BLP免疫组可仅通过诱导高水平的黏膜特异性IgA抗体反应而对生殖道病毒进行有效清除,是一种有潜力的用于黏膜免疫的重组亚单位疫苗。
柳蕾[3]（2020）在《HSV-2突变株的构建及其生物学特性分析》文中研究指明迄今为止,我们已发现了与人类疾病相关的8种疱疹病毒,其中单纯疱疹病毒2型（HSV-2）作为α疱疹病毒家族的一员,是引起生殖器疱疹的主要病原体。该病毒是嗜神经性病毒,其可沿神经轴突逆行至骶背根神经节建立潜伏感染,在体内环境出现特定变化时,该潜伏感染病毒可出现重激活。HSV-2能够编码多种蛋白,这些蛋白在病毒的原发性感染、潜伏感染以及复发感染中都有着重要的生物学意义。其中,ICP34.5蛋白是由HSV-2的RL1基因编码的重要功能性分子,可通过其神经毒力特点和抑制细胞诱导的应激性翻译阻滞功能参与病毒的病理过程。病毒的LAT基因与其潜伏相关,具有抑制神经细胞凋亡,提高神经细胞存活的能力,对HSV-2在神经组织中潜伏感染的形成、维持以及重激活起到了关键作用。而LAT基因的miRNA对应RL1基因的反义链,可调控RL1基因的表达。除此之外,目前还没有对以上两种嗜神经性基因之间相互作用关系的相关报道。本论文的工作围绕HSV-2病毒对神经细胞的感染能力以及病毒感染过程中相关的调控机制进行,首先我们选择“神经毒力因子”RL1基因,构建缺失突变株RL1-HSV-2,并对该突变株的增殖动力学及其在动物模型上的临床病理表现、诱导的细胞应激反应、增殖特性以及RL1基因参与病毒相关基因的调控过程做了相应的探索研究。在缺失RL1的基础上,我们又构建同时缺失LAT基因的RL1-LAT-HSV-2,并基于缺失LAT基因的LAT-HSV-2的生物学特征,对RL1-LAT-HSV-2在细胞和动物水平的增殖能力,在小鼠模型的急性感染、潜伏感染及所引起的免疫反应做了分析。在第一部分工作中,与野毒株HSV-2感染相比,缺失RL1基因的HSV-2突变株RL1-HSV-2感染小鼠导致更严重的临床病理表现,表现为类恶病质样综合征。但是,这种病理特征不是由于组织中的病毒增殖所致,RL1-HSV-2在小鼠组织中的病毒载量远低于野毒株感染组。我们的实验观察提示,ICP34.5蛋白的缺失很可能导致了宿主过度的应激反应,该应激反应使得某些组织的炎症反应和趋化因子水平上调,从而导致感染动物的全身衰竭。此外,ICP34.5蛋白的缺失使得病毒按照α、β、γ基因的陆续下调的事实表明,ICP34.5对病毒稳定增殖所必需的转录调控起重要作用。这些实验结果对ICP34.5的功能提出了新的认识。在第二部分工作中,我们观察到HSV-2突变株LAT-HSV-2和RL1-LAT-HSV-2表现了不同的生物学特性。RL1-LAT-HSV-2在神经细胞中的增殖能力明显降低,且在Vero细胞中形成的蚀斑小于LAT-HSV-2突变株和野毒株。对两个突变株以及野毒株感染小鼠的临床观察比较表明,与野生型毒株相比,突变株RL1-LAT-HSV-2具有减毒表型,其在急性感染和潜伏感染的中均具有较低的致病性,并可诱导更强的特异性免疫反应。然而在感染LAT基因缺失的LAT-HSV-2突变株的小鼠中未发现明显的减毒作用。进一步的观察提示RL1和LAT基因的同时缺失并不能完全限制病毒在神经细胞中的增殖,说明HSV-2病毒中存在其它基因参与病毒在神经细胞中的复制和感染。以上结果表明,HSV-2的RL1基因和LAT基因在病毒的感染增殖过程均具有涉及病毒致病机制的生物学特性,二者可能存在着某种相互制衡的关系,在相互调控的过程中亦在病毒与细胞相互作用的过程中表现了特定的病理学意义,使病毒与宿主之间呈现出共平衡的生存状态。这也是在HSV-2的嗜神经特性感染机制研究中对RL1和LAT基因之间相互作用关系的首次发现和探索。
马小静[4]（2020）在《牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究》文中进行了进一步梳理牛病毒性腹泻（BVD）和牛传染性鼻气管炎（IBR）是危害牛和其他反刍动物的两种重大疾病,病原分别为牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）。BVDV和IBRV常混合感染牛群,引起腹泻、出血综合征、流产、肺炎、脑炎、鼻炎、眼炎等临床症状,给养牛业带来了巨大经济损失。目前,对这两类疫病的防控主要依靠灭活疫苗或弱毒疫苗,但在实际应用中存在免疫持续期短、病毒毒力易返强、保存和运输成本高等诸多缺陷。因此,具有持久免疫应答、制备工艺简单、应用安全等优点的核酸疫苗成为了当下疫苗研制的热点。本研究将BVDV和IBRV的优势抗原基因插入到pVAX1真核表达载体中,获得能同时表达两种抗原基因的重组载体并研究其免疫效果,旨在研制一种能有效预防BVD及IBR的核酸疫苗。主要工作如下:1.BVDV E0与IBRV gD目的基因的克隆及生物信息学分析:根据GenBank收录的BVDV和IBRV参考序列设计引物,PCR扩增BVDV E0基因和IBRV gD基因并测序;利用生物信息学方法对目的蛋白进行分析。结果表明扩增的BVDV E0基因、IBRV gD基因符合预期大小,其蛋白具有较好的免疫原性,可作为核酸疫苗的候选抗原基因。2.pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建:PCR扩增IRES序列;将IRES、BVDVE0、IBRV gD基因片段依次连接至pVAX1载体中,构建pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒。重组质粒经双酶切及DNA测序鉴定,结果显示,成功构建本研究所需真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD。3.重组质粒pVAX1-E0-IRES-gD中目的基因体外表达的检测:将质粒pVAX1-E0-IRES-gD用脂质体法转染至293T细胞中,48 h后采用一抗（BVDV、IBRV阳性血清）和二抗（兔抗牛IgG-FITC）进行间接免疫荧光检测。结果显示,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,证明目标蛋白E0和gD在293T细胞中成功表达并具有良好反应原性。4.pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究:将pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗以不同剂量免疫小鼠,首免14d后加强免疫一次。采用ELISA方法检测小鼠血清中抗E0、gD抗体水平以及IFN-γ、IL-4含量,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖能力。结果显示,在抗体和细胞因子水平以及脾淋巴细胞增殖能力这三个指标方面,核酸疫苗组均高于空载体和阴性对照组且差异极显着,200 μg高剂量免疫组优于100μg、50μg中、低剂量组;另外,200μg高剂量核酸疫苗免疫组与BVD-IBR灭活疫苗组相比无显着性差异。本研究成功构建了BVD-IBR二联核酸疫苗,体外表达检测证明目的蛋白具有良好反应原性,动物免疫试验证明其能刺激机体产生良好免疫应答,以上试验结果都为BVD-IBR二联核酸疫苗的研制提供了可靠的数据及理论支持。
柳蕾,李琦涵[5]（2019）在《单纯疱疹病毒2型疫苗的研究进展》文中研究表明单纯疱疹病毒2型（herpes simplex virus type 2,HSV-2）是人类疱疹病毒家族中α家族成员,可引起多年龄段的人群生殖器疱疹及其他疱疹疾病。由于该病毒具有复杂的基因结构及感染病理,其感染至今尚无有效的治疗方法。该病毒可抑制机体免疫系统,在神经细胞潜伏感染,具有重激活特性,因此,其疫苗的研制亦需要复杂的技术,且面临重重的挑战。
张雪莲[6]（2017）在《鸭甲肝病毒3型广东分离株致病性及表达其VP1基因重组鸭肠炎病毒免疫效果的研究》文中指出鸭病毒性肝炎（DVH）是由鸭肝炎病毒（DHAV）引起的主要危害1月龄以内雏鸭的一种高度致死性疾病;DHAV分为DHAV-1、DHAV-2及DHAV-3 3个血清型;我国DVH主要由DHAV-1和DHAV-3引起;DHAV-3的出现及DHAV-1与DHAV-3的一同流行是我国DVH不能得到控制的主要原因。鸭病毒性肠炎是由鸭肠炎病毒（DEV）引起的主要感染鸭、鹅等水禽的致死性传染病;DEV属疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科马立克病毒属,其基因组较大且其感染具有宿主特异性,因此,以其为病毒载体构建二价重组病毒活载体疫苗成为研究的热点。本研究的主要内容包括两方面,分别为DHAV-3广东分离株的致病性的系统性研究及表达DHAV-3 VP1基因的重组鸭肠炎病毒的构建及其免疫保护效果的评价。1.DHAV-3致病性的研究（1）DHAV-3毒力的鉴定将分离于广东的DHAV-3进行鸭胚攻毒及雏鸭回归试验,对该病毒感染致死雏鸭临床症状、组织病理变化及病毒载量进行观察及检测,并测定该病毒的鸭胚半数致死量及雏鸭半数致死量,结果显示,该病毒可快速引起鸭胚及雏鸭死亡且死亡率极高,剖检观察到肝脏、脾脏及胆囊出现严重的组织损伤,并引起雏鸭心、肝、脾、肺、肾、十二指肠及脑等组织器官出现不同程度的病理损伤,病毒拷贝数在肝脏中最高,脾脏次之,胸腺及肌肉中最低,且对11日龄鸭胚的LD50为10-5.167/0.2mL,对5日龄雏鸭的LD50为10-6.375/0.2mL。（2）雏鸭感染DHAV-3后肝脏的转录组分析以10LD50的DHAV-3感染5日龄雏鸭,利用RNA-Seq筛选病毒感染后12h及48h雏鸭肝脏中的差异表达基因,并对筛选获得的差异表达基因进行GO功能分类及KEGG信号通路分析;结果显示,感染后12 h和48 h,肝脏中基因表达模式差异显着,且感染后48 h,大量的免疫相关基因出现上调,并显着富集在细胞因子-细胞因子受体的相互作用、Toll样受体信号通路、RIG-1样受体信号通路、细胞凋亡及Jak-STAT信号通路等。（3）雏鸭感染DHAV-3天然免疫应答相关分子的检测利用实时荧光定量PCR方法对10LD50DHAV-3感染后3h、6h、9h、12h、24h、36h及48 h雏鸭肝脏及脾脏中DHAV-3的病毒载量及12种免疫应答相关分子的相对表达量进行检测,结果显示,雏鸭感染DHAV-3后3 h即可在肝脏及脾脏中检测到低拷贝的病毒,肝脏中的12种免疫应答分子的表达呈现不同程度的上调,但脾脏中的表达呈现多样性;感染后6 h～24 h,雏鸭肝脏及脾脏中的免疫应答分子的表达模式不同,随着时间的延长,病毒拷贝数的大量累积,至感染后36h～48 h,观察到大多数免疫相关分子出现不同程度的表达上调,但最终雏鸭未能抵抗DHAV-3的感染而死亡。2.表达DHAV-3 VP1基因重组鸭肠炎病毒的构建（1）DHAV-3全基因的克隆及其VP1蛋白抗原优势区的鉴定根据GenBank已公布的DHAV-3参考序列,将DHAV-3基因组分成6段相互重叠的片段,利用合成的简并引物对DHAV-3的全基因序列进行克隆;利用PCR方法克隆获得DHAV-3 VP1基因,并对该基因进行分段截短表达,利用鼠抗DHAV-3多抗及鸡源DHAV-3卵黄抗体对VP1蛋白的抗原优势区进行筛选和鉴定,初步确定DHAV-3 VP1蛋白的抗原优势区为90～175aa。（2）含gpt筛选标记的表达DHAV-3 VP1基因的重组鸭肠炎病毒的构建、筛选及鉴定将获得的VP1基因克隆至pcDNA3.1（+）中,扩增获得含CMV启动子、VP1基因及BHG pA的VP1表达盒基因,同时,以实验室保存的pMD18T-gpt表达盒质粒为模板,利用PCR方法在原gpt表达盒两端分别引入一个同向的loxP位点,扩增获得gpt-loxP表达盒基因,通过一系列酶切、连接的方式成功构建重组病毒转移载体pEASY-AUs10-gpt-loxP-VP1;将重组病毒转移载体pEASY-AUs10-gpt-loxP-VP1与DEV C-KCE基因组总DNA共转染至原代鸭胚成纤维细胞中,经11代霉酚酸加压筛选及4轮蚀斑纯化获得含有gpt筛选标记基因及DHAV-3 VP1基因的重组鸭肠炎病毒,PCR鉴定正确后,将其命名为rDEV-AUs 10-gpt-loxP-3-VP 1。（3）不含gpt筛选标记的表达DHAV-3 VP1基因的重组鸭肠炎病毒的构建、筛选及鉴定将真核表达重组质粒pKozak-NLS-Cre与重组病毒rDEV-△Us10-gpt-loxP-3-VP1基因组总DNA再次共转至DEF,在Cre酶的作用下,将两个同向loxP位点间的gpt表达盒删除,而仅保留一个loxP位点,利用PCR方法对重组病毒进行鉴定,结果显示存在不含gpt表达盒的重组病毒后,再进行5轮蚀斑纯化后得到纯净的、仅含单一 loxP位点及VP1基因的重组DEV,经 PCR、RT-PCR、Western blot 及 IFA 等试验鉴定正确后,将其命名为 rDEV-AUs1 0-3-VP1;提取重组病毒rDEV-AUs10-3-VP1第1、5、10、15及20代基因组总DNA,PCR均可扩增到VP1基因,表明DHAV-3 VP1基因可在DEVC-KCE基因组中稳定存在;将rDEV-AUs10-3-VP1病毒液超离浓缩后进行透射电镜观察,结果观察到包含囊膜和衣壳的鸭肠炎病毒粒子形态。3.动物的免疫及攻毒（1）产蛋鸭的免疫以 2×105、5×105 及 1×106 PFU 的重组病毒 rDEV-△Us10-3-VP1 及 2×105 PFU 亲本病毒DEVC-KCE免疫产蛋鸭,初次免疫后3周进行加强免疫。结果表明,血清中针对DEV及DHAV-3 VP1的特异性抗体在加强免疫后的7 d达到高峰,卵黄中,则在加强免疫后的14 d达到高峰;血清及卵黄中特异性抗体效价与免疫剂量呈剂量依赖性;免疫后产蛋鸭血清及卵黄中的抗DEV中和抗体的变化趋势与特异性性抗体的变化趋势相似,而针对DHAV-3的中和抗体效价很低;免疫后产蛋鸭外周血中CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞数目均有所增加,但CD8+T淋巴细胞增加幅度更高,免疫后7dCD4+与CD8+T淋巴细胞比例下降,免疫后14d持续下降,直至免疫后21 d接近正常水平。（2）雏鸭的免疫及攻毒以5 × 105 PFU的重组病毒rDEV-△Us10-3-VP1单次免疫3日龄雏鸭,免疫后7 d进行DEV AV1222株强毒及DHAV-3强毒的攻毒,攻毒剂量为100LD50/只,逐日观察并记录雏鸭的临床症状及死亡情况,结果表明,DEV强毒攻毒组雏鸭在攻毒后2周,重组病毒及亲本毒免疫的雏鸭均出现2只死亡,而PBS对照组雏鸭全部死亡,表明DHAV-3 VP1基因的插入及DEV C-KCE US10基因的缺失,并不影响弱毒疫苗株DEV C-KCE为雏鸭提供免疫保护力以抵抗DEVAV1222株强毒的感染;而DHAV-3强毒攻毒组在攻毒后第4天,亲本毒及PBS对照组雏鸭即全部死亡,重组病毒免疫组余1只雏鸭,攻毒后第8天,重组病毒组雏鸭全部死亡,表明构建的表达DHAV-3 VP1基因的重组鸭肠炎病毒不能够为雏鸭提供有效的保护力以抵抗DHAV-3强毒的感染。本研究为探讨DHAV-3感染雏鸭快速致死的机制及雏鸭抵抗DHAV-3感染的相关免疫应答机制提供科学的数据支撑,为构建表达DHAV-3 VP1重组病毒活载体疫苗提供理论依据和技术平台,同时,完善本实验室DEV的反向遗传操作平台,为进一步探讨重组DEV候选插入位点及US10蛋白的生物学功能奠定物质基础。
徐亭亭[7]（2017）在《单纯疱疹病毒包膜糖蛋白gC2、gD1、gD2的保护性与安全性评价》文中提出单纯疱疹病毒Ⅱ型（Herpes simplex virus type two,HSV-2）是α-疱疹病毒亚科单纯病毒属,由核心、皮层、衣壳和包膜4个部分组成。可通过直接密切接触与性接触传播,感染外生殖器与下肢躯干皮肤,常常导致疱疹性阴道炎、新生儿疱疹性脑炎、生殖器疱疹;或经胎盘或产道传播,引起新生儿先天性感染,造成新生儿死亡、早产和新生儿疱疹。近年来,我国的HSV-2感染病例显着增多,调查结果显示:在患有性病、生殖道感染的女性群体中,HSV-2的感染率约占72.9%,在正常女性群体中,HSV-2的感染率约占25.6%。系统抗病毒治疗是目前最主要的治疗方法,已经取得阶段性成果,但这些抗病毒药物难以有效预防疱疹病毒原发感染、控制疱疹病毒潜伏感染和复发性感染。因此,防止HSV-2感染的有效措施是接种高效、安全的HSV-2疫苗。飞速进步的技术推动了新型疫苗的长足发展,人们亟需全面的新型疫苗临床前安全性评价体系,使得科研工作者在临床试验前掌握该疫苗组分的安全性与效力、确定疫苗临床使用是安全剂量、预知不良反应、并观察任何与毒性有关的因素,为临床监控及某些病例提供参考。研发新型疫苗的重要环节之一是整体评价新型疫苗的安全性。目前,亚单位疫苗是最有前景的新型疫苗,可诱导细胞免疫与体液免疫。HSV-2的gD糖蛋白能介导病毒与细胞的融合,gC糖蛋白与免疫逃逸相关,近年来被认为是很有希望的候选疫苗蛋白。本研究探索了 gC2、gD1、gD2三种糖蛋白的临床前安全性评价。通过豚鼠的免疫保护性实验直观考察三种蛋白抗原的保护性;通过BALB/c小鼠的急性毒性实验、SD大鼠的长期毒性实验认识疫苗带来的副作用与定量的关系,通过Beagle犬的安全药理学实验探讨各主要生理系统的作用,以此验证三种蛋白抗原的安全性。
宋成程[8]（2017）在《基于结构修饰及内源佐剂策略的肿瘤糖疫苗的设计及活性研究》文中研究说明肿瘤的发生常伴随糖基化的改变。肿瘤相关糖抗原（Tumor-associated carbohydrate antigens,TACAs）广泛表达于多种肿瘤细胞,是治疗及预防肿瘤的优选靶标。但其容易被免疫系统识别为自身抗原,诱发免疫耐受。因此,本论文通过抗原结构修饰提高抗原的免疫原性及内源佐剂疫苗促进免疫应答两种策略,对结构修饰的TACA缀合物疫苗及构建的内源佐剂疫苗进行了抗肿瘤活性及免疫活性的研究。基于交叉反应的结构修饰策略是将天然糖抗原进行结构修饰,其诱导的抗体,不仅识别修饰的抗原,同时可以识别天然抗原,从而提高免疫原性,打破免疫耐受。因此本论文第一部分研究了结构修饰的TACAs的免疫活性及抗肿瘤活性。佐剂具有促进肿瘤疫苗提高免疫原性、打破自身对肿瘤细胞的免疫耐受的特征。将抗原与佐剂两部分共价偶联成为一个分子,能够提高抗原提呈细胞的利用率,避免高毒性佐剂的使用,同时能引起有效的免疫应答。合成内源佐剂疫苗是一种很好的提高抗肿瘤糖疫苗免疫应答的策略。因此,本文第二部分构建了几种内源佐剂疫苗并研究了其免疫活性。具体研究内容及结果如下:第一部分:通过还原胺化法将肿瘤相关糖抗原Tn及修饰的Tn抗原与载体蛋白白喉毒素突变体（Cross reactive material of diphtheria toxin,CRM197）共价偶联,在C34佐剂辅助下免疫健康小鼠。结果显示N-氟乙酰基修饰的Tn-CRM197（S6-CRM197）可以诱发机体产生更高的针对Tn的IgG抗体,且血清抗体能够更好的与肿瘤细胞结合;能促进小鼠脾细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ。在Tn上验证了氟修饰对于抗肿瘤糖疫苗的潜在应用价值,接下来我们研究了基于氟修饰的三种STn衍生物（Y2、Y3、Y4）与蛋白的缀合疫苗的抗肿瘤活性及机理。首先构建小鼠CT-26结肠癌肺转移模型,免疫糖蛋白缀合疫苗Y1-KLH（STn-KLH）、Y2-KLH、Y3-KLH、Y4-KLH。结果显示Y4-KLH在佐剂辅助下可以有效的抑制肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期。抗肿瘤机制研究显示:Y4-KLH可以诱导强烈的抗STn的IgG抗体,能够识别STn抗原阳性的肿瘤细胞,并且可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒及补体依赖的细胞毒裂解STn抗原阳性的肿瘤细胞。Y4-KLH可以刺激抗原特异性T淋巴细胞分泌IFN-γ,促进细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocytes,CTL）的免疫应答。Y4-KLH产生混合的Th1/Th2型应答,并且比Y1-KLH更早的产生Th1型应答。免疫Y2-KLH能够诱发机体产生强烈的体液免疫应答及较弱的细胞免疫应答;免疫Y3-KLH能够诱导弱的细胞免疫应答但不能引起强的STn特异性抗体免疫应答。不加佐剂辅助或在构建的小鼠腋下荷瘤模型上,疫苗Y4-KLH都呈现一定程度的抗肿瘤效果。接下来选用CRM197作为载体蛋白,研究Y4-CRM197结合不同佐剂在健康小鼠上引发的免疫应答。结果显示在无佐剂辅助或C34佐剂辅助疫苗应答的情况下,用Y4-CRM197免疫健康小鼠可以提高机体的体液免疫应答。在弗氏佐剂存在的情况下,免疫Y4-CRM197能够提高机体的细胞和体液免疫应答。在小鼠结肠癌肺转移模型上,C34作为佐剂,疫苗Y4-CRM197与Y1-CRM197相比,虽然抗肿瘤效果没有明显差别,但疫苗Y4-CRM197能够提高脾淋巴细胞分泌IFN-γ的能力,提高Th1型免疫应答,同时促进体液免疫应答。第二部分:α-半乳糖神经酰胺（α-galactosylceramide,αGC）是NKT细胞的快速激活剂,MUC1是肿瘤相关的糖肽抗原。本文首次将αGC与MUC1共价偶联,进行免疫活性研究。结果显示αGC-MUC1可以活化DC及iNKT细胞,释放大量的IFN-γ及IL-4;提高CD4+T细胞的含量且提高CTL活性;活化B细胞,促进机体产生快速且强烈的抗原特异性的抗体应答,产生多种抗原特异性的IgG亚型,提高记忆B细胞及经历体细胞突变的记忆B细胞的含量。寡核苷酸CPG1826是Toll样受体9（Toll like receptor 9,TLR9）的激动剂,将MUC1与CPG1826共价偶联同样可以激活DC及iNKT细胞;促进CTL的活性及提高脾脏中CD4+T细胞的含量;可以促进机体产生快速且强烈的抗体应答;提高记忆B细胞及经历体细胞突变的记忆B细胞的含量。首次将αGC及CPG1826同时与MUC1共价偶联,免疫活性结果显示其可以激活DC及iNKT细胞,促进机体释放IFN-γ及IL-4。能够提高CTL的活性及提高脾脏中CD4+T细胞的含量,促进脾淋巴细胞释放细胞因子IFN-γ。可以促进机体产生快速的抗体应答,活化B细胞,提高记忆B细胞及经历体细胞突变的记忆B细胞的含量。综上所述,本文基于具有交叉反应的抗原修饰策略,在肿瘤模型上证明了氟修饰的STn作为候选抗肿瘤疫苗的应用价值,为抗肿瘤糖疫苗提供了候选分子,为氟修饰TACA作为候选抗肿瘤疫苗的应用奠定了基础;首次将αGC与肿瘤相关的糖肽抗原表位共价偶联,应用在抗肿瘤内源佐剂疫苗中;也首次将αGC及CPG1826同时与抗原表位共价偶联,为基于内源佐剂抗肿瘤疫苗策略的研究提供了新的思路。
常建新[9]（2017）在《马流产沙门菌FliC和马疱疹病毒gD基因融合表达及FliC对gD质粒DNA的免疫增强效果的研究》文中研究指明马流产沙门菌（Salmonella abortus equi）可引起马属动物的马流产沙门菌病,又名马副伤寒,其典型特征为孕马流产。随着新疆马匹养殖数量的增加,该病已严重危害马养殖业的发展。马鼻肺炎是由马疱疹病毒（Equine herpes virus,EHV）1型和4型引起的严重危害新疆养马业的重要传染病之一,马疱疹病毒1型可引起妊娠母马流产,流行较广泛,可造成严重经济损失。FliC是马流产沙门菌重要的鞭毛蛋白及分子佐剂。gD为马疱疹病毒免疫及保护的有效蛋白。为探讨鞭毛蛋白FliC对马疱疹病毒gD的分子佐剂效应,本研究对马流产沙门菌FliC和马疱疹病毒gD基因进行融合表达并阐明FliC对gD质粒DNA的免疫增强效果。本研究用PCR方法分别扩增FliC基因和gD基因的主要抗原表位,利用重叠延伸法将这2个基因进行融合,构建真核表达质粒pVAX1-FliC-gD,利用间接免疫荧光和western blotting鉴定重组蛋白的表达。将提取纯化的重组质粒免疫C57BL/6小鼠,并设pVAX1-gD、pVAX1-FliC、pVAX1和PBS为对照。第二次免疫后三周以1×105 PFU剂量的EHV-1-XJ2015滴鼻感染小鼠,并以马流产沙门菌最小致死量2×109 CFU/ml攻击小鼠。对免疫小鼠的抗体水平、抗体亚型、IFN-γ和IL-4的水平和肺组织病毒含量进行检测,并对肺组织病理学变化进行观察。结果表明成功构建了重组质粒pVAX1-FliC-gD、pVAX1-gD、pVAX1-FliC,经间接免疫荧光和western blotting鉴定该真核重组质粒可在体外表达。将提取纯化的重组质粒免疫C57BL/6小鼠,二免后抗体效价可达1:3200,融合表达质粒pVAX1-FliC-gD组小鼠血清中的总IgG1、IgG2a亚类和IFN-γ、IL-4水平均较pVAX1-gD免疫组、pVAX1-FliC免疫组显着增高（P<0.01）。马流产沙门菌攻击小鼠后,pVAX1-FliC-gD免疫组对小鼠的保护力为58.3%。荧光定量PCR法检测小鼠肺脏病毒DNA含量,结果表明攻毒后第5 d pVAX1及PBS免疫组病毒DNA含量最高,达到3.3×104 copies/μL,且pVAX1-FliC-gD免疫组、pVAX1-gD免疫组病毒DNA含量相对于pVAX1及PBS免疫组有明显减少（P<0.01）。组织病理学观察结果表明:pVAX1-FliC-gD免疫组、pVAX1-gD免疫组能有效限制马疱疹病毒在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化。上述结果显示FliC作为分子佐剂可显着增强马疱疹病毒gD基因的免疫效果,为马疱疹病毒新型疫苗的研究奠定了基础。
汤如[10]（2017）在《靶向DC的DNA疫苗pRSC-NLDC145·gD-IL-21的研制及抗鼠眼角膜HSV-1感染的初步研究》文中研究说明目的:构建靶向树突状细胞（DC）的DNA疫苗pRSC-NLDC145·gD-IL-21,针对抵抗鼠眼角膜单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的感染,探讨其是否能产生更强的免疫应答反应。方法:通过经典基因克隆方法,首先经过限制性内切酶酶切,切除了原先PRSC-gD-IL-21（现存质粒）中gD基因,再通过酶切及连接反应使NLDC145与gD相连克隆至原来gD的克隆位点上,保留原先另一克隆位点IL-21的免疫佐剂的作用,构建靶向DC的重组质粒pRSC-NLDC145·gD-IL-21,对其进行相关鉴定,并和壳聚糖（chitosan）包裹组成纳米HSV DNA疫苗,分别以靶向组pRSC-NLDC145·gD-IL-21 +chitosan、非靶向组 pRSC-gD-IL-21+ chitosan、pRSC+ chitosan 和 chitosan 免疫小鼠 3 次,间隔2周,从而检测各疫苗对小鼠免疫应答的水平及对HSV-1眼部感染的免疫保护反应。结果:靶向DC的重组质粒pRSC-NLDC145·gD-IL-21,经基因测序、酶切鉴定后,序列完全正确;此重组质粒经蛋白印迹方法鉴定,其目的蛋白能在真核细胞内成功表达;且和纳米壳聚糖包裹形成包封率较高的靶向DNA疫苗组,与非靶向组比较,血清中HSV-1病毒中和抗体水平、小鼠泪液中特异性sIgA分泌水平以及CTL、NK细胞杀伤活性程度均明显增高,同时针对HSV-1眼部感染产生了更强的免疫保护反应。结论:成功研制的靶向DC的DNA疫苗pRSC-NLDC145～gD-IL-21,经小鼠眼表粘膜接种后诱导了更强的免疫应答保护反应,同时也间接证明了其目的抗原可最终靶向于DC,为今后该疫苗应用于治疗复发性单纯疱疹病毒性角膜炎（HSK）奠定了坚实的基础。
二、单纯疱疹病毒gD2 DNA疫苗诱导动物的细胞免疫应答（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、单纯疱疹病毒gD2 DNA疫苗诱导动物的细胞免疫应答（论文提纲范文）
（1）利用突变技术对HSV2 RL1、UL41和US12蛋白在病毒致病中的生物学机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 单纯疱疹病毒2型概述 |
| 单纯疱疹病毒2型的结构及其生物学特征 |
| 单纯疱疹病毒感染与宿主免疫应答 |
| 单纯疱疼病毒2型疫苗研究现状 |
| 单纯疱疹病毒2型感染与性激素 |
| 性类固醇激素及其受体 |
| 性类固醇激素调节免疫能力 |
| 性类固醇激素与能量代谢 |
| 研究思路 |
| 第一部分 HSV-2突变株的构建及其生物学特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 实验用动物 |
| 1.1.4 质粒与载体 |
| 1.1.5 试剂和商品化溶液 |
| 1.1.6 主要耗材 |
| 1.1.7 主要仪器设备 |
| 1.1.8 主要溶液及配置 |
| 1.1.9 引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.1.1 细胞复苏 |
| 1.2.1.2 细胞传代 |
| 1.2.1.3 细胞冻存 |
| 1.2.1.4 细胞计数 |
| 1.2.2 病毒培养 |
| 1.2.2.1 病毒的扩增及收获 |
| 1.2.2.2 病毒滴度的测定 |
| 1.2.3 PX330质粒的构建 |
| 1.2.4 HSV-2突变株的构建 |
| 1.2.4.1 质粒转染 |
| 1.2.4.2 病毒感染 |
| 1.2.4.3 收获病毒 |
| 1.2.4.4 病毒核酸的提取 |
| 1.2.4.5 病毒基因组PCR鉴定 |
| 1.2.4.6 病毒克隆的筛选、扩增和鉴定 |
| 1.2.5 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在细胞水平的生物学特性分析 |
| 1.2.5.1 病毒增殖动力学测定 |
| 1.2.5.2 Vero细胞蚀斑形态分析 |
| 1.2.5.3 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4感染VK2细胞,细胞中免疫相关信号分子的表达分析 |
| 1.2.6 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在动物水平的生物学特性分析 |
| 1.2.6.1 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在动物水平的急性感染分析 |
| 1.2.6.2 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在动物水平的潜伏感染分析 |
| 1.2.6.3 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在动物水平的免疫原性分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 HSV-2突变毒株的构建和纯化 |
| 2.2 HSV-2 M2、M3、M4突变株在细胞水平的生物学特性分析 |
| 2.2.1 HSV-2 M2、M3、M4突变株病毒增殖动力学测定 |
| 2.2.2 HSV-2 M2、M3、M4突变株在Vero细胞上的蚀斑形态分析 |
| 2.2.3 HSV-2 M2、M3、M4突变株在VK2细胞中免疫相关信号分子转录水平检测 |
| 2.2.4 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在动物水平的生物学特性分析 |
| 2.2.4.1 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在动物水平的急性感染分析 |
| 2.2.4.2 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在动物水平的潜伏感染分析 |
| 2.2.4.3 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4的免疫原性分析 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 HSV-2突变株M1、HSV-2突变株M2、HSV-2突变株M3与野毒株感染后小鼠阴道、子宫和卵巢的转录组学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒 |
| 1.1.2 商品化试剂 |
| 1.1.3 引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 本试验所用细胞、病毒和病毒感染后动物水平与第一部分急性期感染相同,不同的内容如下: |
| 1.2.2 动物感染 |
| 1.2.3 HSV-2野毒株和HSV-2 M1突变株感染后小鼠阴道、子宫和卵巢转录组学检测分析 |
| 1.2.4 转录组数据分析 |
| 1.2.4.1 差异基因分层聚类(Heatmap) |
| 1.2.4.2 差异基因GO富集分析 |
| 1.2.4.3 差异基因KO富集分析 |
| 1.2.5 数据分析数据库和软件 |
| 1.2.6 HSV-2野毒株和HSV-2突变株M1感染VK2细胞后免疫和代谢相关分子检测 |
| 1.2.7 HSV-2野毒株和HSV-2突变株M1感染小鼠后血清中激素及其代谢相关分子检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2 M3突变株感染后小鼠阴道、子宫和卵巢差异基因分析 |
| 2.1.1 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2 M3突变株感染后小鼠阴道、子宫和卵巢差异基因总体概况 |
| 2.1.2 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2 M3突变株感染后小鼠阴道差异基因分析 |
| 2.1.2.1 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株初HSV-2M3突变株感染后小鼠阴道差异基因GO富集分析 |
| 2.1.2.2 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2M3突变株感染后小鼠阴道差异基因KEGG分析 |
| 2.1.3 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2 M3突变株感染后小鼠子宫差异基因分析 |
| 2.1.3.1 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2M3突变株感染后小鼠子宫差异基因GO富集分析 |
| 2.1.3.2 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2M3突变株感染后小鼠子宫差异基因KEGG分析 |
| 2.1.4 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2 M3突变株感染后小鼠卵巢差异基因分析 |
| 2.1.4.1 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2M3突变株感染后小鼠卵巢差异基因GO富集分析 |
| 2.1.4.1 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2M3突变株感染后小鼠卵巢差异基因KEGG富集分析 |
| 2.1.5 HSV-2野毒株、HSV-2突变株M1、HSV-2突变株M2和HSV-2突变株M3感染后小鼠阴道、子宫和卵巢性类固醇激素相关基因热图分析 |
| 2.1.6 HSV-2野毒株、HSV-2突变株M1、HSV-2突变株M2和HSV-2突变株M3感染后小鼠阴道、子宫和卵巢细胞色素相关基因热图分析 |
| 2.2 HSV-2野毒株和HSV-2突变株M1感染VK2细胞后代谢相关分子检测分析 |
| 2.3 HSV-2野毒株和HSV-2突变株M1感染小鼠后血清中激素及其代谢相关分子检测分析 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 论文综述 单纯疱疹病毒与天然免疫系统的相互作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 研究生个人简历 |
（2）2型单纯疱疹病毒gD亚单位相关疫苗佐剂筛选及免疫学评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 生殖器疱疹与单纯疱疹病毒 |
| 1.1.1 生殖器疱疹 |
| 1.1.2 单纯疱疹病毒 |
| 1.2 生殖器疱疹治疗 |
| 1.2.1 生殖器疱疹临床治疗 |
| 1.2.2 HSV-2 疫苗研究 |
| 1.3 佐剂 |
| 1.3.1 佐剂的定义及分类 |
| 1.3.2 佐剂及其作用机制 |
| 1.4 立题思路、创新点及实验设计 |
| 1.4.1 立题思路 |
| 1.4.2 创新点 |
| 1.4.3 实验设计思路 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料、仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 相关试剂及配制溶液 |
| 2.1.3 相关试剂盒 |
| 2.1.4 菌株、质粒、细胞、抗体、病毒、动物 |
| 2.1.5 抗原表位肽 |
| 2.2 目的蛋白制备及纯化实验方法 |
| 2.2.1 抗原基因的获取 |
| 2.2.2 抗原基因gD2、gD2-PA的表达及鉴定 |
| 2.3 gD相关亚单位疫苗研究实验方法 |
| 2.3.1 gD2 亚单位疫苗的制备 |
| 2.3.2 gD2-PA融合蛋白与黏膜佐剂BLP的结合及定量 |
| 2.3.3 动物实验免疫方案 |
| 2.3.4 免疫原性检测 |
| 2.3.5 免疫保护性研究 |
| 第三章 HSV-2 gD亚单位相关疫苗研究结果及分析 |
| 3.1 目的基因的获取、蛋白表达验证及纯化 |
| 3.1.1 pSecTag2A-gD2 真核表达质粒的构建 |
| 3.1.2 gD2 蛋白及gD2-PA重组融合蛋白表达验证 |
| 3.1.3 gD2 蛋白及gD2-PA融合蛋白纯化及检测 |
| 3.2 gD2-PA重组融合蛋白的BLP载量测定及结合定量 |
| 3.2.1 gD2-PA重组融合蛋白的BLP负载量确定 |
| 3.2.2 gD2-PA-BLP免疫原制备及蛋白结合定量 |
| 3.3 多种佐剂gD亚单位相关疫苗免疫原性评价 |
| 3.3.1 ELISA法检测血清特异性抗体 |
| 3.3.2 黏膜特异性IgA抗体检测 |
| 3.3.3 脾细胞刺激物细胞因子检测 |
| 3.3.4 血清中和抗体检测 |
| 3.4 多种佐剂gD亚单位相关疫苗保护性评价 |
| 3.4.1 小鼠存活率评价 |
| 3.4.2 生殖道病理评级 |
| 3.4.3 阴道病毒载量检测 |
| 3.5 结果讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）HSV-2突变株的构建及其生物学特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| HSV-2概述 |
| HSV-2的基因组及其病毒生活史 |
| HSV感染引起的免疫反应以及免疫逃逸 |
| “神经毒力因子”ICP34.5 |
| ICP34.5介导宿主关闭蛋白合成的逆转 |
| ICP34.5可抑制Ⅰ型干扰素的产生 |
| ICP34.5抑制细胞自噬 |
| 潜伏相关转录因子—一LAT |
| HSV感染细胞引起应激颗粒形成 |
| HSV感染的动物模型 |
| HSV感染动物引起类似恶病质的临床症状 |
| 实验思路 |
| 第一部分 HSV-2突变株RL1-HSV-2的构建及其引起的类恶病质临床症状和相关的转录调控功能分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1. 材料 |
| 1.1.1 病毒 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 质粒与载体 |
| 1.1.5 抗体 |
| 1.1.6 溶液和商品化试剂 |
| 1.1.7 主要设备仪器 |
| 1.1.8 主要耗材 |
| 1.1.9 引物 |
| 1.1.10 主要溶液及配置 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.1.1 细胞复苏 |
| 1.2.1.2 细胞传代 |
| 1.2.1.3 细胞计数 |
| 1.2.1.4 细胞冻存 |
| 1.2.2 病毒培养 |
| 1.2.2.1 病毒扩增及收获 |
| 1.2.2.2 病毒滴度测定 |
| 1.2.3 质粒构建 |
| 1.2.3.1 PX330质粒构建 |
| 1.2.3.2 pEGFP-RL1质粒的构建 |
| 1.2.3.3 pcDNA3.1(+)-RL1-/pcDNA3.1(+)-RL1质粒的构建 |
| 1.2.3.4 pGL-ICP0, pGL-ICP4, pGL-ICP22, pGL-US11质粒的构建 |
| 1.2.3.5 pGEM(?)-T-US4质粒的构建 |
| 1.2.3.6 感受态大肠杆菌转化 |
| 1.2.3.7 筛选目的单菌落 |
| 1.2.3.8 无内毒素质粒小量提取 |
| 1.2.3.9 质粒转染 |
| 1.2.4 HSV-2突变株RL1-HSV-2的构建和纯化 |
| 1.2.4.1 病毒感染 |
| 1.2.4.2 病毒收获 |
| 1.2.4.3 病毒基因组提取 |
| 1.2.4.4 病毒基因组PCR鉴定 |
| 1.2.4.5 分离病毒克隆 |
| 1.2.5 RL1-HSV-2补偿病毒的构建 |
| 1.2.5.1 质粒转染 |
| 1.2.5.2 病毒感染 |
| 1.2.5.3 补偿病毒中RL1分子表达量的检测 |
| 1.2.6 突变株RL1-HSV-2在细胞水平的生物学特性分析 |
| 1.2.6.1 病毒增殖动力学检测 |
| 1.2.6.2 Vero、VK2细胞蚀斑形态分析 |
| 1.2.6.3 VK2细胞中细胞因子、应激反应因子以及RL1相关病毒基因转录水平检测 |
| 1.2.6.4 突变株RL1-HSV-2细胞凋亡检测 |
| 1.2.7 突变株RL1-HSV-2以及野毒株HSV-2编码的RL1蛋白对基因ICP0,ICP4,ICP22,US11启动子的调控作用分析 |
| 1.2.8 突变株RL1-HSV-2在动物水平的生物学特性分析 |
| 1.2.8.1 突变毒株RL1-HSV-2的急性感染能力分析 |
| 1.2.9 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HSV-2突变株RL1-HSV-2的构建和纯化 |
| 2.2 RL1-HSV-2突变株的生物学特性 |
| 2.2.1 RL1-HSV-2在细胞中的增殖动力学分析 |
| 2.2.2 RL1-HSV-2在VK2细胞和Vero细胞中的蚀斑形态分析 |
| 2.3 RL1-HSV-2补偿病毒的构建及其RL1分子表达量的分析 |
| 2.4 RL1-HSV-2感染动物后的临床病理特征 |
| 2.4.1 RL1-HSV-2感染动物后的临床表现 |
| 2.4.2 RL1-HSV-2感染小鼠后的组织病理分析 |
| 2.4.3 RL1-HSV-2感染小鼠后阴道周围肌肉组织的电镜分析以及神经组织和主要器官的组织化学分析 |
| 2.5 RL1-HSV-2引起的类似恶病质反应 |
| 2.5.1 RL1-HSV-2可引起类似恶病质的临床症状 |
| 2.5.2 RL1-HSV-2引起的类似恶病质的炎性因子及血生化水平分析 |
| 2.6 RL1-HSV-2感染细胞后的应激反应 |
| 2.7 RL1- HSV-2感染小鼠后急性感染期器官组织的病毒载量分析 |
| 2.8 ICP34.5参与病毒基因的转录 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 HSV-2突变株LAT-HSV-2和RL1-LAT-HSV-2的构建及其生物学特性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 本部分所用病毒、细胞、实验动物、质粒与载体、细胞培养、细胞培养用溶液、商品化试剂与溶液、主要溶液、耗材和设备同第一部分,与第一部分不同的内容如下 |
| 1.1.2 病毒 |
| 1.1.3 抗体 |
| 1.1.4 试剂盒 |
| 1.1.5 引物及肽段 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 本部分所用细胞培养、病毒培养、质粒构建、质粒转化及转染、突变株的构建、突变株在细胞水平的生物学特性分析均同第一部分,与第一部分不同的内容如下 |
| 1.2.2 病毒突变株LAT基因组PCR鉴定 |
| 1.2.3 突变株RL1-LAT-HSV-2以及LAT-HSV-2在动物水平的生物学特性分析 |
| 1.2.3.1 突变株感染小鼠后的急性感染能力分析 |
| 1.2.3.2 突变株感染小鼠后的潜伏感染能力分析 |
| 1.2.4 小鼠脾脏淋巴细胞的分离 |
| 1.2.5 CD3+T细胞检测 |
| 1.2.6 IFN-γ Elispot检测 |
| 1.2.7 骶背根神经节离体重激活分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 HSV-2突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2的构建 |
| 2.2 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在细胞水平的生物学特性 |
| 2.2.1 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在细胞的增殖动力学 |
| 2.2.2 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在Vero细胞的蚀斑形态分析 |
| 2.3 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的急性感染生物学特性 |
| 2.3.1 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在小鼠模型上的急性感染的临床表现特征 |
| 2.3.2 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在小鼠模型上的急性感染的组织病理分析 |
| 2.3.3 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在小鼠模型上感染部位的炎性因子水平变化 |
| 2.3.4 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在小鼠模型上急性感染的组织载量分析 |
| 2.4 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的潜伏感染能力分析 |
| 2.4.1 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的潜伏感染期的组织载量分析 |
| 2.4.2 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的潜伏感染期的组织病理结果分析 |
| 2.4.3 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的潜伏感染期的骶背根神经节重激活能力分析 |
| 2.5 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的特异性免疫反应 |
| 2.5.1 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2感染小鼠后脾脏淋巴细胞中CD3+T淋巴细胞数量的变化 |
| 2.5.2 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2感染小鼠后脾脏淋巴细胞中IFN-γ特异性T淋巴细胞数量的变化 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 论文综述 单纯疱疹病毒2型疫苗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 论文中突变毒株的突变基因序列 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 研究生个人简历 |
（4）牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛病毒性腹泻(BVD)研究进展 |
| 1.1.1 BVD的病原学 |
| 1.1.2 BVD的流行病学 |
| 1.1.3 BVD疫苗研究进展 |
| 1.2 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)研究进展 |
| 1.2.1 BVDV基因组结构 |
| 1.2.2 BVDV编码的结构蛋白及功能 |
| 1.3 牛传染性鼻气管炎(IBR)研究进展 |
| 1.3.1 IBR的病原学 |
| 1.3.2 IBR的流行病学 |
| 1.3.3 IBR疫苗研究进展 |
| 1.4 牛疱疹病毒1型(BHV-1)研究进展 |
| 1.4.1 BHV-1的基因组结构 |
| 1.4.2 BHV-1编码的结构蛋白及其功能 |
| 1.5 内部核糖体进入位点(IRES)研究进展 |
| 1.5.1 IRES简介 |
| 1.5.2 IRES结构特点及其在载体表达中的应用 |
| 1.6 试验目的及意义 |
| 第二章 BVDV E0和IBRV gD基因的克隆与生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 毒株、菌株与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 BVDV E0与IBRV gD基因的克隆 |
| 2.1.5 BVDV E0与IBRV gD基因生物信息学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的片段PCR扩增结果 |
| 2.2.2 目的基因测序结果 |
| 2.2.3 生物信息学分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 BVDV E0基因的选择 |
| 2.3.2 IBRV gD基因的选择与扩增 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建与体外表达检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 重组表达载体的设计 |
| 3.1.5 重组载体pVAX1-IRES的构建 |
| 3.1.6 重组载体pVAX1-EO-IRES的构建 |
| 3.1.7 重组载体pVAX1-E0-IRES-gD的构建 |
| 3.1.8 pVAX1-E0-IRES-gD载体中目的基因体外表达的检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 pVAX1-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.2 pVAX1-E0-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.3 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建 |
| 3.2.4 真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD在293T细胞中的表达情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 重组质粒的构建 |
| 3.3.2 目的蛋白的表达 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒和二联灭活苗 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 大量抽提质粒DNA |
| 4.1.6 小鼠的分组与免疫 |
| 4.1.7 样品采集 |
| 4.1.8 免疫小鼠血清中E0抗体检测 |
| 4.1.9 免疫小鼠血清中gD抗体检测 |
| 4.1.10 细胞因子检测 |
| 4.1.11 脾淋巴细胞增殖实验(MTT法) |
| 4.1.12 数据处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 免疫小鼠血清中E0抗体检测结果 |
| 4.2.2 免疫小鼠血清中gD抗体检测结果 |
| 4.2.3 免疫小鼠血清中IFN-γ检测结果 |
| 4.2.4 免疫小鼠血清中IL-4检测结果 |
| 4.2.5 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 小鼠免疫试验后抗E0和gD IgG抗体含量变化 |
| 4.3.2 小鼠免疫试验后细胞因子含量变化 |
| 4.3.3 脾淋巴细胞反应 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）单纯疱疹病毒2型疫苗的研究进展（论文提纲范文）
| 1 HSV-2的概况 |
| 1.1 结构与复制 |
| 1.2 预防与治疗 |
| 2 HSV-2疫苗研究的现状和进展 |
| 2.1 灭活疫苗 |
| 2.2 亚单位疫苗 |
| 2.3 复制缺陷疫苗 |
| 2.3.1 预防性疫苗 |
| 2.3.2 治疗性疫苗 |
| 2.4 减毒活疫苗 |
| 2.5 DNA疫苗 |
| 2.5.1 预防性疫苗 |
| 2.5.2 治疗性疫苗 |
| 2.6 多肽疫苗 |
| 2.6.1 预防性疫苗 |
| 2.6.2 治疗性疫苗 |
| 3 展望 |
（6）鸭甲肝病毒3型广东分离株致病性及表达其VP1基因重组鸭肠炎病毒免疫效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 英文摘要 1 引言 |
| 1.1 鸭病毒性肝炎的概述 |
| 1.1.1 鸭肝炎的流行病学特点 |
| 1.1.2 鸭肝炎的临床症状及病理变化 |
| 1.1.3 鸭病毒性肝炎的诊断 |
| 1.1.4 鸭肝炎疫苗的研究进展 |
| 1.1.5 鸭肝炎卵黄抗体及高免血清的研究进展 |
| 1.1.6 展望 |
| 1.2 鸭甲肝病毒的研究进展 |
| 1.2.1 鸭甲肝病毒的分类 |
| 1.2.2 病原学特征 |
| 1.2.3 鸭肝炎病毒基因组结构与功能 |
| 1.2.4 鸭肝炎病毒的复制 |
| 1.3 鸭病毒性肠炎概述 |
| 1.3.1 流行病学 |
| 1.3.2 临床症状 |
| 1.3.3 病理损伤及病理变化 |
| 1.3.4 诊断 |
| 1.3.5 鸭病毒性肠炎疫苗的研究进展 |
| 1.4 鸭肠炎病毒研究进展 |
| 1.4.1 鸭肠炎病毒的生物学特性 |
| 1.4.2 致病机制 |
| 1.4.3 鸭肠炎病毒的复制 |
| 1.4.4 鸭肠炎病毒的分子生物学特性 |
| 1.4.5 鸭肠炎病毒US10基因的研究进展 |
| 1.5 重组DEV活载体疫苗的研究进展 |
| 1.6 Cre/LoxP重组系统的概述 |
| 1.6.1 Cre/LoxP重组的产生及其特性 |
| 1.6.2 Cre/LoxP重组系统在重组病毒研究中的应用 |
| 1.7 病毒感染鸭的天然免疫应答的研究 |
| 1.7.1 DHAV感染鸭的天然免疫应答的研究 |
| 1.7.2 DEV感染鸭的天然免疫应答的研究 |
| 1.7.3 其他病原感染鸭的天然免疫应答的研究 |
| 1.8 本研究的目的与意义 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 毒株、菌株、抗体及载体等 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 鸭甲肝病毒3型致病性的研究 |
| 2.2.2 DHAV-3感染雏鸭肝脏的转录组分析 |
| 2.2.3 雏鸭感染DHAV-3天然免疫应答相关分子的检测 |
| 2.2.4 DHAV-3全基因的克隆 |
| 2.2.5 DHAV-3 VP1基因的克隆及其抗原优势区的鉴定 |
| 2.2.6 重组病毒转移载体的构建 |
| 2.2.7 含筛选标记gpt的重组病毒的筛选、纯化及鉴定 |
| 2.2.8 不含筛选标记gpt的重组病毒的筛选及纯化 |
| 2.2.9 重组病毒rDEV-AUs10-3-VP1的鉴定 |
| 2.2.10 重组病毒生物学特性的基本研究 |
| 2.2.11 免疫及效果评价 3 结果与分析 |
| 3.1 DHAV-3的致病性研究 |
| 3.1.1 DHAV-3致死鸭胚及雏鸭临床症状的观察 |
| 3.1.2 感染DHAV-3雏鸭肝脏中病毒的RT-PCR鉴定 |
| 3.1.3 DHAV-3致死鸭胚肝脏及雏鸭各组织病理组织切片观察 |
| 3.1.4 病毒粒子形态的观察 |
| 3.1.5 DHAV-3的冻干 |
| 3.1.6 DHAV-3的毒力鉴定 |
| 3.2 转录组测序分析雏鸭感染DHAV-3后差异基因的表达 |
| 3.2.1 差异表达基因的筛选 |
| 3.2.2 差异表达基因的GO富集分析 |
| 3.2.3 差异表达基因的KEGG富集分析 |
| 3.2.4 差异表达基因的RT-qPCR验证 |
| 3.3 DHAV-3感染鸭的天然免疫应答的研究 |
| 3.3.1 DHAV-3致死雏鸭各组织内病毒载量检测 |
| 3.3.2 雏鸭感染DHAV-3后肝脏及脾脏病毒载量检测 |
| 3.3.3 雏鸭感染DHAV-3后肝脏及脾脏病理切片观察 |
| 3.3.4 雏鸭感染DHAV-3后肝脏及脾脏免疫相关分子的检测 |
| 3.4 DHAV-3全基因的克隆及序列分析 |
| 3.4.1 DHAV-3全基因的克隆及鉴定 |
| 3.4.2 DHAV-3序列的同源性比对及系统进化树分析 |
| 3.5 DHAV-3 VP1基因的克隆及其抗原优势区的鉴定 |
| 3.5.1 DHAV-3 VP1基因的PCR扩增及其克隆载体的构建 |
| 3.5.2 DHAV-3 VP1分段截短表达 |
| 3.5.3 DHAV-3 VP1抗原优势区的鉴定 |
| 3.6 重组病毒转移载体的构建 |
| 3.6.1 筛选标记gpt-loxP表达盒的构建 |
| 3.6.2 VP1表达盒的构建 |
| 3.6.3 重组病毒转移载体的构建 |
| 3.7 不含筛选标记gpt的重组病毒的筛选及鉴定 |
| 3.7.1 含筛选标记gpt重组病毒的PCR鉴定 |
| 3.7.2 Cre基因的克隆及其真核表达载体的构建 |
| 3.7.3 不含筛选标记gpt重组病毒rDEV-△Us10-3-VP1的PCR鉴定 |
| 3.7.4 重组病毒rDEV-△Us10-3-VP1的RT-PCR鉴定 |
| 3.7.5 Western blot检测rDEV-△Us10-3-VP1中VP1蛋白的表达 |
| 3.7.6 rDEV-△Us10-3-VP1的VP1基因表达产物的IFA检测 |
| 3.8 重组病毒rDEV-△Us10-3-VP1基本生物学特性研究 |
| 3.8.1 重组病毒rDEV-△Us10-3-VP1中VP1基因遗传稳定性分析 |
| 3.8.2 重组病毒与亲本病毒蚀斑直径大小的比较 |
| 3.8.3 重组病毒rDEV-△Us10-3-VP1的电镜观察 |
| 3.8.4 重组病毒rDEV-△Us10-3-VP1生长曲线的绘制 |
| 3.9 免疫及效果评价 |
| 3.9.1 安全性试验 |
| 3.9.2 重组病毒免疫产蛋鸭及雏鸭后特异性抗体IgG的检测 |
| 3.9.3 中和抗体效价的测定 |
| 3.9.4 免疫血清中DHAV-3 VP1特异性抗体的Western blot鉴定 |
| 3.9.5 免疫鸭外周血淋巴细胞中CD4~+及CD8~+T淋巴细胞的检测 |
| 3.9.6 攻毒保护性试验 4 讨论 |
| 4.1 雏鸭感染DHAV-3的转录组测序 |
| 4.2 雏鸭感染DHAV-3的天然免疫应答 |
| 4.2.1 TLR7、RIG-1及MDA5的转录 |
| 4.2.2 IL-1β、IL-2及IL-6的转录 |
| 4.2.3 IFNs及ISGs的转录 |
| 4.3 DHAV-3 VP1抗原优势区的初步筛选 |
| 4.4 表达DHAV-3 VP1基因重组鸭肠炎病毒的构建 |
| 4.4.1 外源基因的选择 |
| 4.4.2 病毒载体的选择 |
| 4.4.3 US10基因作为插入位点 |
| 4.5 重组病毒的构建及筛选方法的选择 |
| 4.5.1 重组病毒的构建 |
| 4.5.2 重组病毒筛选方法的选择 |
| 4.6 DHAV-3 VP1基因在体外细胞内的表达 |
| 4.7 动物试验结果分析 |
| 4.7.1 免疫产蛋鸭血清及卵黄中的抗体检测 |
| 4.7.2 免疫产蛋鸭CD4~+T细胞与CD8~+T细胞的检测 |
| 4.7.3 攻毒保护性试验 5 结论 致谢 参考文献 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（7）单纯疱疹病毒包膜糖蛋白gC2、gD1、gD2的保护性与安全性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 豚鼠的保护性实验 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗原、对照与病毒株 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 确定致死性感染量 |
| 1.2.2 豚鼠攻毒模型的建立 |
| 1.2.3 豚鼠免疫后的病毒保护性实验 |
| 1.2.4 豚鼠生殖器病变的打分方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 豚鼠攻毒后15天发病得分 |
| 1.3.2 豚鼠攻毒后60天存活率 |
| 1.4 小节 |
| 1.5 分析与讨论 |
| 第二部分 BALB/c小鼠的急性毒性实验 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 抗原与对照 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 小鼠给药方案 |
| 2.2.2 观察指标 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 小鼠给药后反应 |
| 2.3.2 体重变化 |
| 2.3.3 采食量变化 |
| 2.3.4 大体解剖观察 |
| 2.4 小节 |
| 2.5 分析与讨论 |
| 第三部分 SD大鼠的长期毒性实验 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 抗原与对照 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 剂量设置 |
| 3.2.2 给药途径与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 大鼠给药后反应 |
| 3.3.2 体重变化 |
| 3.3.3 采食量变化 |
| 3.3.4 大体解剖观察 |
| 3.4 小节 |
| 3.5 分析与讨论 |
| 第四部分 Beagle犬的安全药理学实验 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 抗原与对照 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 剂量设置 |
| 4.2.2 给药途径与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 中枢神经系统实验 |
| 4.3.2 心血管系统实验 |
| 4.3.3 呼吸系统实验 |
| 4.4 小节 |
| 4.5 分析与讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 单纯疱疹病毒Ⅱ型疫苗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（8）基于结构修饰及内源佐剂策略的肿瘤糖疫苗的设计及活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词及中英文对照表 |
| 第一章 前言 |
| 1 肿瘤疫苗 |
| 1.1 肿瘤相关抗原 |
| 1.2 抗肿瘤疫苗免疫应答途径 |
| 2 肿瘤疫苗策略 |
| 2.1 肿瘤细胞疫苗 |
| 2.2 DC疫苗 |
| 2.3 基因疫苗 |
| 2.4 基于蛋白/肽的肿瘤疫苗 |
| 2.5 基于糖抗原的肿瘤疫苗 |
| 3 肿瘤糖疫苗概况 |
| 3.1 肿瘤相关糖抗原 |
| 3.2 基于TACAs开发的肿瘤疫苗的难点 |
| 4 肿瘤糖疫苗策略 |
| 4.1 基于载体开发的肿瘤糖疫苗 |
| 4.2 基于TACAs结构修饰开发的肿瘤糖疫苗 |
| 4.3 基于内源性佐剂开发的全合成肿瘤糖疫苗 |
| 5 本论文立体依据、研究内容及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于Tn-CRM197设计的疫苗活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 糖蛋白复合物制备 |
| 2.2 BCA法测蛋白含量 |
| 2.3 细胞培养 |
| 2.4 免疫方案 |
| 2.5 脾淋巴细胞分离 |
| 2.6 酶联免疫吸附斑点实验 |
| 2.7 血清效价分析 |
| 2.8 流式细胞术检测抗体识别肿瘤细胞 |
| 2.9 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 Tn-CRM197 糖蛋白复合物的合成与鉴定 |
| 3.2 血清学评价 |
| 3.3 T细胞免疫应答评价 |
| 3.4 FACS分析小鼠血清识别肿瘤细胞表面Tn抗原 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于STn设计的疫苗活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 糖蛋白复合物制备 |
| 2.2 BCA法测蛋白含量 |
| 2.3 间苯二酚法测唾液酸含量 |
| 2.4 细胞培养 |
| 2.5 免疫方案 |
| 2.6 脾淋巴细胞增殖实验 |
| 2.7 ELISPOT实验 |
| 2.8 CTL分析 |
| 2.9 血清效价分析 |
| 2.10 流式细胞术检测抗体识别肿瘤细胞 |
| 2.11 ADCC分析 |
| 2.12 CDC分析 |
| 2.13 统计学处理 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 糖蛋白复合物的合成与鉴定 |
| 3.2 流式细胞术分析肿瘤细胞表面表达STn情况 |
| 3.3 疫苗在佐剂辅助时对肺部荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 3.4 疫苗在无佐剂辅助时对肺部荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 3.5 疫苗在佐剂辅助时对腋下荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 3.6 疫苗Y4-CRM197在健康小鼠中的免疫学活性评价 |
| 3.7 疫苗Y4-CRM197对肺部荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 疫苗αGC-MUC1的免疫活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 免疫方案 |
| 2.3 脾淋巴细胞分离及培养 |
| 2.4 ELISPOT实验 |
| 2.5 CTL分析 |
| 2.6 流式细胞术分析CD4~+T细胞 |
| 2.7 血清效价分析 |
| 2.8 流式细胞术分析B细胞表型 |
| 2.9 体内DC细胞,B细胞及iNKT细胞的激活 |
| 2.10 血清中细胞因子检测 |
| 2.11 ELISA检测血清中的细胞因子 |
| 2.12 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 疫苗αGC-MUC1的合成 |
| 3.2 疫苗αGC-MUC1对iNKT细胞的影响 |
| 3.3 疫苗αGC-MUC1对T细胞的影响 |
| 3.4 疫苗αGC-MUC1对B细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 疫苗MUC1-CPG1826 的免疫活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 免疫方案 |
| 2.3 脾淋巴细胞分离 |
| 2.4 ELISPOT实验 |
| 2.5 CTL分析 |
| 2.6 流式细胞术分析CD4~+T细胞 |
| 2.7 流式细胞术分析B细胞表型 |
| 2.8 体内DC细胞及B细胞的激活 |
| 2.9 血清中细胞因子检测 |
| 2.10 ELISA检测血清中的细胞因子 |
| 2.11 血清效价分析 |
| 2.12 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 疫苗MUC1-CPG1826的合成 |
| 3.2 疫苗MUC1-CPG1826对DC细胞的影响 |
| 3.3 疫苗MUC1-CPG1826对T细胞的影响 |
| 3.4 疫苗MUC1-CPG1826对B细胞的影响 |
| 3.5 疫苗MUC1-CPG1826对iNKT细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 疫苗αGC-MUC1-CPG1826的免疫活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 免疫方案 |
| 2.3 脾淋巴细胞分离及培养 |
| 2.4 ELISPOT实验 |
| 2.5 CTL分析 |
| 2.6 流式细胞术分析CD4~+T细胞及B细胞 |
| 2.7 流式细胞术分析体内DC细胞,B细胞及iNKT细胞的激活 |
| 2.8 血清中细胞因子检测 |
| 2.9 ELISA检测血清及细胞上清液中的细胞因子 |
| 2.10 血清效价分析 |
| 2.11 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 疫苗αGC-MUC1-CPG1826的合成 |
| 3.2 疫苗αGC-MUC1-CPG1826对iNKT细胞的影响 |
| 3.3 疫苗αGC-MUC1-CPG1826对T细胞的影响 |
| 3.4 疫苗αGC-MUC1-CPG1826对B细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文及着作情况 |
（9）马流产沙门菌FliC和马疱疹病毒gD基因融合表达及FliC对gD质粒DNA的免疫增强效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 马疱疹病毒概述 |
| 1.2 马疱疹病毒形态、基因组结构及主要结构蛋白和功能 |
| 1.3 马疱疹病毒gD基因研究进展 |
| 1.4 马鼻肺炎的防控 |
| 1.5 佐剂及其作用机理 |
| 1.6 佐剂分类 |
| 1.7 马流产沙门菌病概述 |
| 1.8 沙门菌鞭毛蛋白及其作为分子佐剂的研究 |
| 1.9 本研究的目的和意义 |
| 第2章 pVAX1-FliC、pVAX1-gD、pVAX1-FliC-gD 真核表达载体的构建与表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 马流产沙门菌融合鞭毛蛋白FliC增强马疱疹病毒gD质粒DNA免疫效果的分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）靶向DC的DNA疫苗pRSC-NLDC145·gD-IL-21的研制及抗鼠眼角膜HSV-1感染的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号、变量、缩略词等本论文专用术语注释表 |
| 绪论 |
| 综述 单纯疱疹病毒性角膜炎的发病机制及HSV疫苗研究进展 |
| 第一部分 DNA疫苗pRSC-NLDC145·gD-IL-21DNA的设计、构建及鉴定 |
| 前言 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二部分 纳米颗粒壳聚糖为载体的靶向DC的DNA疫苗pRSC-NLDC145·gD-IL-21DNA鼠眼表粘膜接种(局部滴眼)预防HSK的研究 |
| 前言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
四、单纯疱疹病毒gD2 DNA疫苗诱导动物的细胞免疫应答（论文参考文献）
- [1]利用突变技术对HSV2 RL1、UL41和US12蛋白在病毒致病中的生物学机制研究[D]. 牟唐维. 北京协和医学院, 2021(02)
- [2]2型单纯疱疹病毒gD亚单位相关疫苗佐剂筛选及免疫学评价[D]. 陈志军. 吉林大学, 2020(08)
- [3]HSV-2突变株的构建及其生物学特性分析[D]. 柳蕾. 北京协和医学院, 2020(05)
- [4]牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究[D]. 马小静. 宁夏大学, 2020
- [5]单纯疱疹病毒2型疫苗的研究进展[J]. 柳蕾,李琦涵. 微生物与感染, 2019(04)
- [6]鸭甲肝病毒3型广东分离株致病性及表达其VP1基因重组鸭肠炎病毒免疫效果的研究[D]. 张雪莲. 东北农业大学, 2017(01)
- [7]单纯疱疹病毒包膜糖蛋白gC2、gD1、gD2的保护性与安全性评价[D]. 徐亭亭. 南京医科大学, 2017(05)
- [8]基于结构修饰及内源佐剂策略的肿瘤糖疫苗的设计及活性研究[D]. 宋成程. 东北师范大学, 2017(05)
- [9]马流产沙门菌FliC和马疱疹病毒gD基因融合表达及FliC对gD质粒DNA的免疫增强效果的研究[D]. 常建新. 新疆农业大学, 2017
- [10]靶向DC的DNA疫苗pRSC-NLDC145·gD-IL-21的研制及抗鼠眼角膜HSV-1感染的初步研究[D]. 汤如. 东南大学, 2017(05)