一、抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体1A8的基因克隆及序列测定（论文文献综述）
龙航宇[1]（2019）在《产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶在三种宿主菌的表达及其抗菌活性》文中进行了进一步梳理产气荚膜梭菌是一种人兽共患病原菌,能引起人以及多种家禽家畜发病。鸡坏死性肠炎是由产气荚膜梭菌感染引起的肠道传染性疾病,它能导致肠道出血、坏死,病鸡体型消瘦、死亡,给全球家禽养殖业造成巨大经济损失,严重阻碍了养禽业的健康发展。随着抗生素的长期和不合理使用,细菌耐药性以及耐药谱正快速增强和扩展,抗生素类抗菌药物正面临前所未有的危机。本研究根据不同的表达菌,优化并合成裂解酶Cp51基因序列;Cp51基因连接于乳酸菌质粒PNZ8148形成重组质粒后,电转化进入电感受态乳酸菌NZ9000,构建乳酸菌重组表达菌NZ9000/PNZ8148-Cp51;Cp51基因连接于枯草芽孢杆菌质粒PHT43形成重组质粒后,电转化进入电感受态枯草芽孢杆菌WB800N,枯草芽孢杆菌重组表达菌WB800N/PHT43-Cp51;Cp51基因连接于表达载体p MAL-c5X形成重组质粒,转化进入化学感受态细胞BL21,构成大肠杆菌重组表达菌BL21/p MAL-c5X-NVCp51。结果三种重组菌均能表达噬菌体裂解酶,都具备抗菌活性。重组乳酸菌大量培养,经1 ng/m L的nisin溶液进行诱导表达,亲和层析柱纯化获得浓度为124μg/m L裂解酶,用比浊法测定,证明纯化的裂解酶能将产气荚膜梭菌OD600nm值从大于0.6降至0.2,具备较强的杀菌效果;重组乳酸菌与产气荚膜梭菌体外混合培养,通过活菌计数,重组乳酸菌组与对照组比较,能将产气荚膜梭菌活菌数从109CFU/m L降至108CFU/m L,证明重组乳酸菌在体外对产气荚膜梭菌有一定抑制效果;以球虫和产气荚膜梭菌共感染动物模型评价重组乳酸菌的抗菌效果,以109 CFU/天的量连续5天灌服重组乳酸菌,与阳性组对比,重组乳酸菌组的肠道病变值降低、产气荚膜梭菌活菌数降低和球虫卵囊数降低,表明重组乳酸菌在体内对产气荚膜梭菌也有抑制效果。成功构建Cp51基因的重组枯草芽孢杆菌重组菌,用IPTG诱导后经Western blot鉴定,成功表达裂解酶,但表达量低,对产气荚膜梭菌的抑制效果较乳酸菌微弱。使用带有MBP标签的p MAL-c5X载体,以大肠杆菌表达产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51与诺如病毒衣壳的融合蛋白NVCp51,大肠杆菌重组表达菌经最优条件诱导后超声破碎,经镍填料亲和层析柱纯化,获得大量可溶性重组蛋白,蛋白质量浓量达到504μg/m L。在人工模拟胃肠液中,经人工肠液和人工胃液处理过的裂解酶,相比不处理的重组裂解酶,杀菌活性仍有70%以及74%,说明蛋白稳定性较强。计算所得,1μg重组裂解酶蛋白具备20 U裂解酶活性。比浊法试验结果表明,质量浓度稀释至1μg/m L的重组裂解酶依旧具备强杀菌活性。以球虫和产气荚膜梭菌共感染动物模型评价NVCp51重组蛋白的抗菌效果,以高剂量1000 U或低剂量100 U量两个剂量人工灌服重组蛋白NVCp51,同时设地美硝唑药物对照组,以相对增重、料肉比、病变计分、活菌计数等指标进行比较分析,结果表明,高剂量的NVCp51蛋白有明显的抗菌效果,相比阳性组,各指标差异显着,与化药地美硝唑组相当,低剂量组有抗菌效果,但效果不如高剂量组。综上所述,产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶的三种重组表达菌构建成功,重组益生菌及重组菌表达的蛋白在体内与体外均对产气荚膜梭菌有一定抑制效果。
郭志侯[2]（2016）在《表达产气荚膜梭菌α-β2-ε-β1毒素的重组干酪乳杆菌的安全性评价及免疫效果的分析》文中进行了进一步梳理产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）属于梭菌属（Clostridium）,是创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及动物坏死性肠炎、肠毒血症等多种疾病的主要病原菌。菌体分泌的外毒素是其主要的致病因子,可以产生多达16种,根据产生的外毒素种类不同,可分为A、B、C、D和E 5个血清型,其中α、β、ε和ι是最主要的外毒素。产气荚膜梭菌感染是人、多种家畜、经济动物、野生动物最常见的一种人兽共患病,其发病急、死亡快,给我国畜牧业发展带来巨大的经济损失。疾病的发生通常是通过多种毒素共同作用引起,用单一毒素为免疫原制备的疫苗不能有效的抵抗异源毒素的攻击,因此制备多种毒素的免疫原,对于预防该疾病的发生更具有实际意义。本研究首先对实验室构建的重组干酪乳杆菌p PG-2-α-β2-ε-β1/L.casei 393进行生物安全评价。通过重组干酪乳杆菌在消化环境中生存性能及口服后在动物消化道内的定植能力、对兔子生产性能、血液理化指标、组织病理学、释放到环境中的能力进行研究。结果显示该重组干酪乳杆菌在p H值为4.5的胃液环境中作用5h后存活率为14.96%。在肠液环境中作用不同时间以后,在各个时间点均能检测到活菌数而且其存活率均大于2%,对2%胆盐浓度和8%的盐浓度具有良好的耐受能力。口服重组菌后第14d,仍保持较高的定植率,分别为15.1%,25.3%,48.2%,29.3%,可知重组菌在动物机体内各个肠段的定植能力都不一样,并且其在盲肠中的定植率最高。口服接种后未引起中毒反应和死亡,动物日采食量和日增重量与PBS组相比有明显的提高,且对兔子的血液生理指标和肝、肾功能等均无影响,组织病理学观察各组织也未发现病理学变化。通过PCR方法对饲料、饮水、笼子拭子、垫料样品进行检测,结果显示均未检测到重组干酪乳杆菌,表明重组干酪乳杆菌经口服后没有释放到环境中。为了进一步探讨重组干酪乳杆菌的免疫效果,本研究用产气荚膜梭菌易感动物兔子作为实验动物,进行口服免疫。实验动物分为三组,实验Ⅰ组口服免疫p PG-2-α-β2-ε-β1/L.casei 393重组菌,剂量为5×1010CFU/只;实验Ⅱ组每只兔子口服同等剂量的p PG-2/L.casei 393;实验组III口服同等剂量的PBS溶液。免疫程序为:共免疫三次,每次免疫间隔时间为2w,每次连续免疫3d,每天免疫1次。于免疫后不同时间收集动物粪便、鼻腔冲洗液和血清,分别测定了粪便、鼻腔冲洗液中特异性s Ig A水平以及血清中特异性IgG水平。ELISA检测结果表明,口服免疫重组干酪乳杆菌后,粪便、鼻腔冲洗液样品中均检测到了较高水平的特异性s Ig A,与空载体组、PBS组比较,结果差异显着,同时在血清中也检测到了较高水平的特异性Ig G抗体,表明口服重组干酪乳杆菌既可诱导机体产生局部的黏膜免疫应答,又可刺激机体产生系统的体液免疫应答。第三次免疫后7天,进行了毒素攻毒实验和组织病理学观察,以检测分析口服重组干酪乳杆菌对动物的保护作用。试验结果显示,免疫重组干酪乳杆菌后产生的特异性抗体能够完全抵抗1LD100的产气荚膜梭菌天然毒素的攻击。综上,口服重组干酪乳杆菌p PG-2-α-β2-ε-β1/L.casei 393对动物具有较好的安全性,不会引起动物生产性能、血液理化指标、组织病理学的变化,且不会释放到环境中。口服后可有效诱导机体产生黏膜免疫应答和体液免疫应答,对动物机体有良好的保护作用,通过本研究的开展,为产气荚膜梭菌α-β2-ε-β1毒素重组乳酸杆菌口服疫苗的应用奠定了基础。
杨文静[3]（2014）在《C型产气荚膜梭菌α毒素蛋白的表达及其特异性IgY抗体的制备》文中研究指明C型产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens Type C）可感染猪、马、牛、羊等各种家畜，3日龄内新生仔猪最易感，俗称仔猪红痢，病死率高，严重威胁我国的家畜养殖业发展。C型产气荚膜梭菌主要产生α、β1和β2三种毒素，其中α毒素具有细胞毒性、溶血性、致死性和皮肤坏死性等特性，是C型产气荚膜梭菌一种重要的毒力因子。目前对于C型产气荚膜梭菌引起的红痢的防治，主要采取的措施是给怀孕母猪于产前肌肉注射C型产气荚膜梭菌疫苗，仔猪出生后喂食初乳，从而获得被动免疫保护，同时与青霉素、土霉素等抗生素类药物联合使用，以达到治疗的效果。临床上对于抗体类药物的使用较少，因为一般的抗体类药物成本较高。近年来，卵黄抗体（IgY）通过口服等途径来被动保护哺乳动物疾病的研究增加，由于禽类与哺乳动物物种距离较远，对哺乳动物高保守蛋白具有强反应性，且IgY产量高，经济成本较低，制备简单，因此在预防和治疗哺乳动物消化道等疾病方面具有明显的经济优势和广阔的市场空间。本实验对C型产气荚膜梭菌α毒素蛋白进行原核表达，生产抗α毒素的特异性IgY抗体，为以后临床低成本抗体药物的研制奠定基础。研究内容分为以下3个部分：（1）C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆。根据Titball等（1989）报道的产气荚膜梭菌α毒素的基因序列，使用primer primer5.0软件，设计一对引物后，PCR进行扩增C型产气荚膜梭菌α毒素基因（1200bp），扩增的目的基因与T-Vector pMD19载体连接后，转化至DH5α细胞。进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落，提取T-Vector pMD19-α质粒进行酶切鉴定，阳性菌液送测序。（2）α毒素重组蛋白的表达、纯化。使用EcoR I和Xho I双酶切T-Vector pMD19-α和pET-32a载体，酶切回收片段进行连接，构建pET-32a-α表达载体。pET-32a-α质粒使用酶切和PCR鉴定，阳性质粒转化BL21（DE3）细胞，对IPTG诱导浓度和作用时间进行优化，之后大量诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表达的蛋白，Ni亲和层析柱纯化表达蛋白，并进行复性。结果表明，成功构建pET-32a-α表达载体，α毒素基因经0.5mmol/L IPTG诱导6h，表达较好。经SDS-PAGE鉴定，α毒素重组蛋白的条带大小在66.2kD附近（61kD）；Western blot表明重组蛋白的反应原性良好；蛋白电泳表明复性效果较好。（3）抗α毒素重组蛋白IgY抗体的制备。纯化复性后的α毒素蛋白免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，使用水稀释-硫酸铵二步沉淀法提取IgY抗体，SDS-PAGE分析在65kD和27kD附近出现重链和轻链的条带。ELISA监测免疫后抗α毒素蛋白IgY抗体效价动态变化，Western blot鉴定所获抗α毒素蛋白IgY的特异性。四免后，抗α毒素蛋白-IgYELISA滴度达到1:320000；Western blot表明，所制备IgY抗体可特异性结合α重组蛋白。本研究成功构建了C型产气荚膜梭菌α毒素蛋白原核表达载体，生产了抗α毒素蛋白特异性IgY抗体，可用于开发低成本的C型产气荚膜梭菌临床抗体药物，为临床疾病的预防治疗提供了一种新方法。
赵宇亮,张聪敏,王琳,霍萍萍,赵宝华[4]（2013）在《产气荚膜梭菌α毒素的研究进展》文中研究说明产气荚膜梭菌能引起人类食物中毒和出血性肠炎,严重时可导致死亡。α毒素是A型产气荚膜梭菌的主要致死性毒力因子和保护性抗原,从分子生物学角度对该毒素进行研究具有重要意义。对α毒素的分子生物学结构和致病机理进行了简要概述,并介绍了国内外对产气荚膜梭菌α毒素的检测方法和防治措施,以期为研究产气荚膜梭菌α毒素的致病机理以及预防和治疗动物气性坏疽、肠道出血症奠定基础。
刘晓敏[5]（2012）在《产气荚膜梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制及初步应用》文中认为产气荚膜梭菌（Cl. perfringens）是一种广泛分布于自然界中的条件性致病菌，其引起的家畜“猝死症”发病急，死亡快，发病率和死亡率高，给养殖业的发展带来了巨大的经济损失。α毒素是产气荚膜梭菌最重要的毒力因子，各型产气荚膜梭菌均可产生α毒素。目前，对家畜产气荚膜梭菌感染的诊断主要依赖于常规实验室诊断，但其操作过程复杂、耗时长，不适用于该疫病的防控。因此，建立一种针对α毒素快速准确的诊断方法，并能应用于现场的快速诊断是十分必要的。本实验首先采用分子生物学方法获得α毒素表达质粒；用该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），利用IPTG诱导表达，摸索最优表达条件；表达产物经SDS-PAGE电泳，获得大小为45KD的融合蛋白；在最佳条件下大量诱导表达目的蛋白，镍柱亲和纯化目的蛋白，Western blot检测表明目的蛋白具有良好的免疫学活性。用表达纯化后的α毒素蛋白作为抗原免疫家兔，四免后15d取血清获得多克隆抗体。经ELISA方法检测抗体效价可以达到1:512000，显示了良好的特异性。采用硫酸铵沉淀法和透析袋纯化抗体。胶体金免疫层析技术具有快速简便、准确直观等优点，具有良好的特异性和敏感性，是目前现场应用最广泛的一种诊断方法。本实验用抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体为探针制备了产气荚膜梭菌α毒素快速诊断金标试纸条。利用柠檬酸三钠还原法制备了粒径为40nm的胶体金，然后用其标记抗α毒素多克隆抗体喷涂金标垫，同时用纯化的α毒素多克隆抗体和羊抗兔IgG二抗包被M135硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线，与金标垫组装成试纸条。对试纸条的特异性、敏感性、稳定性和重复性进行检测。用制备的产气荚膜梭菌α毒素快速诊断金标试纸条对临床样品进行检测，并比较其与PCR检测结果的符合率。结果显示，成功制备了α毒素快速诊断金标试纸条，金标垫上最佳抗体包被量为1mg/mL；检测线上α毒素多克隆抗体最适印迹量约为600μg/mL；控制线上羊抗兔二抗的最佳包被浓度为1:20稀释；当α毒素质量浓度为2.80和1.40mg/mL时，检测线处有明显条带；当α毒素质量浓度为0.70mg/mL时检测线处条带较淡；当α毒素质量浓度为0.35mg/mL时，检测线处几乎没有条带，表明试纸条具有较好的敏感性和特异性；研制的试纸条仅与产气荚膜梭菌α毒素发生反应，且不同批次的试纸条重复检测结果无差异，表明试纸条具有较高的特异性和重复性；该试纸条最低可检测1.40mg/mL的毒素量，与PCR方法的符合率为80.00%，基本能满足要求，具有良好的应用前景。
卢田粉[6]（2012）在《产气荚膜梭菌α和ε毒素蛋白高效表达体系的构建及其免疫保护性的研究》文中研究指明产气荚膜梭菌又称魏氏梭菌（Clostridium perfringens）是引起各种动物肠毒血症，坏死性肠炎和人创伤性气性坏疽的主要病原菌之一。该菌分为A、B、C、D、E5型，其致病因子是菌体产生的外毒素。其中α和ε两种毒素由D型产气荚膜梭菌产生，导致动物致死性肠毒血症，从而造成巨大的经济损失。到目前为止，国内外学者对D型产气荚膜梭菌产生的α和ε毒素的研究还较为少见。因此我们开展了关于这方面的研究，在本研究中，构建能够高效表达α毒素的重组菌株和ε毒素的重组菌株；然后，分别制备包涵体粗提物，单个免疫以及共同免疫家兔，以此检测其免疫保护性，目的在于有效防控由α和ε毒素引起的牛、羊肠毒血症。首先D型产气荚膜梭菌菌株在厌氧条件下培养复活，提取DNA模板，设计特异性引物，并对其α和ε毒素的部分基因进行PCR扩增、克隆，以常规基因重组技术，将回收的目的基因片段插入到原核表达载体pET-28a中，得到重组质粒，经酶切、测序鉴定后，该重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达，摸索诱导最优条件，将最佳条件下的诱导产物进行SDS-PAGE电泳，并经镍柱亲和纯化目的蛋白，PBS透析，Western blot检测了蛋白的特异性；将纯化的α和ε毒素蛋白200ug分别混以免疫弗氏佐剂免疫家兔A组和B组，α和ε毒素蛋白各100ug混以免疫弗氏佐剂共同免疫家兔C组，定期取血清并用ELISA方法检测抗体滴度，得到α毒素、ε毒素、α和ε毒素三个抗体消长规律图谱。结果表明，PCR扩增出长度为780bp的产物，通过Blast比对，确认为α毒素基因；PCR扩增出长度为972bp的产物，通过Blast比对，确认为ε毒素基因，表达载体pET-28a和含有目的基因的重组T载体分别双酶切，并将酶切后的线性pET-28a回收产物和酶切后的目的片段回收产物进行连接，成功构建了pET28a-α重组菌株和pET28a-ε重组菌株。表达产物经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳，获得大小分别为28.9KD和36.9KD特异的表达条带，表达量可分别达到32.12%和32.83%，Western blot结果表明表达的目的蛋白具有高度的特异性。以表达的α毒素蛋白的包涵体粗提物和ε毒素蛋白的包涵体粗提物分别作为抗原，二次免疫家兔后，抗血清间接ELISA检测结果显示：经α毒素蛋白免疫的家兔在第4周抗体效价达到最高值为5.7log2；经ε毒素蛋白免疫的家兔在第4周抗体效价达到最高值8.7log2；经α和ε毒素蛋白共同免疫的家兔在第6周抗体效价达到最大值为4.7log2。本研究的结论：构建的两株重组菌株BL21（DE3）能分别高效表达α和ε毒素，而且该毒素具有较高的免疫保护性，单个的免疫家兔，效果比较好，共同免疫家兔也获得了一定的效价水平。该研究为进一步研制肠出血症的双价基因工程苗提供理论依据和支持。
王苗利[7]（2011）在《产气荚膜梭菌α毒素蛋白在感染小鼠器官分布的检测》文中进行了进一步梳理为了认识α毒素在感染产气荚膜梭菌动物体内的分布,深入探讨产气荚膜梭菌的肠源毒血症的致病机理,本实验自制了高效价的产气荚膜梭菌α毒素的多克隆抗体,并以此作为一抗采用免疫组织化学方法对人工感染产气荚膜梭菌病的小鼠体内的α毒素进行了定位,阐明了产气荚膜梭菌毒素的分布状况,揭示了家畜猝死症的致病机理。首先在厌氧条件下培养复活了A型产气荚膜梭菌标准菌株,提取DNA模板,设计特异性的引物,并对其α毒素的全长基因进行PCR扩增、克隆。以常规基因重组技术,将回收的目的基因片段插入原核表达载pET28a,得到重组质粒,经酶切、测序鉴定后,用该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,转化完成后,用IPTG诱导表达,摸索诱导最优条件后,将最佳条件下的诱导产物进行SDS-PAGE电泳,并经镍柱亲和纯化目的蛋白;PBS透析,Western blot检测了蛋白的特异性。将表达并纯化的α毒素蛋白500μg混以免疫弗氏佐剂免疫家兔四次,定期取血清并用ELISA方法检测抗体滴度,获得多克隆抗体。将产气荚膜梭菌接种产毒培养基,厌氧环境45C、4h培养,取培养液常规硫酸铵法提取外毒素,用灭菌生理盐水稀释,腹腔皮下注射小鼠,取72h内死亡小鼠的器官组织:心、肝、脾、肺、肾、胃,小肠、延脑,投入4%多聚甲醛中固,然后制作组织切片,用自制的兔抗α毒素多克隆抗体作为一抗,HRP（辣根过氧化物酶）和FITC（荧光素）分别标记的羊抗兔IgG,作为二抗。通过免疫组织化学法对患产气荚膜梭菌病的小鼠体内的α毒素进行了定位检测。结果表明,PCR扩增出长度为1228 bp的产物,通过Blast比对,确认为α毒素基因;对表达载体pet28a和含有目的基因的重组T载体分别进行双酶切,并将酶切后的线性pet28回收产物和酶切后的目的片段回收产物进行连接,成功构建了pet28a-α表达载体。经IPTG诱导、表达产物经SDS-PAGE电泳,获得大小为45KD特异的表达条带,表达量可达42.1%。Western blot结果证明表达的目的蛋白具有高度的特异性。以表达的α毒素蛋白为抗原,四次免疫家兔后,获得得多克隆抗体经ELISA测定,其效价为1 : 512,000。经免疫组织化学法对器官的毒素分布检测指出,在小鼠的延髓、肠、肾、肺、胃的组织细胞胞浆中发现了阳性颗粒,说明α毒素随血液循环系统进入并侵害了动物的延髓、肠、肾、肺、胃等组织。在脾、肝的血管内发现阳性颗粒,但在主质细胞中未发现毒素分布,说明毒素无法侵害脾肝的主质细胞。研究显示,本实验成功的制备了高效价的兔抗α毒素多克隆抗体,免疫组化结果提示,首次在延髓的细胞胞浆中发现了α毒素,延髓是生命中枢、呼吸、心血管中枢,毒素的侵害使其紊乱,加之毒素对消化系统呼吸系统及肾脏的毒害作用,导致动物死亡。
李晓静[8]（2009）在《产气荚膜梭菌α毒素重组干酪乳杆菌表达及其免疫学分析》文中认为产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及动物坏死性肠炎、肠毒血症的主要病原菌之一。其致病因子是菌体分泌的外毒素,根据产生外毒素的种类不同,可分为A、B、C、D和E5个血清型,其中α毒素（C.perfringens alpha toxin,CPA）是各型产气荚膜梭菌产生的共同毒力因子,也是A型菌产生的最主要毒素,其能破坏细胞膜的完整性,导致细胞裂解,从而具有细胞毒性、溶血性、致死性和皮肤坏死性等特性。疾病发生是肠道内细菌大量繁殖产生毒素,经消化道吸收发生的毒素中毒性疾病。针对本病肠道吸收毒素和细菌在肠道大量繁殖特点,设计以有效刺激肠道黏膜免疫系统,以阻断疾病因子入侵机体的第一道防线进行免疫预防对科学防治本病具有重要意义。本研究以干酪乳杆菌Lactobacillus casei ATCC 393（L.casei 393）作为递呈抗原的活菌载体,利用α毒素位点突变的基因片段（从核苷酸水平上将编码第68位组氨酸残基突变成甘氨酸残基,使其毒性丧失,仍保持完整抗原性）插入到乳酸杆菌载体,构建了表面表达和分泌表达产气荚膜梭菌α毒素的重组乳酸杆菌系统。以此作为口服制剂,通过乳酸杆菌表达和传递外源抗原和乳酸杆菌本身的肠道黏附性特性、耐胆汁酸盐、耐胰酶和对肠道的定植和益生作用,有效刺激机体肠道黏膜免疫系统,达到免疫防治产气荚膜梭菌毒素中毒的目的。以含有编码产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因的PEG-30b-α质粒为模板,根据表达载体融合表达位点及干酪乳杆菌密码子使用的偏爱性,应用oligo6.0软件设计一对引物,经PCR扩增出约924bp的目的基因,将该基因片段克隆到pMD18-T simple载体,并进行了酶切、PCR鉴定,重组质粒命名为pMD18-T-α。重组质粒经SphⅠ和XhoI双酶切,回收目的基因片段,分别与经同样双酶切的表达载体pPG-1和pPG-2连接,电转化感受态L.casei 393,筛选阳性克隆,并进行酶切、PCR和测序鉴定,重组质粒命名为pPG-1-α和pPG-2-α,重组干酪乳杆菌命名为pPG-1-α/L.casei393和pPG-2-α/L.casei393。将获得的两种重组干酪乳杆菌以1%乳糖为诱导剂进行目的蛋白的诱导表达。细胞表面表达型及分泌表达型重组干酪乳杆菌经诱导后的SDS-PAGE检测结果表明,有约34kD的融合蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot结果分析表明,表达的蛋白可被兔A型产气荚膜梭菌α毒素抗血清所识别,间接免疫荧光及Western blot实验结果表明,所表达的蛋白能够在干酪乳杆菌菌体表面检测到;分泌表达型重组干酪乳杆菌经诱导后,对诱导表达的菌体及培养上清液进行SDS-PAGE检测表明,有约34kD蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot结果分析所表达的蛋白具有与天然毒素蛋白一样的抗原特异性。为探讨产气荚膜梭菌α毒素蛋白的重组干酪乳杆菌系统作为活菌疫苗潜在的应用价值,本实验以BALB/c小鼠为试验动物,进行免疫学实验。免疫程序为:实验鼠口服接种109活菌量,每隔2w免疫一次,共免疫四次,每次连续免疫3d,一天免疫一次。同时,以口服空载体干酪乳杆菌及PBS为阴性对照。免疫后分别测定了小鼠粪便、阴道粘液、泪液样品中抗α毒素分泌型IgA及小鼠血清样本中抗α毒素的特异性IgG水平。ELISA检测结果表明,口服免疫重组干酪乳杆菌后在小鼠粪便、阴道粘液、泪液样品中均检测到了特异性sIgA。同时在小鼠血清中亦检测到了较高水平的血清抗体,说明构建的重组干酪乳杆菌表达系统可诱导局部免疫应答,又可刺激机体产生系统的体液免疫应答。此外,对第四次免疫十天的小鼠进行α毒素攻毒实验,以探讨重组干酪乳杆菌所产生的α毒素抗体对鼠的保护作用,鼠攻毒试验结果亦证实表达α毒素干酪乳杆菌系统免疫鼠后产生的α毒素抗体能够抑制A型产气荚膜梭菌分泌天然α毒素对鼠的攻击。收集免疫后鼠血清做α毒素中和实验,也证明了血清有中和α毒素的能力。分析了两种表达方式的重组干酪乳杆菌的免疫效果,结果表明分泌型的重组菌免疫性更好,为以活菌作为载体进行口服疫苗研制方面其抗原物质的最佳提呈方式提供了依据。本研究首次构建了重组产气荚膜梭菌α毒素蛋白的干酪乳杆菌细胞表面表达和分泌表达系统,表达产物免疫动物后产生的抗体,具有良好的免疫保护作用,实验结果充分说明所构建的重组干酪乳杆菌表达系统作为口服疫苗具有潜在的应用价值。
王海荣[9]（2006）在《山东省畜禽魏氏梭菌分子流行病学研究》文中进行了进一步梳理根据GenBank上发表的α毒素基因序列,参照公开发表物设计了一对引物,扩增出1条325bp的特异性扩增条带,建立了魏氏梭菌α毒素基因聚合酶链式反应的检测方法。用该方法对沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌和葡萄球菌扩增,结果表明:仅魏氏梭菌扩增出了特异性条带,最低能检测到模板浓度为100CFU/ml,说明该方法具有很高的特异性和敏感性,是魏氏梭菌的一种快速、简便的鉴定方法,具有很高的推广应用价值。利用此方法对攻毒老鼠、病兔组织提取的DNA进行α毒素基因检测,以肝脏的检出率最高,脾、肾、心、肺、肠次之。根据GeriBank上发表魏氏梭菌的α、β、ε、ι四种主要毒素基因的序列及公开发表物设计四对特异性引物,该引物对标准菌株可扩增出特异性条带,将扩增产物测序,结果完全和报道的序列一致,建立了检验魏氏梭菌血清型的多重聚合酶链反应（multi-PCR）方法。另外对标准大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、肠球菌在相同的反应体系中进行扩增,没有扩增出特异性产物,说明该方法具有较高的特异性。敏感性实验结果表明,该Multi-PCR最低能检测到5.0×105CFU/ml,由此可见,本文所建立的多重聚合酶链反应（multi-PCR）方法具有较高的特异性、敏感性,可以用于临床的检测。纯化上述α毒素PCR产物,用地高辛标记,制备出地高辛标记α毒素基因探针。该探针与五个血清型的魏氏梭菌均能发生特异性杂交,而与对沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌和葡萄球菌的核酸杂交均为阴性。对魏氏梭菌最低能检测到5×103个,利用此方法对攻毒老鼠、病兔组织提取的DNA进行检测,以肠、肝脏、脾、肾的检出率较高。从山东泰安、德州、临沂、青岛、蒙阴、济南等地畜舍粪便、发病动物肠内容物中分离到131株魏氏梭菌,通过多重聚合酶链反应（multi-PCR）对分离到的魏氏梭菌进行型别的鉴定,结果发现:分离到的魏氏梭菌均为A型。从山东省泰安、莱芜的狐狸舍、猪舍、兔舍空气中分离魏氏梭菌,从空气中分离到43株,通过多重聚合酶链反应对分离到的魏氏梭菌进行型别的鉴定,结果发现:分离到的魏氏梭菌均为A型。对山东省泰安等地的5起兔的腹泻疫情进行临床诊断,根据初步诊断结果进行了病原的分离培养,可疑菌经多重PCR鉴定为A型魏氏梭菌。根据疫情报爆发时出现的临床
许崇波[10]（2006）在《C型产气荚膜梭菌致病因子分子生物学研究进展》文中研究说明C型产气荚膜梭菌是引起仔猪肠毒血症的主要病原菌之一,其致病因子是菌体产生的α、β毒素.作者就α毒素的检测方法、基因克隆与表达调控、结构与功能以及β毒素的分子生物学研究进展进行了介绍.
二、抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体1A8的基因克隆及序列测定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体1A8的基因克隆及序列测定（论文提纲范文）
（1）产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶在三种宿主菌的表达及其抗菌活性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 产气荚膜梭菌与坏死性肠炎 |
| 1.1.1 产气荚膜梭菌概述 |
| 1.1.2 产气荚膜梭菌毒素与分型 |
| 1.2 鸡坏死性肠炎概述 |
| 1.2.1 鸡坏死性肠炎临床症状与病理特征 |
| 1.2.2 鸡坏死性肠炎危害 |
| 1.3 噬菌体与裂解酶 |
| 1.4 益生菌表达系统及口服载体 |
| 1.4.1 益生菌 |
| 1.4.2 乳酸菌及nisin表达系统 |
| 1.4.3 枯草芽孢杆菌表达 |
| 1.4.4 诺如病毒样颗粒 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和载体 |
| 2.1.2 工具酶和主要试剂 |
| 2.1.3 实验动物和实验菌株 |
| 2.1.4 实验卵囊和实验药物 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 培养基和溶液 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 乳酸菌重组菌的构建与表达 |
| 2.2.2 枯草芽孢杆菌重组菌的构建 |
| 2.2.3 重组益生菌抗菌效果动物实验 |
| 2.2.4 大肠杆菌重组菌的构建 |
| 2.2.5 目的蛋白表达 |
| 2.2.6 裂解酶表达蛋白抗菌动物实验 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 重组乳酸菌构建与表达 |
| 3.1.1 重组乳酸菌菌液PCR鉴定 |
| 3.1.2 重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.1.3 重组表达菌SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 3.1.4 重组表达菌Western Blot |
| 3.1.5 乳酸菌表达蛋白纯化结果 |
| 3.1.6 蛋白浓度测定 |
| 3.2 重组乳酸菌抑菌效果 |
| 3.2.1 乳酸菌表达的裂解酶抑菌效果 |
| 3.2.2 乳酸菌体外抑菌效果 |
| 3.3 重组枯草芽孢杆菌构建与表达 |
| 3.3.1 枯草芽孢杆菌重组菌鉴定 |
| 3.3.2 枯草芽孢杆菌表达 |
| 3.4 重组益生菌动物实验结果 |
| 3.4.1 存活率 |
| 3.4.2 平均增重和相对增重率 |
| 3.4.3 料肉比 |
| 3.4.4 病变计分 |
| 3.4.5 细菌计数 |
| 3.4.6 卵囊计数 |
| 3.5 重组大肠杆菌构建与表达 |
| 3.5.1 重组大肠杆菌鉴定 |
| 3.5.2 重组大肠杆菌表达 |
| 3.5.3 蛋白存在形式测试 |
| 3.5.4 蛋白纯化 |
| 3.5.5 Western Blot鉴定 |
| 3.5.6 蛋白浓度测定 |
| 3.5.7 裂解酶活性单位 |
| 3.5.8 裂解酶于消化液活性测试 |
| 3.6 重组蛋白灌服动物实验效果 |
| 3.6.1 存活率 |
| 3.6.2 平均增重与相对增重 |
| 3.6.3 料肉比 |
| 3.6.4 病变计分 |
| 3.6.5 细菌计数 |
| 4 全文讨论与总结 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 防治鸡坏死性肠炎的必要性 |
| 4.1.2 重组益生菌构建与抗菌效果 |
| 4.1.3 产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51的表达及抗菌效果 |
| 4.2 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读硕士学位期间论文发表情况和获奖情况 |
（2）表达产气荚膜梭菌α-β2-ε-β1毒素的重组干酪乳杆菌的安全性评价及免疫效果的分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 产气荚膜梭菌研究进展 |
| 1.1.1 产气荚膜梭菌的生物学特性 |
| 1.1.2 产气荚膜梭菌主要毒素的致病机制 |
| 1.1.3 产气荚膜梭菌病及临床症状 |
| 1.1.4 产气荚膜梭菌病的防制 |
| 1.1.5 产气荚膜梭菌主要毒素疫苗的研究进展 |
| 1.2 乳酸菌用作口服疫苗活菌传递载体的研究进展 |
| 1.2.1 乳酸杆菌的粘附性和定植能力 |
| 1.2.2 乳杆菌免疫原性和佐剂性 |
| 1.2.3 乳酸杆菌在体外的黏附作用 |
| 1.2.4 乳酸杆菌作为外源基因表达宿主菌的优势 |
| 1.2.5 乳酸杆菌与黏膜免疫 |
| 1.2.6 乳酸杆菌基因工程菌的应用 |
| 1.2.7 乳酸菌口服疫苗的展望 |
| 1.3 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 培养基配制 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.1.6 实验仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组干酪乳杆菌安全性评价 |
| 2.2.2 口服重组干酪乳杆菌后特异性抗体水平的测定 |
| 2.2.3 口服重组干酪乳杆菌后攻毒保护性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组干酪乳杆菌安全性分析结果 |
| 3.1.1 重组干酪乳杆菌生长动态分析结果 |
| 3.1.2 重组干酪乳杆菌在消化道环境中的生存性能分析结果 |
| 3.1.3 重组干酪乳杆菌在消化道内的定植能力分析结果 |
| 3.1.4 重组干酪乳杆菌对动物生产性能的影响 |
| 3.1.5 口服重组干酪乳杆菌后对血液理化指标的影响 |
| 3.1.6 口服重组干酪乳酸杆菌后对组织病理学的影响结果 |
| 3.1.7 口服重组干酪乳酸杆菌后对肠道微生物菌群的影响结果 |
| 3.1.8 重组干酪乳酸杆菌口服后释放到周围环境的检测结果 |
| 3.2 口服免疫重组干酪乳杆菌后特异性抗体水平检测结果 |
| 3.2.1 血清中特异性抗体IgG的检测结果 |
| 3.2.2 粪便中特异性抗体s Ig A的检测结果 |
| 3.2.3 鼻冲洗液中特异性抗体s Ig A的检测结果 |
| 3.3 口服干酪乳杆菌后的攻毒保护性试验结果 |
| 3.3.1 产气荚膜梭菌生长曲线测定结果 |
| 3.3.2 产气荚膜梭菌毒素致死剂量测定结果 |
| 3.3.3 攻毒保护性试验结果 |
| 3.3.4 攻毒后组织病理学观察结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 α-β2-ε-β1 毒素为免疫原的重组干酪乳杆菌作为口服疫苗的立足点 |
| 4.2 重组干酪乳杆菌作为口服疫苗的安全性评价 |
| 4.3 口服重组干酪乳杆菌免疫效果的评价 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（3）C型产气荚膜梭菌α毒素蛋白的表达及其特异性IgY抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 产气荚膜梭菌的生物学特点 |
| 1.1.1 产气荚膜梭菌菌体形态特征 |
| 1.1.2 产气荚膜梭菌菌体培养特征 |
| 1.1.3 产气荚膜梭菌菌体的生化特征及抵抗力 |
| 1.2 C 型产气荚膜梭菌的毒力因子 |
| 1.2.1 α毒素（CPA） |
| 1.2.2 β1 毒素（CPB1） |
| 1.2.3 β2 毒素（CPB2）和β2 毒素编码基因（cpb2） |
| 1.3 C 型产气荚膜梭菌的致病机理 |
| 1.3.1 α毒素（CPA）的致病机理 |
| 1.3.2 β1 毒素（CPB1）的致病机理和作用部位 |
| 1.4 IgY 技术在畜禽胃肠道疾病中的应用 |
| 1.4.1 IgY 用于防治幼畜细菌性和病毒性腹泻 |
| 1.4.2 IgY 用于防治禽细菌性和病毒性疾病 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 C 型产气荚膜梭菌α毒素蛋白原核表达和纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与载体 |
| 2.1.2 工具酶和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 所用溶液及培养基的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 C 型产气荚膜梭菌基因组的提取 |
| 2.2.2 引物设计与合成 |
| 2.2.3 α毒素基因的 PCR 扩增 |
| 2.2.4 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 重组 T-Vector pMD19-α的克隆 |
| 2.2.6 重组 T-Vector pMD19-α的鉴定 |
| 2.2.7 重组表达质粒 pET-32a-α的构建与鉴定 |
| 2.2.8 pET-32a-α的 BL 21（DE3）表达菌的构建 |
| 2.2.9 表达蛋白的 Western blot 分析 |
| 2.2.10 包涵体蛋白的纯化 |
| 2.2.11 包涵体蛋白的复性 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 C 型产气荚膜梭菌α毒素基因的 PCR 扩增 |
| 2.3.2 T-Vector pMD19-α的酶切鉴定 |
| 2.3.3 重组表达质粒 pET-32a-α的构建及鉴定 |
| 2.3.4 α毒素蛋白最佳诱导时间的确定 |
| 2.3.5 α毒素蛋白 IPTG 诱导浓度的确定 |
| 2.3.6 α毒素蛋白的 Western blot 分析 |
| 2.3.7 α毒素重组蛋白的纯化 |
| 2.3.8 α毒素重组蛋白的复性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 抗 C 型产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白特异性 IgY 抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试剂 |
| 3.1.2 溶液配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 免疫原制备及免疫 |
| 3.2.2 IgY 抗体提取和鉴定 |
| 3.2.3 间接 ELISA 检测 IgY 抗体效价 |
| 3.2.4 IgY 抗体的 Western blot 鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 IgY 抗体的 SDS-PAGE 电泳 |
| 3.3.2 抗体效价动态变化 |
| 3.3.3 Western blot 鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）产气荚膜梭菌α毒素的研究进展（论文提纲范文）
| 1 产气荚膜梭菌α毒素的分子生物学研究 |
| 2 α毒素的致病机理研究 |
| 3 α毒素的检测方法 |
| 4 α毒素的防控措施 |
（5）产气荚膜梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制及初步应用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 产气荚膜梭菌简介 |
| 1.2 我国产气荚膜梭菌病的流行及危害 |
| 1.3 产气荚膜梭菌主要致病因子α毒素的研究进展 |
| 1.3.1 α毒素的结构与功能 |
| 1.3.2 产气荚膜梭菌病检测方法的研究进展 |
| 1.4 免疫胶体金技术 |
| 1.4.1 胶体金技术简介 |
| 1.4.2 胶体金技术的基本原理 |
| 1.4.3 胶体金免疫层析方法 |
| 1.4.4 胶体金免疫技术的特点 |
| 1.5 研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要仪器材料来源 |
| 2.2 主要溶液配制方法 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 产气荚膜梭菌α毒素蛋白的表达、纯化及检测 |
| 2.3.1.1 α毒素全基因序列的测定 |
| 2.3.1.2 α毒素蛋白的诱导表达 |
| 2.3.1.3 α毒素蛋白的纯化 |
| 2.3.1.4 α毒素蛋白的 Western blot 检测 |
| 2.3.1.5 蛋白含量的测定 |
| 2.3.2 产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体的制备 |
| 2.3.2.1 实验动物及处理 |
| 2.3.2.2 免疫程序 |
| 2.3.2.3 抗体收获与纯化 |
| 2.3.2.4 抗体效价的检测 |
| 2.3.3 产气荚膜梭菌α毒素金标抗体的制备 |
| 2.3.3.1 胶体金制备前器皿的清洁和硅化 |
| 2.3.3.2 胶体金标记物的制备 |
| 2.3.3.3 胶体金标记最适 pH 的确定 |
| 2.3.3.4 胶体金标记最低蛋白稳定量的确定 |
| 2.3.3.5 胶体金标记抗体 |
| 2.3.4 产气荚膜梭菌α毒素金标试纸条的制备 |
| 2.3.4.1 金标垫处理液的选择 |
| 2.3.4.2 硝酸纤维膜的选择 |
| 2.3.4.3 检测线抗体包被浓度的确定 |
| 2.3.4.4 质控线二抗包被浓度的确定 |
| 2.3.4.5 封闭液的选择 |
| 2.3.4.6 喷膜 |
| 2.3.4.7 试纸条的组装 |
| 2.3.4.8 展开剂的选择 |
| 2.3.4.9 检测方法与结果判定 |
| 2.3.5 试纸条各项性能测试 |
| 2.3.5.1 特异性和敏感性 |
| 2.3.5.2 稳定性和重复性 |
| 2.3.6 临床样品检测 |
| 2.3.6.1 实验动物攻毒 |
| 2.3.6.2 胶体金试纸条检测样品 |
| 2.3.6.3 PCR 方法检测样品 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 α毒素全基因序列的测定 |
| 3.2 α毒素蛋白的诱导表达结果 |
| 3.3 α毒素蛋白的纯化结果 |
| 3.4 α毒素蛋白的 Western blot 分析结果 |
| 3.5 α毒素蛋白含量的测定 |
| 3.6 兔抗α毒素多克隆抗体的 ELISA 结果 |
| 3.7 玻璃器皿的清洁 |
| 3.8 胶体金标记最适 pH 的确定 |
| 3.9 胶体金标记最低蛋白稳定量的确定 |
| 3.10 产气荚膜梭菌α毒素金标试纸条的制备 |
| 3.10.1 金标垫处理液的选择 |
| 3.10.2 硝酸纤维膜的选择 |
| 3.10.3 检测线抗体包被浓度的确定 |
| 3.10.4 质控线二抗包被浓度的确定 |
| 3.10.5 封闭液的选择 |
| 3.10.6 展开剂的选择 |
| 3.11 试纸条各项性能测试 |
| 3.11.1 试纸条特异性和敏感性的检测 |
| 3.11.2 试纸条重复性和稳定性的检测 |
| 3.12 临床样品检测 |
| 3.12.1 试纸条检测样品结果 |
| 3.12.2 PCR 方法检测样品结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 α毒素蛋白的表达 |
| 4.2 α毒素多克隆抗体的制备 |
| 4.3 抗体的纯化 |
| 4.4 金标抗体的制备 |
| 4.4.1 玻璃器皿的清洁 |
| 4.4.2 胶体金标记物的制备 |
| 4.4.3 抗体的选择 |
| 4.4.4 胶体金标记最适 pH 的确定 |
| 4.4.5 胶体金标记最低蛋白稳定量的确定 |
| 4.5 产气荚膜梭菌α毒素金标试纸条的制备 |
| 4.5.1 免疫层析材料的选择 |
| 4.5.2 试纸条的组装及保存 |
| 4.6 试纸条各项性能测试 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文及奖励 |
（6）产气荚膜梭菌α和ε毒素蛋白高效表达体系的构建及其免疫保护性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 产气荚膜梭菌简介 |
| 1.2 产气荚膜梭菌病的流行及防控情况 |
| 1.3 α毒素的结构与功能 |
| 1.4 ε毒素的结构和功能 |
| 1.5 α和ε毒素的国内外研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 1.7 本研究技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要仪器试剂及来源 |
| 2.1.4 主要试剂的配置 |
| 2.1.4.1 EB 溶液的配制 |
| 2.1.4.2 电泳缓冲液（50×TAE） |
| 2.1.4.3 1.0%琼脂糖凝胶的配置 |
| 2.1.4.4 产毒素培养基——Gordon 汤 |
| 2.1.4.5 Gill 苏木素配制 |
| 2.1.4.6 1%伊红酒精溶液配制 |
| 2.1.4.7 0.3%过氧甲醇 |
| 2.1.4.8 0.05% Tween-20 |
| 2.1.4.9 0.01M 柠檬酸盐缓冲液（1000ml 配制） |
| 2.1.4.10 5%BSA（牛血清蛋白） |
| 2.1.4.11 不同浓度一抗、二抗 |
| 2.1.4.12 0.01MPBS(1000ml 配制) |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 产气荚膜梭菌α和ε毒素基因的表达 |
| 2.2.1.1 菌种复活及模板制备 |
| 2.2.1.2 α和ε毒素基因的克隆及核苷酸序列测定 |
| 2.2.1.3 α和ε毒素基因表达载体的构建 |
| 2.2.1.4 α和ε毒素蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.2.1.5 表达蛋白的 Western blot 检测 |
| 2.2.1.6 蛋白表达含量的测定及菌株毒性的测定 |
| 2.2.2 产气荚膜梭菌α和ε毒素蛋白免疫保护性的研究 |
| 2.2.2.1 包涵体粗提物的制备 |
| 2.2.2.2 实验动物及处理 |
| 2.2.2.3 免疫程序 |
| 2.2.2.4 ELISA 测定抗体消长规律 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 α和ε毒素保护性抗原基因的 PCR 扩增，克隆，序列分析 |
| 3.1.1 α毒素基因的 PCR 扩增、克隆、序列分析 |
| 3.1.2 ε毒素基因的 PCR 扩增、克隆、序列分析 |
| 3.2 α毒素和ε毒素基因表达载体的构建 |
| 3.3 α和ε毒素蛋白的高效诱导表达与纯化结果 |
| 3.3.1 α毒素蛋白的高效诱导表达与纯化结果 |
| 3.3.2 ε毒素蛋白的高效诱导表达与纯化结果 |
| 3.3.3 Western blot 结果 |
| 3.4 重组菌株毒性的测定结果 |
| 3.5 α毒素抗体效价ELISA测定结果 |
| 3.6 ε毒素抗体效价 ELISA 测定结果 |
| 3.7 α和ε毒素抗体效价 ELISA 测定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 产气荚膜梭菌病的流行情况和研制疫苗的必要性 |
| 4.2 α和ε毒素蛋白的高效表达 |
| 4.3 α和ε毒素蛋白免疫保护性的初步研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文及奖励 |
（7）产气荚膜梭菌α毒素蛋白在感染小鼠器官分布的检测（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 产气荚膜梭菌简介 |
| 1.2 产气荚膜梭菌主要致病因子α毒素的研究进展 |
| 1.2.1 α毒素的结构与功能 |
| 1.2.2 α毒素特异性抗体的研究进展 |
| 1.3 研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要仪器试剂及来源 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 产气荚膜梭菌α毒素基因的表达 |
| 2.2.1.1 菌种复活及模板制备 |
| 2.2.1.2 α毒素基因的克隆及核苷酸序列测定 |
| 2.2.1.3 α毒素基因表达载体的构建 |
| 2.2.1.4 α毒素蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.2.1.5 表达蛋白的western blot 检测 |
| 2.2.2 兔抗α毒素多克隆抗体的制备 |
| 2.2.2.1 实验动物及处理 |
| 2.2.2.2 免疫程序 |
| 2.2.2.3 抗体收获与纯化 |
| 2.2.4 A 型产气荚膜梭菌攻毒试验 |
| 2.2.5 组织切片的制备及病理组织学检查 |
| 2.2.6 α毒素蛋白的免疫组织化学检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 α 毒素全基因的 PCR 扩增、克隆、序列分析 |
| 3.2 α 毒素基因表达载体的构建 |
| 3.3 α 毒素蛋白的诱导表达与纯化结果 |
| 3.4 兔抗 α 毒素多克隆抗体 ELISA 结果 |
| 3.5 患病小鼠病理组织学检查结果 |
| 3.6 患病小鼠免疫组织化学检查结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 个人简介及硕士在读期间发表论文情况 |
| 硕士学位论文内容简介及自评 |
（8）产气荚膜梭菌α毒素重组干酪乳杆菌表达及其免疫学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 产气荚膜梭菌病原学及其毒素研究进展 |
| 1.1.1 产气荚膜梭菌的生物学特性 |
| 1.1.2 产气荚膜梭菌毒力因子的分类及其引起的相关疾病 |
| 1.1.3 产气荚膜梭菌a 毒素研究进展 |
| 1.2 乳酸杆菌用作口服疫苗传递载体的研究进展 |
| 1.2.1 乳杆菌作为机体免疫活载体疫苗的优点 |
| 1.2.2 乳酸杆菌作为机体免疫活载体疫苗的特征 |
| 1.2.3 重组乳酸杆菌作为活载体疫苗的研究进展 |
| 1.3 研究的目的和意义 |
| 2 材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒和菌种 |
| 2.1.2 抗体制剂 |
| 2.1.3 酶制剂 |
| 2.1.4 生化试剂及试剂盒 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.1.6 引物合成 |
| 2.1.7 主要实验仪器与设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 表达产气荚膜梭菌ɑ毒素重组乳酸杆菌的构建 |
| 2.2.2 重组干酪乳杆菌的诱导及表达蛋白的鉴定 |
| 2.2.3 口服重组干酪乳杆菌免疫学指标的测定 |
| 2.2.4 免疫鼠攻产气荚膜梭菌α毒素保护性试验 |
| 2.2.5 产气荚膜梭菌α毒素中和试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 目的基因的PCR 扩增结果 |
| 3.2 重组质粒 pMD18-T-α 的鉴定结果 |
| 3.3 重组表达载体的鉴定 |
| 3.3.1 表面表达重组载体pPG-1-α的鉴定结果 |
| 3.3.2 分泌表达重组载体pPG-2-α的鉴定结果 |
| 3.4 重组干酪乳杆菌的诱导及表达蛋白的鉴定 |
| 3.4.1 目的蛋白的诱导表达 |
| 3.4.2 目的蛋白分泌性表达的鉴定结果 |
| 3.5 重组菌干酪乳杆菌口服免疫小鼠特异性抗体检测结果 |
| 3.5.1 小鼠粪便中抗A 型产气荚膜梭菌α毒素的特异性sIgA 检测结果 |
| 3.5.2 小鼠血清中抗A 型产气荚膜梭菌α毒素的特异性IgG 检测结果 |
| 3.5.3 免疫小鼠泪液、阴道黏液中抗A 型产气荚膜梭菌α毒素特异性sIgA 测定结果 |
| 3.6 免疫鼠攻击产气荚膜梭菌 α 毒素保护性试验结果 |
| 3.6.1 天然α毒素对小鼠的毒性试验结果 |
| 3.6.2 最小致死量(MLD)测定结果 |
| 3.6.3 免疫小鼠攻击毒素试验结果 |
| 3.7 免疫小鼠血清对产气荚膜梭菌 α 毒素的中和效力试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 基于产气荚膜梭菌经粘膜感染而构建重组乳酸菌系统的考虑因素 |
| 4.2 重组产气荚膜梭菌 a 毒素的去毒性 |
| 4.3 口服重组干酪乳杆菌粘膜免疫应答和系统免疫应答效果效果分析 |
| 4.4 不同表达方式的目的抗原对机体免疫效果分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（9）山东省畜禽魏氏梭菌分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 魏氏梭菌简介 |
| 2 我国魏氏梭菌病的流行及危害 |
| 3 病原的分子流行病学研究的意义 |
| 4 魏氏梭菌毒力因子 |
| 5 α毒素的研究进展 |
| 第二章 魏氏梭菌 PCR 诊断方法的建立与应用 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 多重 PCR 检测魏氏梭菌的基因型方法的建立及应用 |
| 1. 方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第四章 地高平标记探针检测魏氏梭菌的研究与应用 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第五章 家畜粪便、肠内容物中魏氏梭菌的分离培养鉴定及基因型检测 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 结果与分析 |
| 第六章 动物舍空气中魏氏梭菌的分离及基因型鉴定 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 第七章 不同方法对牛舍气载魏氏梭菌型别的研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第八章 腹泻兔魏氏梭菌的分离鉴定及诊断研究 |
| 1. 发病情况 |
| 2. 实验室诊断 |
| 3. 结论与讨论 |
| 第九章 不同来源的魏氏梭菌的分离株药敏实验和致病性观察 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论与分析 |
| 第十章 不同来源的魏氏梭菌α毒素全基因序列分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第十一章 魏氏梭菌α毒素基因的表达性克隆的构建 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（10）C型产气荚膜梭菌致病因子分子生物学研究进展（论文提纲范文）
| 1 α毒素 |
| 1.1 α毒素的检测 |
| 1.2 α毒素的基因克隆与表达调控 |
| 1.3 α毒素的结构和功能 |
| 1.4 抗α毒素单链抗体的特性 |
| 2 β1毒素 |
| 3 β2毒素 |
| 4 结束语 |
四、抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体1A8的基因克隆及序列测定（论文参考文献）
- [1]产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶在三种宿主菌的表达及其抗菌活性[D]. 龙航宇. 华南农业大学, 2019
- [2]表达产气荚膜梭菌α-β2-ε-β1毒素的重组干酪乳杆菌的安全性评价及免疫效果的分析[D]. 郭志侯. 东北农业大学, 2016(02)
- [3]C型产气荚膜梭菌α毒素蛋白的表达及其特异性IgY抗体的制备[D]. 杨文静. 西北农林科技大学, 2014(02)
- [4]产气荚膜梭菌α毒素的研究进展[J]. 赵宇亮,张聪敏,王琳,霍萍萍,赵宝华. 安徽农业科学, 2013(12)
- [5]产气荚膜梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制及初步应用[D]. 刘晓敏. 山东农业大学, 2012(02)
- [6]产气荚膜梭菌α和ε毒素蛋白高效表达体系的构建及其免疫保护性的研究[D]. 卢田粉. 山东农业大学, 2012(02)
- [7]产气荚膜梭菌α毒素蛋白在感染小鼠器官分布的检测[D]. 王苗利. 山东农业大学, 2011(08)
- [8]产气荚膜梭菌α毒素重组干酪乳杆菌表达及其免疫学分析[D]. 李晓静. 东北农业大学, 2009(03)
- [9]山东省畜禽魏氏梭菌分子流行病学研究[D]. 王海荣. 山东农业大学, 2006(12)
- [10]C型产气荚膜梭菌致病因子分子生物学研究进展[J]. 许崇波. 大连大学学报, 2006(02)