一、过氧化氢导致线粒体DNA编码细胞色素C氧化酶基因突变与其编码蛋白结构与功能关系的研究(论文文献综述)
魏一鸣[1](2021)在《玉米籽粒发育调控基因ZmNPF7.9和ZmAPP1的克隆与功能分析》文中指出玉米(Zea mays L.)是世界三大重要的粮食作物之一,也是饲料和工业原料的重要来源。而玉米籽粒发育又是产量和品质形成的重要基础,对玉米籽粒发育突变体的研究可以为玉米遗传改良提供理论参考。本研究中,我们从EMS诱变的B73突变体库中筛选了两个玉米籽粒发育突变体nrt1/ptr family 7.9(npf7.9)和a p-loop GTPase protein 1(app1),并通过图位克隆鉴定到相应的基因,分别命名为Zm NPF7.9和Zm APP1。通过分子生物学、生物化学和遗传学的手段深入解析了这两个基因的功能,主要结果如下:1.Zm NPF7.9基因的克隆与功能分析npf7.9突变体籽粒变小、粒重显着下降。重要的是,突变体植株生长与野生型除了株高略微降低,其它性状无明显差异。遗传分析表明该突变表型为受单个核基因控制的隐性性状。图位克隆结果表明在npf7.9-ref突变体中基因Zm00001d019294发生了单核苷酸突变(G到A),导致TGC(Cys/C)到TAC(Tyr/Y)密码子转变。同时我们检测了该基因在等位突变体npf7.9-1中的突变情况,发现在基因第四个外显子存在一个G→A的单碱基替换导致翻译提前终止。等位杂交测试进一步证实了Zm NPF7.9的突变是导致表型产生的原因。该基因编码一个NRT1/PTR Family(NPF)家族的硝酸盐转运蛋白,故命名为Zm NPF7.9。ZmNPF7.9基因在玉米胚乳传递细胞层中特异表达,透射电镜观察发现npf7.9突变体胚乳传递细胞发育迟缓,授粉后6天的传递细胞仍没有壁内突的结构,从而影响了玉米籽粒中贮藏物质的积累。利用异源表达爪蟾卵母细胞系统,对注射Zm NPF7.9-c RNA的卵母细胞进行功能分析发现,Zm NPF7.9是一个低亲和力、p H依赖的双向硝酸盐转运体。同时利用玉米原生质体表达Zm NPF7.9-e GFP融合蛋白,发现该蛋白定位于细胞质膜。以上结果表明,Zm NPF7.9在胚乳传递细胞层发挥功能,负责从母体组织向发育中的胚乳运输营养物质。通过检测野生型和npf7.9突变体成熟籽粒中的硝酸盐和淀粉含量发现,npf7.9突变体中硝酸盐及淀粉含量显着降低,这可能是导致npf7.9突变体粒重下降的原因。我们利用转录组学和代谢组学的方法深入解析了npf7.9突变体和野生型在基因表达和代谢水平方面的差异。结果发现在npf7.9突变体中多数与糖酵解/糖异生、碳固定、碳代谢和氨基酸生物合成途径相关的关键基因均显着下调。同时在突变体中脂类和氨基酸等代谢物也显着下调。以上结果表明,Zm NPF7.9通过调节营养物质的运输和代谢,在玉米籽粒发育和粒重中发挥了特定的作用,这可能为玉米遗传改良提供有用的基因资源。2.ZmAPP1基因的克隆与功能分析与野生型相比,app1突变体表现为籽粒变小、种皮皱缩、粒重显着下降的表型。组织学切片实验结果表明,app1突变体胚乳传递细胞层和糊粉层细胞结构分化异常,主要表现为胚乳传递细胞层结构呈不规则的立方体细胞形状,糊粉层细胞排列紊乱。app1突变体中央淀粉胚乳细胞发育迟缓,干物质积累减少。我们还发现app1突变体胚胎发育迟缓,其胚胎尽管可以分化出成熟胚的结构,但不能正常萌发。通过体外胚挽救实验,突变体的胚可以长出幼苗,但幼苗生长缓慢最终死亡。遗传分析表明,app1突变体的表型是受单个核基因控制的隐性性状。对籽粒性状进一步深入分析发现,app1突变体醇溶蛋白及淀粉含量降低、可溶性糖含量升高、碳氮比升高。这些结果表明突变体胚乳细胞发育缺陷导致营养物质积累失衡,从而产生了小籽粒的表型。图位克隆结果表明,基因Zm00001d047046的第一个外显子上发生了一个G→A的转变,该突变导致氨基酸由天冬氨酸转变为天冬酰胺。同时我们利用CRISPR技术获得了Zm APP1敲除的转基因株系并进行等位测验,进一步证实了Zm APP1蛋白的功能缺失导致了籽粒发育缺陷的表型。Zm APP1是一个组成型表达的基因,但在早期的籽粒表达较高,这说明Zm APP1在籽粒的早期发育过程中起关键作用。通过进化树及蛋白序列特征分析发现,Zm APP1含有一个保守GTP结合结构域,属于P-loop GTPase家族的一个成员。体外酶活实验进一步证实了Zm APP1具有GTP水解酶活性。同时利用玉米原生质体表达Zm APP1-e GFP融合蛋白发现APP1编码一个线粒体定位的GTPase。ZmAPP1与枯草芽孢杆菌的YIq F和人类中核糖体组装因子MTG1同源。定量检测发现app1突变体中编码线粒体核糖体蛋白的基因转录本积累,这暗示Zm APP1可能参与了线粒体核糖体的组装。同时我们发现编码电子传递链复合体组分的线粒体基因在app1突变体中转录水平提高。通过进一步检测野生型和app1突变体中线粒体蛋白的表达水平,发现突变体中线粒体蛋白水平存在不同程度地变化。这说明Zm APP1蛋白的突变影响了线粒体内的蛋白稳态平衡。另外我们发现app1突变体中线粒体超级复合体I+III2的丰度及活性均降低,突变体线粒体结构明显受损,没有明显的嵴结构,线粒体内多空腔,导致胚乳中活性氧过量积累,从而促使胚乳细胞程序化死亡提前,这表明Zm APP1通过维持线粒体的结构和功能影响籽粒发育。
肖宝平[2](2021)在《二十碳五烯酸(EPA)的抗氧化及抗炎作用研究》文中研究表明活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)是机体代谢过程中主要由线粒体呼吸链产生的一系列含氧的单电子还原产物。ROS过度积累会引起氧化应激,导致线粒体功能障碍并抑制线粒体生物合成,最终可能引发多种疾病。二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)是人体必需的ω-3多不饱和脂肪酸,具有提高免疫力、抗肿瘤和降低心血管疾病等多种生理功能,但其抗氧化及抗炎等活性仍存在争议、机理也不明确。本文以培养细胞为模型测定EPA的抗氧化和抗炎活性,进一步分析EPA对线粒体的调节作用及线粒体微小RNA(micro RNA,miRNA)对氧化应激的影响。主要研究结果如下:(1)EPA提高Hep G2细胞抗氧化能力:EPA处理Hep G2细胞48 h后,细胞内ROS水平显着降低了约60%;细胞总抗氧化能力提高了约70%;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)等主要抗氧化酶的活性及基因表达水平均显着上升。(2)EPA提高Hep G2细胞线粒体功能并促进线粒体的生物合成:Hep G2细胞用EPA处理48 h后,线粒体内ROS水平显着降低了约70%;ADP/ATP比值提高了约30%;线粒体膜电位显着提高了约3.5倍,线粒体拷贝数、线粒体编码基因、转录因子、裂变融合因子的表达量均显着提高。(3)Hep G2细胞用EPA处理48 h后,mi R-708-5p的表达显着上升、let-7c-3p的表达显着下降。过表达mi R-708-5p或抑制let-7c-3p表达均可降低细胞ROS水平、提高细胞主要抗氧化酶活性,减轻细胞的氧化应激。(4)EPA具有抗炎活性,可降低脂多糖诱导的炎症RAW264.7细胞中炎症介质一氧化氮(Nitric Oxide,NO)的释放、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)的活性和基因表达水平,同时降低促炎因子白介素-6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的释放及基因表达量并提高抗炎因子白介素-10(Interleukin-10,IL-10)的释放及基因表达水平。因此,EPA可能通过调节线粒体功能,增强线粒体的生物合成并调控miRNA的表达来响应氧化应激和调节炎症。本研究可为EPA等ω-3不饱和脂肪酸相关产品的开发利用及其在提高机体免疫力、预防疾病等方面的应用提供理论依据。
王利民[3](2021)在《假禾谷镰孢三角状五肽重复蛋白FpPpr1与FpPpr5的功能研究》文中认为小麦茎基腐病是小麦上一种重要的土传真菌病害,由于缺少抗病品种等原因,近年来该病害已逐渐成为威胁世界和我国小麦安全生产的重大问题。假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum,Fp)是引起小麦茎基腐病的优势病原菌,但关于该病原菌的生长调控及致病机理的研究报道很少。三角状五肽重复蛋白(Pentatricopeptiderepeatprotein,Ppr)为一类核编码的RNA结合蛋白,不仅参与线粒体基因组转录和翻译,而且通过结合特定的RNA序列调控靶标基因RNA的翻译过程。尽管Ppr蛋白在植物、动物(包括人)及酵母中有一些研究报道,但在丝状真菌特别是植物病原真菌中几近空白。本文主要围绕假禾谷镰孢中Ppr蛋白的作用机制进行研究。通过全基因组分析在假禾谷镰孢中发现了 8个Ppr同源蛋白,生物信息学分析发现FpPpr1~FpPpr8均具有35个氨基酸组成的PPR基序。通过Ppr蛋白3D结构预测,其中FpPpr1、FpPpr3、FpPpr5、FpPpr6、FpPpr7形成明显的超螺旋结构。通过假禾谷镰孢转录组数据分析PPR基因在菌丝和侵染阶段的表达模式,发现FpPPR1、FpPPR3、FpPPR5在菌丝阶段高表达,FpPPR2、FpPPR4、FpPPR6、FpPPR7在侵染后期高表达,说明FpPprs在假禾谷镰孢中可能具有不同的生物学功能。通过Split-marker和PEG介导的原生质体转化方法分别对FpPPR1~FpPPR8进行基因敲除,最终获得FpPPR1和FpPPR5基因缺失突变体,分别命名为ΔFpppr1和ΔFpppr5。与假禾谷镰孢野生型WZ-8A和互补菌株cFpppr1相比,ΔFpppr1菌落生长减慢、气生菌丝生长明显下降,分生孢子产生明显减少,长度变短、分隔减少、萌发率降低。敏感性测定发现ΔFpppr1对SDS、刚果红(Congored,CR)敏感,对NaCl和KCl高渗透压环境表现敏感,但耐H2O2。通过接种大麦叶片、小麦胚芽鞘和盆栽实验结果显示,与野生型WZ-8A和互补菌株相比,ΔFpppr1的致病力显着下降,且DON毒素生物合成显着下降。利用线粒体染色试剂与FpPpr1-GFP信号共定位分析,确定FpPpr1主要定位于线粒体。通过Illumina Hiseq转录组测序和RIP-seq方法分析ΔFpppr1中基因表达的变化以及FpPpr1结合的靶标基因。转录组分析发现,与野生型WZ-8A相比,ΔFpppr1中有1367个基因显着下调,GO功能富集表明氧化还原酶活性相关的基因较多,其中多个氧还原反应细胞色素P450基因、PKS12(PKS聚酮合酶)基因簇多个基因、FpMAT1-1有性生殖位点基因和异核体不亲合基因表达水平显着下调。以上结果表明FpPPR1基因可能参与调控病原菌的氧化还原过程、营养生长和有性生殖过程。通过qRT-PCR对线粒体细胞色素氧化酶COX1、COX2、COX3基因和NADH脱氢酶中NADH1~NADH6基因的转录水平进行测定发现,与野生型WZ-8A相比,ΔFpppr1中线粒体细胞色素氧化酶COX1基因显着下调。利用Flag标记的FpPpr1互补菌株进行RIP-seq测序分析,结果显示线粒体细胞色素氧化酶COX1、COX2和COX3基因在Flag-FpPpr1的免疫沉淀物中富集,其中COX1富集量最高。利用RIP-qPCR定量检测方法对RIP-seq结果进行验证,结果显示,线粒体细胞色素氧化酶COX1、COX2和COX3基因的表达量较高,与测序结果一致。以上结果表明FpPpr1可参与调控线粒体细胞色素氧化酶COX1、COX2和COX3基因的转录。利用线粒体复合体Ⅳ活性检测试剂盒比较了野生型WZ-8A菌株和ΔFpppr1中细胞色素氧化酶的活性,结果显示ΔFpppr1中细胞色素氧化酶的活性存在缺陷。表明FpPPR1基因缺失影响线粒体细胞色素氧化酶核心亚基COX1的功能,从而导致线粒体呼吸链细胞色素氧化酶复合物功能缺陷。利用pull-down结合串联质谱分析(MS/MS)技术进行了 FpPpr1的互作蛋白鉴定,结果显示26个蛋白可能与FpPpr1存在互作,FpPpr1与有性生殖相关基因FpMat1-1-3共同含有3个蛋白为FPSE08624、FPSE06440、FPSE01640 编码。其中 FPSE06440 编码 F 型 H+转运 ATP 酶 d 亚基,参ATP合成,FPSE01640编码β-微管蛋白,可能参与病原菌生长发育过程。表明FpPpr1与FpMat1-1-3之间可能存在互作联系。对同属于三角状五肽重复蛋白的FpPpr5进行了功能研究,结果显示,与野生型WZ-8A相比,ΔFpppr5菌落生长减慢、气生菌丝形成存在明显缺陷、产孢量显着降低。ΔFpppr5对SDS、CR敏感,在1 MNaCl和1MKCl的高渗透压环境下可以产生大量气生菌丝、促进生长、恢复缺陷表型,但对H2O2不敏感。通过接种小麦胚芽鞘和盆栽实验结果发现,与野生型WZ-8A和互补突变体cFpppr5相比,ΔFpppr5致病力严重下降,且DON毒素生物合成显着下降。pull-down结果分析发现25个蛋白可能与FpPpr5存在互作,其中含有线粒体定位蛋白、谷胱甘肽s转移酶功能蛋白,预测上述蛋白与FpPpr5存在功能相关。以上结果表明FpPPR5基因可能参与调控假禾谷镰孢细胞壁形成和DON毒素生物合成过程,进而影响了突变体的致病力。综上所述,在假禾谷镰孢中FpPPR1和FpPPR5都对病原菌的营养生长、细胞壁的完整性、DON毒素生物合成过程和致病力等方面起到至关重要的作用。
曹舒婷[4](2020)在《AMPK-PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在氧化应激仔猪肠屏障修复中的作用及姜黄素的调控机制》文中进行了进一步梳理仔猪在断奶过程中肠道发生了显着的氧化应激,这是导致肠屏障损伤的重要原因,如何缓解断奶仔猪氧化应激已成为学术界和产业界共同关注的焦点。能量对肠上皮细胞更新和正常功能的发挥至关重要,而能量产生过程中伴随着线粒体的氧化呼吸链活性氧(ROS)的产生。线粒体作为细胞能量工厂,不仅是活性氧产生的主要场所,而且也是活性氧攻击的重要靶点。为了使细胞免受氧化损伤,细胞形成了 一种精细的自我保护机制,即在功能损伤的线粒体诱发细胞死亡之前选择性降解受损线粒体,被称为线粒体自噬。但是,迄今为止,国内外均未见关于线粒体自噬在氧化应激诱导的仔猪肠屏障损伤修复中的作用及其调控机制方面的研究报道。姜黄素是一种从姜科或天南星科植物根茎中提取的一种天然酚类色素,是一种天然的抗氧化剂。本论文旨在探索仔猪氧化应激中线粒体自噬的作用及姜黄素的调控机制,为仔猪肠屏障损伤修复的营养调控研究提供崭新的思路和方向,具有重要的理论意义和应用价值。1.断奶应激对仔猪肠屏障、氧化平衡、线粒体功能和线粒体自噬的影响本试验研究了断奶后1周内仔猪肠道氧化平衡状态、肠屏障功能、线粒体功能和线粒体自噬水平的变化。选取杜×长×大三元杂交仔猪,分别于断奶后0天、1天、3天、7天屠宰取样,每次6头。氧化平衡状态通过抗氧化酶活性、抗氧化相关基因表达和空肠中丙二醛(MDA)含量进行测定;利用Ussing Chamber和空肠中紧密连接蛋白的表达和分布评估肠道屏障功能;利用线粒体DNA(mtDNA)含量、线粒体氧化磷酸化复合物的活性来表征肠道线粒体功能。通过测定线粒体自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)、LC3-Ⅱ、PTEN诱导激酶1(PINK1)和Parkin的表达水平,来探究线粒体自噬是否参与调控断奶应激。结果表明:(1)与断奶前相比,断奶后3天和7天超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及GPX-1、GPX-4的表达水平显着降低(P<0.05),而空肠MDA含量显着提高,且断奶后3天Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的表达水平显着降低(P<0.05)。(2)断奶后3、7天,猪空肠上皮细胞跨膜电阻及紧密连接蛋白occludin、claudin-1和zonulaoccludens-1的表达显着降低,而异硫氰酸荧光素葡聚糖4kDa(FD4)通透性显着升高(P<0.05)。(3)断奶后3天和7天,肠道线粒体DNA含量和空肠线粒体复合体(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)活性显着下降(P<0.05)。(4)断奶后3天和7天,肠道线粒体中线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin的表达水平显着升高(P<0.05);断奶后1天、3天和7天空肠中,LC3-II与LC3-I含量的比值也显着增加(P<0.05)。(5)断奶后1天、3天和7天仔猪空肠粘膜中磷酸化AMP依赖的蛋白激酶/AMP依赖的蛋白激酶(pAMPK/AMPK)的表达显着增加(P<0.05)。结果提示,断奶会破坏肠道氧化平衡,损害肠屏障和线粒体功能,引发了线粒体自噬,激活了 AMPK信号通路。2.氧化应激对仔猪肠屏障、线粒体功能及线粒体自噬的影响本试验研究了氧化应激对仔猪肠屏障,线粒体功能和线粒体自噬水平的影响。选用12头35日龄健康杜×长×大断奶仔猪(平均体重为9.6 kg),随机分成两个组:对照组,氧化应激组。每组6个重复,每个重复1头仔猪。氧化应激组的猪注射10 mg/kgdiquat,对照组的仔猪注射等量的0.9%(w/v)NaCl溶液。结果表明:(1)氧化应激显着降低了仔猪平均日采食量和平均日增重(P<0.05),显着抑制了空肠中SOD和GSH-Px的活性(P<0.05),显着提高了空肠MDA含量(P<0.05)。(2)氧化应激显着降低了猪空肠上皮细胞跨膜电阻(TER)与紧密连接蛋白(Claudin-1、occludin、ZO-1)的表达(P<0.05),显着提高空肠FD4的通透性(P<0.05)。(3)氧化应激导致仔猪空肠线粒体形态发生明显的肿胀、空泡化、基质皱缩明显,线粒体嵴数减少或断裂;Diquat显着提高了肠道线粒体活性氧产量(P<0.05),显着降低了肠道线粒体膜电位(P<0.05),这说明了氧化应激导致线粒体功能障碍(P<0.05)。(4)氧化应激显着降低了线粒体生物发生和功能相关的基因,过氧化物酶体增殖物激活的受体-g共激活子-1α(PGC-1α)、哺乳动物沉默信息调节蛋白-1(SIRT-1)、核呼吸因子-1(NRF-1)、线粒体转录因子A(TFAM)、线粒体单链DNA结合蛋白(mtSSB)、线粒体聚合酶r(mtpolr)、葡萄糖激酶(glucokinase)、柠檬酸合酶(CS)、三磷酸腺苷合酶(ATPS)和细胞色素c氧化酶Ⅰ(CcOX Ⅰ)和Ⅴ在空肠中的表达(P<0.05)。(5)氧化应激显着提高了线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin在肠道线粒体中表达(P<0.05),并且显着提高了空肠粘膜中LC3-II与LC3-I含量的比值(P<0.05)。(6)氧化应激显着增加pAMPK/AMPK的表达(P<0.05)。结果提示,氧化应激破坏肠道屏障,引起线粒体功能障碍,并触发了线粒体自噬,激活了 AMPK信号通路。3.AMPK-PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在氧化应激肠上皮细胞修复中的作用本试验旨在研究H2O2诱导的体外氧化应激模型对肠上皮细胞氧化平衡、肠上皮屏障功能和线粒体能量代谢的影响,明确AMPK-PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在氧化应激诱导的仔猪肠屏障损伤修复中的作用。利用H2O2诱导的肠上皮IPEC-J2细胞氧化应激模型,研究H2O2诱导的氧化应激对肠上皮细胞氧化平衡、肠上皮屏障功能、线粒体能量代谢、线粒体自噬和AMPK信号通路的影响及AMPK抑制剂Compound C和线粒体自噬抑制剂Mdivi-1的干预作用。结果表明:(1)与对照组相比,600 μM的H2O2处理显着提高了 p-AMPK的表达水平(P<0.05)。600 μM和800μM的H2O2处理显着提高了 PINK1、Parkin表达水平和LC3Ⅱ/1比例(P<0.05),说明氧化应激激活了 AMPK信号通路和PINK1-Parkin介导的线粒体自噬。(2)与对照组相比,氧化应激显着降低了肠上皮细胞SOD、CAT活性(P<0.05),显着提高了 MDA含量(P<0.05),同时显着降低了抗氧化应激相关基因的表达(P<0.05)。与氧化应激组相比,添加Compound C和Mdivi-1加剧了氧化应激。(3)与对照组相比,氧化应激组显着提高了线粒体活性氧含量(P<0.05)。与氧化应激组相比,CompoundC和Mdivi-1处理提高了线粒体活性氧含量(P<0.05)。(4)与对照组相比,氧化应激显着降低了肠上皮细胞TER和紧密连接蛋白的表达(P<0.05),显着提高了 FD4通透性(P<0.05)。与氧化应激组相比,Compound C+ H2O2和Mdivi-1+H2O2处理显着降低了肠上皮细胞TER(P<0.05)。(5)与对照组相比,氧化应激显着降低了肠上皮细胞ATP产量、线粒体膜电位和线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活性(P<0.05)。而与氧化应激组相比,Compound C和Mdivi-1处理加剧了氧化应激诱导的线粒体功能的紊乱。且氧化应激组、Compound C+H2O2 组、Mdivi-1+H2O2 组、Compound C+Mdivi-1+H2O2组均能观察到明显的线粒体肿胀、呼吸嵴断裂及线粒体空泡化的现象。(6)与对照组相比,氧化应激组、Compound C+H2O2组、Mdivi-1+H2O2组、Compound C+Mdivi-1+H2O2组均能观察到细胞整体耗氧量的降低。与氧化应激组相比,Compound C+Mdivi-1+H2O2处理显着降低了细胞的最大呼吸耗氧量和备用呼吸能力(P<0.05)。(7)与对照组相比,H2O2处理显着提高了PINK1、Parkin、Beclin-1的表达量和LC3Ⅱ/Ⅰ表达量的比例(P<0.05)。与氧化应激组相比,Compound C和Mdivi-1处理显着抑制了氧化应激诱导的保护性线粒体自噬反应(P<0.05)。(8)与对照组相比,氧化应激组可以观察到损伤线粒体被双层膜自噬泡包裹的现象。与氧化应激组相比,Compound C+H2O2组中存在较少的线粒体自噬小体。而在Mdivi-1+H2O2组和Compound C+Mdivi-1+H2O2组中几乎未见线粒体自噬小体。(9)为了直接可视化IPEC-J2细胞内线粒体自噬的激活情况,本试验利用了 Ad-GFP-LC3和Ad-HBAD-Mito-dsred来实时监测IPEC-J2细胞中线粒体自噬体的形成。H2O2处理显着增加了 IPEC-J2细胞中两者的共定位,而 Compound C+H2O2 组、Mdivi-1+H2O2 和 Compound C+Mdivi-1+H2O2 组中共定位显着降低。结果提示:H2O2诱导的氧化应激模型会导致肠上皮屏障损伤、线粒体活性氧含量升高、线粒体空泡化和线粒体能量代谢紊乱;H2O2诱导的肠上皮细胞氧化应激会激活AMPK信号通路和PINK1-Parkin介导的线粒体自噬;抑制AMPK信号通路和线粒体自噬加剧了 H2O2诱导的氧化应激、肠屏障损伤和线粒体能量代谢紊乱,明确了 AMPK信号通路和PINK1-Parkin介导的线粒体自噬在氧化应激诱导的肠道损伤中发挥重要的调控作用。4.基于AMPK-PINK1/Parkin通路研究姜黄素缓解氧化应激诱导的肠屏障损伤的机制肠上皮是抵御有害抗原和病原体最关键的屏障。氧化应激与肠屏障功能的障碍密切相关。姜黄素因其抗氧化应激功能而受到广泛关注,然而,姜黄素能否缓解由氧化应激引起的肠道损伤和线粒体损伤尚不清楚。本试验旨在探讨姜黄素是否可以通过保护线粒体功能,提高线粒体自噬水平来缓解氧化应激诱导的仔猪肠屏障损伤,并基于AMPK-PINK1/Parkin通路阐明姜黄素缓解氧化应激诱导的肠屏障损伤的机制。本试验通过腹腔注射diquat建立仔猪氧化应激模型,发现在其日粮中添加姜黄素可以保护肠道屏障功能,改善氧化还原状态,减轻线粒体损伤,触发线粒体自噬并影响AMPK-TFEB信号通路。进一步利用体外氧化应激模型发现姜黄素能够以PINK1-Parkin-线粒体自噬依赖的方式,有效缓解H2O2诱导的IPEC-J2细胞的氧化应激。进一步研究其分子机制,本试验发现干扰Parkin破坏了姜黄素对IPEC-J2的抗氧化应激作用,抑制了姜黄素对H2O2诱导的IPEC-J2细胞的肠屏障和线粒体功能的保护作用。在转染GFP-ParkinΔUBL(编码E3泛素连接酶活性的突变型Parkin蛋白)的细胞中,姜黄素的保护作用被抑制,这表明姜黄素的保护作用需要Parkin的E3泛素连接酶活性。另一方面,本试验还发现干扰PRKAA1后,姜黄素对H2O2处理的IPEC-J2细胞的保护功能减弱。免疫荧光和荧光素酶实验表明,姜黄素显着增强了 H2O2处理的IPEC-J2细胞中TFEB的核转运和转录活性,但是该作用被Compound C所抑制,这表明姜黄素通过AMPK信号通路促进TFEB转录。综上所述,这些结果揭示了姜黄素通过激活AMPK诱导Parkin依赖的线粒体自噬核TFEB核易位,从而改善氧化应激,增强肠屏障功能和线粒体功能。综上所述,断奶会破坏肠道氧化平衡,导致肠道发生氧化应激,断奶和氧化应激均会导致肠道屏障功能的损伤以及线粒体功能紊乱,而且会激活肠道线粒体自噬和AMPK,说明线粒体自噬和AMPK可能参与了断奶应激和氧化应激后肠屏障损伤修复过程。而且在体外氧化应激模型中同时抑制AMPK信号通路和线粒体自噬加剧了 H2O2诱导的氧化应激、肠屏障损伤和线粒体能量代谢紊乱,明确了 AMPK信号通路和线粒体自噬在氧化应激诱导的肠道损伤中发挥重要的调控作用。阐明了姜黄素是通过AMPK-TFEB信号通路调控Parkin的E3泛素连接酶介导的线粒体自噬进而缓解了氧化应激诱导的肠屏障损伤和线粒体功能损伤。
李敏[5](2020)在《陆地棉转GhbZIP1基因CMS种质创新及其不育机理研究》文中研究说明棉花(Gossypium hirsutum L.)是世界上最主要的天然纤维作物之一,也是重要的油料作物。棉花的杂种优势十分显着,但目前棉花细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility,CMS)种质资源匮乏,利用的CMS系主要为哈克尼西棉细胞质。其细胞质供体为二倍体,细胞核供体为四倍体,因质核互作严重不协调,恢复系少,难以推广利用。为了解决远源杂交核置换回交所致的质核严重不协调问题,亟需选育质核同源CMS系。本研究基于陆地棉细胞核雄性不育两用系“洞A”的转录组测序结果,筛选到一个在不育株和可育株差异表达的基因GhbZIP1,并将其转入一个性状优良的陆地棉栽培种J4B中。在获得转基因雄性不育突变株后,将其与J4B进行饱和回交成功创制出了CMS系J4A。随后对J4A进行形态学和细胞学观察、线粒体基因组水平、全转录组水平和生化指标测定分析,得出以下主要结果:(1)形态学观察发现,与J4B相比,J4A花器官缩小、花柱突出、花药干瘪而不开裂,败育类型为无花粉型。(2)花粉败育特征观察发现,J4A的花药败育发生在减数分裂期,表现为在花药发育的整个过程中绒毡层细胞不发生降解,无四分体结构。亚细胞超微结构观察发现:J4A花药四分体时期绒毡层细胞的线粒体内嵴模糊。(3)线粒体重测序结果显示:3个CMS系(J4A-1、J4A-2和J4A-3)与其保持系J4B的线粒体基因组差异较小,同源性均高于99%;筛选到4个与CMS相关的ORFs(orf116b、orf186a-1、orf186a-2和orf305a)。(4)通过Illumina Hiseq 4000测序平台进行转录组测序,结果显示:在检测到的62,270个基因中,共筛选到4,461个差异表达基因(7.16%),其中2,940个基因上调表达,1,521个基因下调表达。生物信息学分析发现,489个差异表达基因富集在氧化还原反应条目;47个差异表达基因参与糖酵解代谢途径,且下调基因数大于上调基因数。(5)通过Illumina Hiseq 4000测序平台进行miRNA测序,共获得1,293个miRNA,其中已知miRNA 734个,新miRNA 559个;预测到1,009个靶基因和1,054个靶基因位点;筛选到26差异表达miRNA。根据miRNA与其靶基因负调控关系,将m RNA测序结果与miRNA测序结果进行关联分析,筛选到一对可能与小孢子减数分裂异常有关的靶基因对:ghi-MIR7484-10/MAPKK6。(6)花药发育3个时期(花粉母细胞时期、减数分裂期和单核期)主要生化指标检测。活性氧(Reactive oxygen species,ROS)代谢相关生化指标(SOD、Mn-SOD、POD、CAT、H2O2和MDA)测定结果显示,在减数分裂期和单核期,J4A的SOD、Mn-SOD、POD和CAT酶活均显着低于J4B,H2O2和MDA含量均显着高于J4B。推测由于减数分裂期抗氧化酶(SOD、Mn-SOD、POD和CAT)活性降低,活性氧清除能力降低,导致活性氧(H2O2和MDA)积累。糖代谢相关生化指标(蔗糖、淀粉、可溶性糖和果糖)测定发现,在花药发育的减数分裂期和单核期,J4A花药中的蔗糖含量均高于J4B;而淀粉、可溶性糖和果糖含量均低于J4B。推测由于蔗糖发生积累,使葡萄糖和果糖的生成减少,进而导致淀粉含量降低和可溶性糖含量下降。
武健[6](2019)在《黄单胞菌属病原菌对申嗪霉素及其吩嗪同系物耐药性机制研究》文中研究表明黄单胞菌属病原菌是一类危害严重的植物病原细菌,可以侵染超过400种植物,包括重要的经济作物和粮食作物如水稻、小麦、油菜、柑橘、香蕉、木薯等,每年造成严重的经济损失。申嗪霉素是一种吩嗪类具有广谱抗菌活性的微生物次生代谢产物,并具有促进植物生长的双重作用,目前在中国已经被用来防治多种植物病害。本实验室前期研究发现,抗氧化系统及其它代谢途径的分化是黄单胞菌属不同种病原菌对申嗪霉素表现不同敏感性的遗传基础。但是这些遗传分化对药敏性的调控作用仍不足以阐明不同黄单胞菌对申嗪霉素的敏感性调控机制。本研究以对申嗪霉素耐药性最高的野油菜黄单胞菌为研究材料,通过构建Tn5插入突变体库、筛选申嗪霉素敏感性变异突变体的方法,揭示了黄单胞菌属病原菌对申嗪霉素及吩嗪同系物的耐药性机制,主要研究结果如下。1.发现调控野油菜黄单胞菌对申嗪霉素耐药性的相关基因通过构建野油菜黄单胞菌Tn5插入突变体库并筛选其中对申嗪霉素耐药性显着降低的插入突变体,获得了 5株对申嗪霉素表现超敏感的插入突变体,对申嗪霉素的EC50(抑制50%病原菌生长时的药剂浓度)值降低超过30倍。通过TAIL PCR和质粒拯救法鉴定这些突变体转座子插入位点,发现细胞色素C合成系统(Cytochrome c maturation system,CCM system)和双精氨酸蛋白转运途径(Twin-arginine translocation pathway,TAT pathway)相关基因的缺陷会导致这种变化。另外还发现18株对申嗪霉素耐药性降低幅度较小的插入突变体,对申嗪霉素的EC50值降低2-3倍。这些耐药性变化较小的插入突变体的转座子插入位点大多位于甲苯耐受蛋白家族附近。2.细胞色素C合成系统与双精氨酸蛋白转运途径通过影响细胞色素bc1复合体功能调控野油菜黄单胞菌对申嗪霉素及其吩嗪同系物的耐药性通过对细胞色素C合成系统相关基因的敲除与回复实验,发现细胞色素C合成系统在调控申嗪霉素耐药性中的重要作用。细胞色素C合成系统同时还调控了野油菜黄单胞菌对其他与申嗪霉素具有类似结构的吩嗪类同系物的耐药性。随后通过c型细胞色素蛋白合成过程中重要的Dsb途径对申嗪霉素耐药性调控研究,发现细胞色素c蛋白的缺陷是导致细胞色素C合成系统调控申嗪霉素耐药性的关键蛋白。同时对双精氨酸蛋白转运途径缺失突变体的研究表明,细胞色素C合成系统和双精氨酸蛋白转运途径是可能通过需要这两个途径共同合成的细胞色素bc1复合体调控了野油菜黄单胞菌对申嗪霉素的耐药性。细胞色素C合成系统和双精氨酸蛋白转运途径的缺陷在野油菜黄单胞菌中均会导致其生长速率和游动性降低,对申嗪霉素耐药性降低与对吩嗪类同系物耐药性降低呈正相关,与非吩嗪类化合物杀细菌剂卡那霉素和克菌丹的敏感性无相关性。3.细胞色素bc1复合体通过影响细胞内NADH-/NAD+水平调控黄单胞菌属病原菌对申嗪霉素及其吩嗪同系物的耐药性通过构建细胞色素bc1缺失突变体,发现细胞色素bc1复合体在黄单胞菌属不同种病原菌中对申嗪霉素及其吩嗪同系物的耐药性具有重要调控作用。细胞色素bc1缺失突变体对申嗪霉素的药敏性均与细胞色素C合成系统和双精氨酸蛋白转运途径的缺失突变体一致,野生型菌株8004对申嗪霉素的EC50值>32mg/L,而细胞色素bc1缺失突变体对申嗪霉素的EC50值为0.299 mg/L,降低约100倍左右。随后对不同亚型细胞色素c蛋白的研究表明这种调控机制与黄单胞菌属病原菌通过抗氧化系统调控申嗪霉素耐药性的机制完全不同,另外黄单胞菌属病原菌中抗氧化系统缺陷对申嗪霉素的EC50值影响仅2-3倍,结果表明与抗氧化系统相比,细胞色素bc1复合体具有更加重要的调控作用。细胞色素C4蛋白一定程度上会影响黄单胞菌属病原菌对申嗪霉素的耐药性,但是影响程度小于细胞色素bc1复合体,对申嗪霉素的EC50值为2.93 mg/L。细胞色素c552蛋白缺失突变体表现对过氧化氢的抗性降低,但其对申嗪霉素的耐药性没有明显变化。细胞色素bc1复合体的电子e-供体琥珀酸脱氢酶对黄单胞菌属病原菌的生长具有重要意义,缺失后会引起严重的生长障碍,但是这种生长障碍并不会引起其对申嗪霉素的耐药性变化。而细胞色素bc1复合体的另一电子来源NADH则对申嗪霉素的敏感性密切相关。黄单胞菌属病原菌细胞色素bc1复合体缺陷会降低胞内NADH的降解速率,导致NADH积累,使细胞内NADH/NAD+水平显着提高。而胞内NADH的积累会促使申嗪霉素由氧化态向还原态转变,还原态的申嗪霉素进一步发挥抑菌作用。野生型菌株8004在32mg/L的申嗪霉素处理下,其受到的生长抑制并不明显,其细胞内NADH-/NAD+水平显着降低,而细胞色素bc1缺失突变体在0.24mg/L的申嗪霉素处理下,其生长状态受到显着明显,而胞内NADH/NAD+依然保持在较高水平。硫酸吩嗪甲酯以及2,6-二氯酚靛酚与NADH的亲和性较申嗪霉素更高,可以竞争性的持续消耗胞内的NADH并将电子传递给氧,降低胞内NADH/NAD+水平,进而降低申嗪霉素对黄单胞菌属病原菌细胞色素bc1复合体缺失突变株的抑制作用。研究表明,细胞色素bc1复合体抑制剂嘧菌酯、醚菌酯等杀真菌剂对植物病原细菌无抑制作用。但研究发现,真菌病害病原菌中细胞色素bc1复合体对申嗪霉素耐药性的调控机制与细菌的调控机制是一致的。通过细胞色素bc1复合体抑制剂处理,申嗪霉素对植物病原真菌镰孢菌的抑制效果显着提高,而对照药剂则无明显差异,结果表明细胞色素bc1复合体抑制剂与申嗪霉素具有协同增效作用,利用细胞色素bc1复合体抑制剂与吩嗪类化合物的联合使用来提高杀菌效果具有可应用性。综上所述,本研究通过构建并筛选野油菜黄单胞菌Tn5插入突变体库,发现细胞色素C合成系统和双精氨酸蛋白转运途径可以调控野油菜黄单胞菌对申嗪霉素的耐药性。进一步研究发现,细胞色素C合成系统和双精氨酸蛋白转运途径通过共同影响呼吸链细胞色素bc1复合体的功能而影响胞内NADH/NAD+水平,继而调控病原菌对申嗪霉素及其吩嗪同系物的耐药性。细胞色素bc1复合体抑制剂与申嗪霉素的增效作用值得进行进一步应用研究。
周国昌[7](2018)在《玉米雄性不育系K932S的遗传分析》文中提出玉米(Zea mays L.)是最早在生产上应用雄性不育(MS)的作物之一,利用雄性不育不仅能节省种子生产成本,而且也是提高种子质量的一条有效途径。育种家通过各种途径获得了大量的玉米雄性不育材料,但由于育性稳定性和细胞质弊病,以及败育机理仍不十分清楚,从而限制了其应用。因此,创制、鉴定和研究利用玉米新雄性不育材料,具有重要的理论和实践意义。玉米K932S是课题组利用自然突变获得的一份新雄性不育材料。本研究以姊妹交群体K932MS(由50%不育系K932S和50%可育系K932F构成)、K932S与正常自交系组配的正反交后代群体和回交群体、恢复系K932R为材料,通过遗传鉴定、细胞学观察、生理生化测定和转录组测序(RNA-seq)分析,结合生物信息学分析和qRT-PCR等技术验证,以期明确K932S的遗传方式、败育时期和特征,生理生化特性,以及关键代谢途径差异表达基因(DEGs)与K932S败育的关系,为后续研究应用提供理论依据。主要结果如下:(1)与K932F相比,K932S营养生长期无表型差异,但散粉期花药退化,无花粉。不同地点、不同年份和不同季节种植发现,K932MS姊妹交后代和K932F自交后代可育与不育株分离比例分别为1:1和3:1。以7个自交系为母本,与K932S×A9-2组配的反交后代育性恢复;K932S与30个自交系测交,发现测交后代育性完全恢复1个,不育21个,育性不稳定8个;随着核背景的变化,会改变回交后代的育性表现,说明K932S育性受到核质互作的影响。因此,K932S是一个无花粉型、稳定遗传的核质互作型雄性不育系,不育核基因为隐性单基因。(2)专效恢复分组鉴定和特异引物PCR鉴定发现,C型恢复系自凤1可恢复K932S的育性,K932MS特异性PCR扩增条带与CMS-CMo17条带一致。细胞学观察发现,K932S从二分体时期开始,花药绒毡层细胞径向膨大并液泡化,解体推迟,逐渐充满整个药室;二分体和四分体形态异常,单核早期小孢子体积进一步缩小,最终自溶解体消失。说明K932S属于二分体开始败育的C型细胞质雄性不育系,败育特征与现有典型C型不育系有所区别。(3)生理生化指标测定表明,与K932F相比,K932S花药中4个发育时期可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸等含量大多显着降低,过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显着降低,而过氧化物酶(POD)活性在造孢细胞时期和四分体时期显着升高。可见,K932S花药中营养物质严重不足,可能影响花药和小孢子正常发育;抗氧化系统关键酶活性变化,不利于有效维持细胞中活性氧含量的动态平衡。这可能是K932S败育的典型生理生化特征。(4)RNA-seq结果显示,共筛选出2962个DEGs。K932S与K932R相比,这些DEGs在花粉母细胞、二分体、四分体和单核小孢子早期,分别上调68、101、85和1145个,下调83、179、79和1222个。4个时期显着富集的GO条目分别有0、7、4和158条,主要包括花粉发育、DNA复制、水解酶活性和氨基化合物生物合成等。暗示二分体和单核小孢子早期是败育的关键时期。(5)KEGG Pathway富集分析,4个时期分别有48、104、56和1467个DEGs,分别富集在28、46、25和118条代谢途径。花粉母细胞时期主要包括淀粉与蔗糖代谢和脯氨酸代谢等;二分体时期包括DNA复制,角质、软木脂和腊质的合成等;四分体时期包括过氧化物酶体和黄酮类生物合成等;单核小孢子早期包括核糖体和氨基酸合成等。推测淀粉和蔗糖代谢,角质、软木脂和腊质合成,氨基酸合成等途径与败育相关。(6)选取氨基酸合成途径中5个相关DEGs,K932S与K932R花药发育4个时期qRT-PCR相对表达量变化规律与RNA-seq结果一致;4个时期K932S花药脯氨酸、酪氨酸和丙氨酸含量均显着低于K932R。验证了氨基酸合成途径与K932S败育密切相关。(7)关键代谢途径DEGs与K932S败育过程的关系,绒毡层发育相关基因上调表达,可能引起绒毡层细胞程序性死亡(PCD)异常,解体推迟;角质、软木脂和蜡质代谢相关基因下调表达,可能导致这些物质合成不足,引起花药退化;淀粉和蔗糖代谢、氨基酸合成代谢相关基因下调,可能导致能量和氨基酸等营养物质供应不足,使小孢子发育畸形,最终解体消失。研究结果为进一步揭示K932S的败育机理奠定了坚实基础。
陈宁[8](2018)在《诱导恢复性智能雄性不育体系的构建及应用》文中研究说明利用基因工程方法培育雄性不育系,尤其是雄性不育-保持兼用系,是更好地利用作物的杂交优势的新途径之一。当今利用该方法构建的兼用系,多数为雄性常态可育,通过改变外界环境或外源喷施诱导剂转变为不育。这些体系的主要缺点是调节雄性育性的时间窗口较窄,而且有时需要多次调节。为了补足这一短板,本研究在对前期克隆到的花丝特异性启动子AtDAD1进行解析的基础上,构建了以它为基础的新型诱导性雄性不育体系——诱导恢复性智能雄性不育体系,并且在拟南芥上得到验证。主要结果如下:用DADB(AtDAD1启动子的转化用全长片段)驱动GUS基因转化拟南芥,GUS基因在拟南芥中有极强的花丝特异性表达,在其他花器官和营养器官中则表达不明显。这种表达从花期12开始,一直保持直至授粉完成。对DADB进行了 5’和3’端的删除,发现决定花丝特异性的关键元件位于-1938 bp~-2947 bp 区段。以DADB驱动本实验室改良的Barnase基因——mBarnV作为“雄性不育”基因(DADB::mBarnV)导入拟南芥后,转基因植株的花丝变短,花药居于柱头下方,花粉量显着减少并且残存的花粉败育,从而导致雄性彻底不育,但雌蕊的育性不受影响。将此雄性不育基因与“恢复基因”PR2as::Barstar相偶联,导入拟南芥后,转基因植株T1代在自然状态下为雄性不育(表型同单转DADB::mBarnV的植株),但在外源施用水杨酸(SA)诱导后雄性育性得以恢复,从而能够自花授粉受精产生正常的角果和种子。这一性状能够稳定地传递到后代。外源喷施SA的时间窗口从花期10到花期12,长达2周,而且每三天喷施一次即可。与之平行,用花药绒毡层特异性启动子TA29驱动mBarnV基因,再串联改良的PR-1a启动子(8AnBx)驱动的Barstar基因,构成第2个诱导恢复性雄性不育表达载体。导入拟南芥后,转基因植株Ti代在自然条件下呈现出花药发育不良、不能产生正常的角果和种子的表型,但在绒毡层发育时期喷施SA后,花药的发育恢复正常,能够自花授粉受精产生正常的角果与种子。比较上述两种体系,前者(以DADB为基础)留给外源施用诱导剂的时间窗口比后者(以TA29为基础)更宽,因此也能够更方便、更经济地外源施用诱导剂。通过农杆菌介导转化法将以DADB为基础的诱导恢复性智能雄性不育系统移植到甘蓝型油菜(品种:West-4)中,获得少量转基因油菜植株。转基因油菜T1代植株在自然条件下,呈现出只有部分花朵的花丝变短、花粉数量减少且有部分败育,但是整株仍然能产生正常的角果和种子。这种雄性不育性不完全的原因还有待进一步的研究。本研究的结果不仅提供了两个诱导恢复性智能雄性不育体系,而且为构建其它新的诱导恢复育性雄性不育体系提供了新的思路和实践的参考。
林显[9](2016)在《H5N1禽流感病毒和H1N1/2009遗传兼容性与H5N1诱导氧化应激和线粒体动态紊乱的机制研究》文中研究指明流感病毒单股负链分节段的基因组结构特点赋予了重组是流感病毒不断进化、跨种传播和不断流行的重要方式。H5N1高致病性禽流感病毒一直被认为极有可能进化为潜在的大流行毒株,而2009年爆发的甲型H1N1流感病毒(H1N1/2009)及其在猪体内的稳定感染增加了人们对于H5N1可能会与H1N1/2009重组进而产生极具危害性的新型重组病毒的担忧。本研究采用H5N1与H1N1/2009小鼠体内共感染的方式研究这两种病毒重组后子代病毒的基因组成及其致病性,以期揭示它们重组的趋势和特点。氧化应激是体内氧化还原反应失去平衡并倾向于氧化,并由此产生大量的具有高度氧化活性的活性氧物质(ROS)。ROS可以对细胞的多种生物学过程进行调控,如炎性反应和凋亡。NADPH(NOX)氧化酶,是胞内ROS重要的来源之一,对于氧化应激的产生具有重要的作用;而存在于胞内的抗氧化系统能够通过其还原活性对抗或降低过量的氧化反应,如高表达于细胞质中发挥重要抗氧化能力的超氧化物歧化酶1(SOD1)。然而NADPH氧化酶在H5N1高致病性禽流感增殖及致病性的作用,及SOD1是否能通过其抗氧化活性对H5N1增殖和致病性产生影响尚不清楚。基于此我们着重研究了 NOX4和SOD1对H5N1增殖及其致病性的影响,试图揭示ROS在H5N1病毒感染中的意义。正常生理下线粒体处于融合与分裂的动态平衡中,而当胞内生理条件改变或病毒感染等,线粒体动态平衡受到破坏,或倾向于融合/延长,或分裂/片段化。线粒体动态平衡的紊乱不仅能够影响到细胞内能量的产生,对细胞凋亡和免疫反应都具有至关重要的调控作用。本研究以H5N1高致病性禽流感病毒为对象,初步揭示了其能破坏线粒体动态,增强线粒体融合的机制。本研究的主要内容如下:1 H5N1与H1N1/2009基因组兼容性的研究首先我们将H5N1(HM/06)与H1N1/2009(LN/09)共感染小鼠,48h后取小鼠肺脏运用空斑纯化的方法分离纯化出一系列病毒,并对其中624株子代病毒进行基因组测序。在对这624株病毒基因组分析后发现H5N1与H1N1/2009重组后能产生21种不同基因构型的重组病毒,其中H1N1来源的PB2与H5N1的其他七个基因的单基因重组病毒(L1)占到总分离病毒的53.5%,说明这种基因构型的重组病毒是甲型H1N1/2009与H5N1禽流感病毒最兼容的,具有最高的体内重组选择性和几率。而所有的重组病毒都包含有H5N1来源的HA基因,表明H5N1源的HA在病毒重组中的重要性;几乎所有的重组病毒都包含有H1N1/2009来源的PB2基因,间接反映出PB2蛋白对于宿主适应的重要性。2 H5N1与H1N1/2009重组子代病毒的增殖与致病性我们分析了所分离20种重组病毒在A549细胞中的增殖特点,结果表明大部分重组病毒均能很好地在A549细胞中增殖。小鼠攻毒实验发现不同基因构型的重组病毒对小鼠的致病性存在差异。PB2的基因重组病毒(L1)表现出最高的致病性,提示这种基因构型的重组病毒具有潜在的巨大危害。我们的实验说明H5N1和H1N1/2009具有很高的基因兼容性,而PB2的单基因重组病毒具有最高的重组优势和小鼠致病性,提示我们对于该种类型流感病毒监控的重要性。3 NOX4促进H5N1流感病毒的增殖通过实验发现H5N1感染A549细胞后能引起强烈的氧化应激,而NOX4在病毒感染后显着上调。数据表明NOX4的过表达能够促进H5N1诱导的ROS的产生,并能促进H5N1病毒的增殖。沉默NOX4后能够抑制H5N1的增殖,胞内ROS的产生及病毒诱导的炎性反应。4 SOD1过表达抑制H5N1流感病毒的增殖我们发现H5N1感染A549细胞后能显着抑制SOD1的表达。进一步的实验发现SOD1能够显着抑制H5N1流感病毒在A549及小鼠原代肺上皮细胞中的增殖、ROS的产生及病毒诱导的细胞凋亡和炎性因子的表达。5 H5N1感染破坏线粒体动态并增强线粒体融合我们发现H5N1感染A549细胞后能够造成线粒体严重损伤,增强线粒体的融合/延长。进一步的实验发现H5N1感染后能下调重要的线粒体分裂蛋白Drp1和MFF的表达,而Drp1和MFF的沉默能够显着促进H5N1诱导的细胞凋亡,推测H5N1可能通过促进线粒体融合的方式增强细胞的凋亡。6 Drp1和MFF对H5N1病毒复制的不同影响实验证明Drp1能够促进H5N1病毒的增殖,而MFF则能抑制H5N1病毒的增殖;沉默Drp1抑制H5N1增殖的能力可能与其增强的抗病毒免疫有关,而MFF抑制病毒的能力则可能与其正调控抗病毒免疫有关。
王彬[10](2015)在《玉米C型胞质不育的机理与穗发育相关miRNA的研究》文中认为玉米是杂种优势利用最为普遍的一类作物,利用雄性不育系是玉米杂种优势利用中简化制种程序、降低制种成本的一种重要手段。但由于玉米C型胞质雄性不育产生的分子机理极其复杂,其不育机制至今尚未明确。miRNA是小分子非编码RNA,参与调节基因的表达,在调控生长发育和逆境胁迫响应等方面发挥作用。穗发育是影响玉米产量的重要阶段,筛选其相关miRNA及其靶基因并进行功能分析,有助于在整体水平上穗发育的分子调控机制。本研究对玉米C型胞质雄性不育的机理与穗行数发育的miRNA调控机制进行了研究,主要结论有以下几个方面:1.以细胞质雄性不育系Cms-ES 87-1(rf4rf4rf5rf5)和保持系87-1(rf4rf4rf5rf5)以及相应的恢复系Cms-ES 87-1(Rf4Rf4rf5rf5)为材料,克隆了10个在不育系和保持系的胞质线粒体DNA存在差异的ORFs;对10个差异ORFs与pET28a构建原核表达载体并转化大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli),将含有pET28a及pET28a-orf的阳性克隆菌液分别通过0.4 mM的IPTG诱导,获得了4个具有明显的毒害作用的pET28a-orf菌株。对影响生长的4个orf分别构建pCAMBIA1300-35S-orf-GFP,利用农杆菌介导的方法对拟南芥进行了转化,发现orf 415的转基因阳性植株表现败育,通过拟南芥原生质体瞬时表达发现ORF415和GFP融合蛋白定位在细胞膜及细胞质上。跨膜结构预测发现ORF415可能编码一个包含4个跨膜区域的膜蛋白。利用Western杂交发现候选基因的多克隆抗体分别在不育系及恢复系材料的减数分裂前期、四分体时期及单核期蛋白样品中检测到一条大小介于40 kDa和55 kDa之间的特异杂交条带,而在保持系花药减数分裂过程中却无此杂交条带出现,从而证明ORF415可能是玉米C型胞质雄性不育的线粒体候选基因。2.借助于Illumina/Solexa技术对不育系Cms-ES 87-1(rf4rf4rf5rf5)和恢复系Cms-ES87-1(Rf4Rf4rf5rf5)进行了转录组测序,分别获得27,618,604(A4,不育系)和25,828,640(R4,恢复系)次读数;发掘出新基因1,096个,使用BLAST软件将发掘的新基因与NR、Swiss-Prot、GO、COG和KEGG数据库进行序列比对,有1,006个新基因获得注释信息;使用EBSeq对基因在不同样品中的表达量进行差异表达分析,并对其进行功能注释和富集分析,共获得了2369个差异表达基因(DEGs)。其中,1550个DEGs表达量A4高于R4,819个DEGs表达量R4高于A4,在差异表达基因中,仅在R4中表达的有172个,仅在A4中表达的有203个;GO分析中生物学过程、构成细胞的组分和分子功能分别有1793个、1871个和1668个。其中,在生物学过程中涉及细胞过程的DEG数量最多。在分子功能中参与了结合活性和催化活性的DGEs较多。差异基因参与到细胞和结合活性、催化活性占据多数;在注释的2,352差异基因中,有826个差异基因具有COG分类,并分为25类。归类到一般性预测功能、转录功能、信号转导差异基因较多,而核酸结构类、细胞运动性和细胞外基质结构类没有差异基因。差异表达基因的通路富集分析发现苯丙氨酸代谢途径富集显着性最可靠。苯丙氨酸代谢途径关键酶之一的查尔酮合成酶,调控植物育性等生理生化过程,可能在雄性不育的恢复机制中发挥着重要作用。3.利用新一代测序技术对穗行数存在显着的差异的玉米自交系综3和一个单片段代换系SSSL-10进行了测序。在两个系中,确定了28个miRNA属于11个保守的miRNA家族,它们的表达差异在2倍以上。而且在这些miRNA中属于4个miRNA家族中的14个成员是上调表达,7个miRNA家族中的14个在SSSL-10中是下调表达,并利用全基因组的降解组测序确定了miRNA的靶基因。此外预测了8个家族的29个新miRNA,其中只有一个的表达差异在2倍以上。结合前人研究结果,根据筛选出的表达差异在2倍以上miRNA及其靶基因的工作,构建了玉米穗行数形成过程的miRNA调控网络。
二、过氧化氢导致线粒体DNA编码细胞色素C氧化酶基因突变与其编码蛋白结构与功能关系的研究(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、过氧化氢导致线粒体DNA编码细胞色素C氧化酶基因突变与其编码蛋白结构与功能关系的研究(论文提纲范文)
(1)玉米籽粒发育调控基因ZmNPF7.9和ZmAPP1的克隆与功能分析(论文提纲范文)
符号说明 |
中文摘要 |
Abstract |
1 前言 |
1.1 玉米籽粒发育概述 |
1.1.1 玉米籽粒的结构 |
1.1.2 玉米胚乳的发育 |
1.1.2.1 玉米胚乳的发育过程 |
1.1.2.2 玉米胚乳基底转移细胞的发育 |
1.1.3 玉米胚的发育 |
1.1.4 玉米籽粒发育调控 |
1.1.4.1 线粒体参与调控玉米籽粒的发育 |
1.1.4.2 核糖体生物合成相关基因调控玉米籽粒发育 |
1.1.4.3 醇溶蛋白相关基因调控玉米胚乳发育 |
1.1.4.4 物质转运相关基因调控玉米籽粒发育 |
1.2 硝酸盐转运蛋白家族研究进展 |
1.2.1 高等植物中硝酸盐转运蛋白和离子通道分类及生理特性 |
1.2.1.1 氮源的重要性 |
1.2.1.2 硝酸盐转运体的底物亲和力 |
1.2.1.3 硝酸盐转运体的分类 |
1.2.2 NRT1/PTR家族(NPF)蛋白的底物特异性 |
1.2.2.1 硝酸盐和多肽类转运 |
1.2.2.2 氯离子转运 |
1.2.2.3 钾离子转运 |
1.2.2.4 激素类转运 |
1.2.2.5 硫代葡萄糖苷和其他代谢物转运 |
1.2.3 硝酸盐转运蛋白的功能 |
1.2.3.1 硝酸盐感知/吸收与根系的发育 |
1.2.3.2 根-茎运输和硝酸盐分配 |
1.2.3.3 种子发育与氮素贮藏 |
1.3 GTPase蛋白家族研究进展 |
1.3.1 线粒体的结构和功能 |
1.3.2 线粒体的氧化磷酸化复合体 |
1.3.3 线粒体核糖体的结构 |
1.3.4 线粒体核糖体的组装 |
1.3.5 线粒体核糖体蛋白功能研究进展 |
1.3.6 P-Loop GTPase的结构和分类 |
1.3.7 GTPase的功能 |
1.4 目的和意义 |
2 材料与方法 |
2.1 材料 |
2.1.1 植物材料 |
2.1.2 菌株和载体 |
2.1.3 主要试剂 |
2.1.4 主要的仪器设备 |
2.1.5 引物合成与DNA测序 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 玉米基因组DNA的提取 |
2.2.2 Trizol法提取植物总RNA |
2.2.3 RNA的反转录 |
2.2.4 实时荧光定量PCR |
2.2.4.1 定量引物的设计 |
2.2.4.2 荧光定量PCR的反应体系及反应条件 |
2.2.5 种子活力检测 |
2.2.5.1 TTC染色 |
2.2.5.2 胚挽救实验 |
2.2.6 玉米籽粒储存蛋白检测 |
2.2.6.1 玉米籽粒总蛋白、醇溶蛋白、非醇溶蛋白的抽提 |
2.2.6.2 玉米籽粒总蛋白、醇溶蛋白、非醇溶蛋白的SDS-PAGE电泳检测 |
2.2.6.3 玉米籽粒总蛋白、醇溶蛋白、非醇溶蛋白的定量检测 |
2.2.7 玉米籽粒淀粉含量检测 |
2.2.8 玉米籽粒可溶性糖含量检测 |
2.2.9 玉米籽粒组织学切片与细胞学观察 |
2.2.9.1 材料的固定与包埋 |
2.2.9.2 石蜡切片 |
2.2.9.3 切片的脱蜡与染色观察 |
2.2.10 透射电镜样品制作 |
2.2.11 表达载体的构建 |
2.2.11.1 引物设计 |
2.2.11.2 PCR扩增目的片段 |
2.2.11.3 PCR产物回收纯化 |
2.2.11.4 酶切、连接反应 |
2.2.11.5 连接产物转化 |
2.2.11.6 PCR鉴定与测序验证 |
2.2.11.7 质粒提取 |
2.2.12 农杆菌介导的玉米遗传转化 |
2.2.12.1 CRISPR/Cas9表达载体构建 |
2.2.12.2 农杆菌EHA105感受态细胞转化 |
2.2.12.3 玉米遗传转化 |
2.2.13 线粒体复合物提取 |
2.2.14 线粒体复合物丰度分析 |
2.2.15 线粒体复合物I活性分析 |
2.2.16 ROS水平检测 |
2.2.16.1 DAB染色 |
2.2.16.2 NBT染色 |
2.2.16.3 H_2O_2含量测定 |
2.2.17 Western blot |
2.2.18 亚细胞定位 |
2.2.18.1 定位表达载体构建 |
2.2.18.2 表达载体质粒大量提取 |
2.2.18.3 玉米原生质体的提取与转化 |
2.2.19 ZmAPP1蛋白的原核表达与纯化 |
2.2.19.1 所需溶液配方 |
2.2.19.2 原核蛋白表达 |
2.2.19.3 His蛋白的纯化 |
2.2.20 ZmAPP1蛋白GTP水解活性测定 |
2.2.21 玉米胚乳线粒体分离 |
2.2.22 玉米胚乳核糖体分离与检测 |
2.2.23 原位杂交 |
2.2.23.1 材料的固定与包埋 |
2.2.23.2 切片 |
2.2.23.3 原位探针合成 |
2.2.23.4 原位探针半定量 |
2.2.23.5 原位杂交 |
2.2.24 硝酸盐含量测定 |
2.2.25 异源表达爪蟾卵母细胞实验 |
2.2.25.1 电生理实验 |
2.2.25.2 爪蟾卵母细胞对~(15)NO_3~-的吸收实验 |
2.2.25.3 爪蟾卵母细胞~(15)NO_3~-的动力学吸收实验 |
2.2.25.4 硝酸盐外排实验 |
2.2.26 转录组测序和数据分析 |
2.2.27 代谢组检测和数据分析 |
3 结果与分析 |
3.1 籽粒发育基因ZmNPF7.9的克隆与功能解析 |
3.1.1 npf7.9突变体鉴定及表型分析 |
3.1.1.1 npf7.9突变体果穗及籽粒表型分析 |
3.1.1.2 npf7.9突变体组织学切片分析及细胞形态学观察 |
3.1.1.3 npf7.9突变体植株表型分析 |
3.1.1.4 npf7.9突变体遗传分析 |
3.1.2 ZmNPF7.9基因克隆 |
3.1.2.1 粗定位 |
3.1.2.2 精细定位 |
3.1.2.3 等位测试 |
3.1.3 ZmNPF7.9蛋白定位 |
3.1.4 ZmNPF7.9基因表达模式分析 |
3.1.5 npf7.9胚乳基底传递细胞观察 |
3.1.6 电生理实验 |
3.1.7 ~(15)N-硝酸盐吸收实验 |
3.1.8 ~(15)N-硝酸盐外排实验 |
3.1.9 淀粉及硝酸盐含量检测 |
3.1.10 RNA-seq数据分析 |
3.1.11 代谢组数据分析 |
3.2 籽粒发育基因ZmAPP1的克隆与功能解析 |
3.2.1 app1突变体鉴定及表型分析 |
3.2.1.1 app1突变体果穗及籽粒表型分析 |
3.2.1.2 app1突变体遗传分析 |
3.2.1.3 app1突变体组织学切片分析及细胞形态学观察 |
3.2.1.4 app1突变体籽粒萌发及胚挽救实验 |
3.2.2 app1突变体生化成分检测 |
3.2.2.1 app1突变体醇溶蛋白检测 |
3.2.2.2 app1淀粉含量及可溶性糖检测 |
3.2.3 ZmAPP1基因的克隆和等位测试 |
3.2.3.1 ZmAPP1粗定位 |
3.2.3.3 ZmAPP1精细定位 |
3.2.3.4 ZmAPP1CRISPR/Cas9转基因株系鉴定和等位测试 |
3.2.4 ZmAPP1蛋白结构、亚细胞定位及表达模式分析 |
3.2.4.1 ZmAPP1基因表达模式分析 |
3.2.4.2 ZmAPP1蛋白结构分析 |
3.2.4.3 ZmAPP1蛋白亚细胞定位 |
3.2.5 ZmAPP具有GTP酶水解活性 |
3.2.5.1 ZmAPP1蛋白原核表达 |
3.2.5.2 ZmAPP1酶活动力学曲线检测 |
3.2.6 ZmAPP1可能参与线粒体复合体的组装 |
3.2.7 ZmAPP1蛋白影响线粒体功能和超微结构 |
3.2.7.1 线粒体基因表达量分析 |
3.2.7.2 线粒体蛋白表达分析 |
3.2.7.3 线粒体复合体的丰度及活性检测 |
3.2.7.4 app1突变体交替氧化酶基因表达量分析 |
3.2.7.5 线粒体超微结构观察 |
3.2.8 app1突变体细胞程序化死亡提前 |
3.2.8.1 app1胚乳中ROS过量积累 |
3.2.8.2 app1籽粒的珠心、糊粉层细胞出现严重的DNA损伤 |
3.2.9 RNA-seq数据分析 |
4 讨论 |
4.1 胚乳传递细胞层特异表达基因ZmNPF7.9在玉米籽粒发育过程发挥关键作用 |
4.2 ZmNPF7.9可能存在其他潜在的转运底物 |
4.3 ZmNPF7.9具有潜在的应用价值 |
4.4 ZmAPP1参与线粒体核糖体的组装 |
4.5 ZmAPP1影响线粒体功能 |
4.6 ZmAPP1蛋白调控玉米籽粒发育 |
5 结论 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
攻读学位期间发表论文情况 |
(2)二十碳五烯酸(EPA)的抗氧化及抗炎作用研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
主要符号表 |
第1章 引言 |
1.1 EPA与氧化应激 |
1.2 氧化应激与炎症的协同反应及EPA的调节作用 |
1.3 EPA与线粒体的调控 |
1.4 EPA对 micro RNA的调控 |
1.5 研究内容及意义 |
第2章 EPA提高Hep G2 细胞的抗氧化能力 |
2.1 材料 |
2.1.1 细胞株 |
2.1.2 实验试剂 |
2.1.3 实验仪器 |
2.2 方法 |
2.2.1 细胞培养 |
2.2.2 细胞蛋白样品制备 |
2.2.3 细胞增殖率检测:MTT法 |
2.2.4 细胞ROS水平检测 |
2.2.5 总抗氧化能力检测 |
2.2.6 抗氧化酶活性检测 |
2.2.7 抗氧化酶基因表达量检测 |
2.2.8 统计学分析 |
2.3 结果 |
2.3.1 EPA对 Hep G2 细胞增殖率的影响 |
2.3.2 EPA降低细胞内ROS水平 |
2.3.3 EPA提高细胞总抗氧化能力 |
2.3.4 EPA提高细胞抗氧化酶活性 |
2.3.5 EPA提高抗氧化酶基因表达 |
2.4 讨论 |
第3章 EPA对线粒体功能和生物合成的调节 |
3.1 材料 |
3.1.1 细胞株 |
3.1.2 实验试剂 |
3.1.3 实验仪器 |
3.2 方法 |
3.2.1 细胞培养 |
3.2.2 线粒体ROS水平测定 |
3.2.3 细胞氧化磷酸化水平测定 |
3.2.4 线粒体膜电位(MMP)检测(JC-1 法) |
3.2.5 线粒体生物合成的测定 |
3.2.6 统计学分析 |
3.3 结果 |
3.3.1 EPA降低线粒体ROS水平 |
3.3.2 EPA促进线粒体氧化磷酸化水平 |
3.3.3 EPA提高细胞线粒体膜电位 |
3.3.4 EPA调节线粒体的生物合成 |
3.4 讨论 |
第4章 受EPA调节的micro RNA的抗氧化作用 |
4.1 材料 |
4.1.1 细胞株 |
4.1.2 实验试剂 |
4.1.3 实验仪器 |
4.2 方法 |
4.2.1 miRNA表达量测定 |
4.2.2 miRNA瞬时转染 |
4.2.3 受EPA调节的miRNA对细胞抗氧化能力的影响 |
4.2.4 miRNA靶基因预测 |
4.2.5 miRNA靶基因表达量测定 |
4.2.6 统计学分析 |
4.3 结果 |
4.3.1 受EPA调节的miRNA的表达验证 |
4.3.2 受EPA调节的miRNA对细胞抗氧化能力的影响 |
4.3.3 miR-708-5p和 let-7c-3p的靶基因预测及表达验证 |
4.4 讨论 |
第5章 EPA提高RAW264.7 细胞的抗炎能力 |
5.1 材料 |
5.1.1 细胞株 |
5.1.2 实验试剂 |
5.1.3 实验仪器 |
5.2 方法 |
5.2.1 细胞培养与处理 |
5.2.2 细胞增殖率检测:MTT法 |
5.2.3 NO释放量测定 |
5.2.4 诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)活性检测 |
5.2.5 炎症因子含量检测:酶联免疫吸附(ELISA)法 |
5.2.6 基因表达量检测 |
5.2.7 统计学分析 |
5.3 结果 |
5.3.1 EPA对 RAW264.7 细胞增殖率的影响 |
5.3.2 EPA降低细胞NO的释放 |
5.3.3 EPA降低细胞iNOS酶活性及基因表达量 |
5.3.4 EPA对细胞炎症因子表达量的影响 |
5.3.5 炎症调节过程中EPA对线粒体转录因子表达量的影响 |
5.4 讨论 |
第6章 结论与展望 |
致谢 |
参考文献 |
在学期间科研成果情况 |
(3)假禾谷镰孢三角状五肽重复蛋白FpPpr1与FpPpr5的功能研究(论文提纲范文)
致谢 |
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 小麦茎基腐病介绍 |
1.1.1 小麦茎基腐病的发生与危害 |
1.1.2 假禾谷镰孢的侵染循环 |
1.2 假禾谷镰孢致病机制 |
1.2.1 次生代谢物参与假禾谷镰孢致病过程 |
1.2.2 DON毒素参与假禾谷镰孢致病过程 |
1.2.3 效应子与假禾谷镰孢致病过程 |
1.3 小麦茎基腐病的防治 |
1.4 线粒体是维持生物体正常功能的重要细胞器 |
1.4.1 线粒体基因组大小 |
1.4.2 线粒体的结构与功能 |
1.4.3 线粒体是生物体内产生ROS的主要场所 |
1.4.4 线粒体细胞色素氧化酶(COX)功能 |
1.4.5 线粒体谷胱甘肽S转移酶功能 |
1.4.6 线粒体功能缺陷可影响生物体的正常功能 |
1.5 Ppr蛋白的生物学功能 |
1.5.1 Ppr蛋白在哺乳动物中的作用 |
1.5.2 Ppr蛋白在植物中的作用 |
1.5.3 Ppr蛋白在微生物中的作用 |
1.6 研究的目的与意义 |
第二章 假禾谷镰孢中三角状五肽重复蛋白的鉴定与基因表达分析 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 供试菌株 |
2.1.2 实验试剂 |
2.2 实验方法 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 假禾谷镰孢PPR基因的鉴定 |
2.3.2 假禾谷镰孢Ppr蛋白进化分析 |
2.3.3 假禾谷镰孢Ppr蛋白3D结构预测 |
2.4 假禾谷镰孢PPR基因表达分析 |
2.5 小结与讨论 |
第三章 假禾谷镰孢FpPPR1基因功能分析 |
3.1 实验材料 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 菌株的培养与保存 |
3.2.2 基因敲除盒的构建 |
3.2.3 假禾谷镰孢原生质体转化的方法 |
3.2.4 FpPPR1基因缺失突变体的验证 |
3.2.5 FpPPR1基因缺失突变体的回补 |
3.2.6 FpPPR1基因缺失突变体表型测定 |
3.2.7 FpPPR1基因回补菌株试剂染色和GFP荧光观察 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 假禾谷镰孢FpPPR1基因敲除与回补 |
3.3.2 假禾谷镰孢突变体ΔFpppr1表型测定 |
3.3.3 FpPPR1基因是假禾谷镰孢致病相关基因 |
3.3.4 假禾谷镰孢FpPpr1蛋白定位于线粒体 |
3.4 小结与讨论 |
第四章 假禾谷镰孢FpPpr1参与细胞色素氧化酶COX1的作用机制 |
4.1 实验材料 |
4.1.1 供试菌株 |
4.1.2 实验试剂 |
4.1.3 试剂配方 |
4.2 实验方法 |
4.3 结果与分析 |
4.3.1 突变体ΔFpppr1转录组数据分析 |
4.3.2 FpPPR1基因参与调控氧还原反应细胞色素P450基因的转录 |
4.3.3 FpPPR1基因参与调控PKS12色素形成的基因簇 |
4.3.4 FpPPR1基因参与调控有性生殖位点基因和异核体不亲合基因表达 |
4.4 假禾谷镰孢FpPpr1参与COX1基因的转录调控 |
4.4.1 突变体ΔFpppr1中COX1基因检测 |
4.4.2 FpPpr1参与调控细胞色素氧化酶活性 |
4.5 假禾谷镰孢FpPpr1 RNA免疫沉淀测序分析 |
4.5.1 Flag免疫沉淀FpPpr1结合的RNA建库测序 |
4.5.2 RNA测序数据分析 |
4.5.3 FpPpr1差异结合基因的筛选 |
4.5.4 FpPpr1-flag结合的线粒体基因分析 |
4.5.5 FpPpr1 RIP-seq结果的qRT-PCR验证 |
4.5.6 预测FpPpr1蛋白COX1 5'UTR结合位点 |
4.6 假禾谷镰孢FpPpr1互作机制分析 |
4.6.1 假禾谷镰孢FpPpr1蛋白检测 |
4.6.2 假禾谷镰孢FpPpr1-flag pul1-down质谱鉴定结果分析 |
4.6.3 假禾谷镰孢FpPpr1和FpMat1-1-3质谱结果关联分析 |
4.7 小结与讨论 |
第五章 假禾谷镰孢FpPPR5基因功能 |
5.1 实验材料 |
5.1.1 供试菌株 |
5.1.2 供试载体 |
5.1.3 实验试剂和培养基 |
5.2 实验方法 |
5.3 结果与分析 |
5.3.1 假禾谷镰孢FpPPR5基因敲除与回补 |
5.3.2 假禾谷镰孢突变体ΔFpppr5表型测定 |
5.3.3 FpPPR5基因是假禾谷镰孢致病必须的 |
5.3.4 假禾谷镰孢FpPpr5互作机制分析 |
5.4 小结与讨论 |
第六章 结论与展望 |
6.1 主要结论 |
6.2 研究创新点 |
6.3 下一步工作展望 |
6.3.1 FpPpr1的下步工作计划: |
6.3.2 FpPpr5的下步工作计划: |
6.3.3 FpPpr1、FpPpr5互作蛋白的下步工作计划: |
参考文献 |
附表 |
(4)AMPK-PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在氧化应激仔猪肠屏障修复中的作用及姜黄素的调控机制(论文提纲范文)
致谢 |
缩略词表 |
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1. 仔猪断奶应激 |
1.1 断奶仔猪肠屏障功能 |
1.2 断奶仔猪肠道氧化状态 |
2. 氧化应激 |
2.1 氧化应激的定义 |
2.2 活性氧 |
2.3 抗氧化防御系统 |
2.4 氧化应激对肠屏障功能的影响 |
3. 线粒体与氧化应激 |
3.1 线粒体与活性氧 |
3.2 线粒体ROS清除系统 |
3.3 线粒体能量代谢 |
3.4 线粒体生物发生 |
4. 线粒体自噬 |
4.1 PINK/Parkin介导的线粒体自噬 |
4.2 BNIP3/Nix介导的线粒体自噬 |
4.3 FUNDC介导的线粒体自噬 |
5. 姜黄素 |
5.1 姜黄素的概述 |
5.2 姜黄素的理化性质 |
5.3 姜黄素的抗氧化功能 |
5.4 姜黄素的抗氧化机制研究 |
5.5 姜黄素对肠道屏障功能的影响 |
6. 研究目的、意义和主要内容 |
6.1 研究目的与意义 |
6.2 主要研究内容 |
第二章 断奶应激对仔猪肠屏障、氧化平衡、线粒体功能和线粒体自噬的影响 |
1. 引言 |
2. 材料与方法 |
3. 试验结果 |
4. 讨论 |
5. 小结 |
第三章 氧化应激对仔猪肠屏障、线粒体功能及线粒体自噬的影响 |
1. 引言 |
2. 材料和方法 |
3. 试验结果 |
4. 讨论 |
5. 小结 |
第四章 AMPK-PINK1/PARKIN介导的线粒体自噬在氧化应激肠上皮细胞修复中的作用 |
1. 引言 |
2. 材料和方法 |
3. 试验结果 |
4. 讨论 |
5. 小结 |
第五章 基于AMPK-PINK1/PARKIN通路研究姜黄素缓解氧化应激诱导的肠屏障损伤的机制 |
1. 引言 |
2. 材料和方法 |
3. 试验结果 |
4. 讨论 |
5. 小结 |
第六章 结论、创新点及研究展望 |
1. 结论 |
2. 创新点 |
3. 研究展望 |
参考文献 |
个人简历 |
(5)陆地棉转GhbZIP1基因CMS种质创新及其不育机理研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
1 前言 |
1.1 植物雄性不育的概述 |
1.2 棉花CMS系种质创新的现状 |
1.3 植物CMS败育的细胞学特征 |
1.3.1 植物CMS与绒毡层细胞结构异常 |
1.3.2 植物CMS与线粒体超微结构 |
1.3.3 棉花CMS败育的细胞学特征 |
1.4 基于线粒体基因组重测序研究植物CMS |
1.4.1 植物CMS与线粒体基因组 |
1.4.2 线粒体基因组测序在植物CMS研究中的应用 |
1.4.3 植物CMS与嵌合开放阅读框 |
1.5 基于全转录组测序研究植物CMS |
1.5.1 转录组测序的应用 |
1.5.2 基于转录组测序研究植物CMS机理 |
1.5.3 基于small RNA测序研究植物CMS机理 |
1.5.4 基于miRNA-m RNA联合分析研究植物CMS机理 |
1.6 植物CMS与活性氧代谢 |
1.6.1 活性氧的来源和作用 |
1.6.2 ROS积累对育性的影响 |
1.7 植物CMS与糖代谢 |
1.8 本研究目的意义 |
2 GhbZIP1 的克隆与表达分析 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 植物材料 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 主要仪器设备 |
2.1.4 总RNA的提取 |
2.1.5 c DNA的合成、克隆及生物信息学分析 |
2.1.6 目的基因的表达量分析 |
2.1.7 目的片段的获得 |
2.1.8 质粒的提取 |
2.1.9 重组质粒的获得与鉴定 |
2.1.10 亚细胞定位 |
2.2 结果与分析 |
2.2.1 “洞A”花药RNA的提取 |
2.2.2 GhbZIP1 基因全长的获得 |
2.2.3 GhbZIP1 的三维结构图 |
2.2.4 进化树分析 |
2.2.5 GhbZIP1 基因的表达模式分析 |
2.2.6 目的片段的获得 |
2.2.7 质粒的少量提取 |
2.2.8 重组GhbZIP1-T载体酶切鉴定 |
2.2.9 重组质粒GhbZIP1-pBI121 的酶切鉴定 |
2.2.10 亚细胞定位 |
2.3 讨论 |
3 雄性不育种质资源的创制与鉴定 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 研究材料 |
3.1.2 质粒DNA的提取(大量提取) |
3.1.3 花粉管通道法转GhbZIP1 基因 |
3.1.4 陆地棉J4B转基因植株的形态学观察与育性调查 |
3.1.5 陆地棉g DNA的提取 |
3.1.6 转基因突变体后代的PCR验证 |
3.1.7 绝对定量进行转基因拷贝数检测 |
3.1.8 陆地棉CMS系J4A的获得与命名 |
3.1.9 CMS系 J4A与其保持系 J4B的压片观察 |
3.1.10 CMS系 J4A与其保持系 J4B的扫描电镜观察 |
3.1.11 CMS系 J4A与其保持系 J4B的石蜡切片观察 |
3.1.12 CMS系 J4A与其保持系 J4B的透射电镜观察 |
3.1.13 J4A和J4B花药3 个发育时期的生化指标测定 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 PCR检测转基因不育株 |
3.2.2 阳性植株拷贝数的检测 |
3.2.3 转基因后代育性调查与形态学观察 |
3.2.4 农艺性状及花器官观察 |
3.2.5 花药扫描电镜观察 |
3.2.6 I_2-KI压片观察 |
3.2.7 石蜡切片观察 |
3.2.8 叶片透射电镜观察 |
3.2.9 花药透射电镜观察 |
3.2.10 活性氧测定 |
3.2.11 糖代谢物质测定 |
3.3 讨论 |
3.3.1 花粉管通道法转基因的应用 |
3.3.2 花粉管通道法转基因的机理 |
3.3.3 花粉管通道法转基因的验证 |
3.3.4 陆地棉CMS系J4A败育发生时期 |
4 陆地棉J4B、J4A-1、J4A-2和J4A-3 线粒体基因组重测序及完成图构建 |
4.1 材料与方法 |
4.1.1 研究材料 |
4.1.2 陆地棉mt DNA的提取 |
4.1.3 陆地棉mt DNA的测序与组装 |
4.1.4 陆地棉mt DNA的分析与注释 |
4.1.5 SNPs的检测与标注 |
4.1.6 In Dels检测 |
4.1.7 SV检测 |
4.2 结果与分析 |
4.2.1 mt DNA质量检测 |
4.2.2 测序数据概况 |
4.2.3 线粒体基因组组装 |
4.2.4 线粒体基因组分分析 |
4.2.5 重复序列分析 |
4.2.6 mt DNA与叶绿体和核基因组同源序列 |
4.2.7 CMS系中的特有的ORFs |
4.2.8 SNP检测及注释 |
4.2.9 In Dels检测及注释 |
4.2.10 SV检测与分析 |
4.3 讨论 |
5 CMS系 J4A与保持系 J4B花药m RNA测序 |
5.1 材料与方法 |
5.1.1 植物材料 |
5.1.2 总RNA提取 |
5.1.3 转录组测序流程 |
5.1.4 mRNA表达量分析 |
5.1.5 基因表达差异分析 |
5.1.6 差异表达m RNA的 GO和 KEGG富集分析 |
5.1.7 qRT-PCR验证 |
5.2 结果与分析 |
5.2.1 总RNA的提取与质量检测 |
5.2.2 高通量测序数据的处理 |
5.2.3 可变剪切类型分析 |
5.2.4 mRNA差异表达量分析 |
5.2.5 差异表达mRNA的 GO富集分析 |
5.2.6 差异表达mRNA的 KEGG富集分析 |
5.2.7 糖酵解途径的差异表达基因 |
5.2.8 参与电子传递链的差异表达基因 |
5.2.9 转录因子差异表达基因 |
5.2.10 花粉发育相关的差异表达基因 |
5.2.11 mRNA表达水平的qRT-PCR验证 |
5.3 讨论 |
5.3.1 差异表达基因参与糖酵解途径 |
5.3.2 差异表达基因参与线粒体电子传递链 |
6 不育系 J4A与保持系 J4B花药miRNA测序 |
6.1 测序材料与方法 |
6.1.1 植物材料 |
6.1.2 RNA的提取 |
6.1.3 原始数据的过滤与长度分布统计 |
6.1.4 miRBase数据库比对 |
6.1.5 miRNA丰度差异分析 |
6.1.6 差异表达mi RNA的 GO和 KEGG富集分析 |
6.1.7 miRNA表达水平qRT-PCR验证 |
6.2 结果与分析 |
6.2.1 测序数据概况 |
6.2.2 miRBase数据库比对 |
6.2.3 miRNA丰度差异分析 |
6.2.4 差异表达miRNA的 GO富集分析 |
6.2.5 差异表达miRNA靶基因的KEGG富集分析 |
6.2.6 miRNA表达水平qRT-PCR |
6.2.7 miRNA与其靶基因mRNA的互作 |
6.3 讨论 |
7 全文结论与讨论 |
7.1 主要结论 |
7.2 CMS系J4A不育分子机理推测 |
7.3 本研究的创新点 |
7.4 问题与展望 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
研究生期间科研、论文发表和专利发明情况 |
(6)黄单胞菌属病原菌对申嗪霉素及其吩嗪同系物耐药性机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1 吩嗪类化合物研究进展 |
1.1 吩嗪类化合物的发现 |
1.2 吩嗪类化合物的生物合成与调控 |
1.3 吩嗪类化合物在其产生菌中的功能 |
1.4 吩嗪类化合物对非产吩嗪生物体的抑制与促进作用 |
1.4.1 吩嗪类化合物对细菌的活性 |
1.4.2 吩嗪类化合物对真菌的活性 |
1.4.3 吩嗪类化合物对植物的活性 |
1.5 吩嗪类化合物的生物安全性 |
2 黄单胞菌属病原细菌研究进展 |
2.1 黄单胞菌属病原细菌概述 |
2.2 重要黄单胞菌属细菌病害介绍 |
2.2.1 油菜黑腐病 |
2.2.2 水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病 |
2.2.3 柑橘溃疡病 |
2.2.4 木薯细菌性枯萎病 |
2.3 细菌性植物病害防治药剂概述 |
2.3.1 消毒型杀菌剂 |
2.3.2 铜类杀菌剂 |
2.3.3 噻唑类杀菌剂 |
2.3.4 微生物制剂 |
2.3.5 抗生素类杀菌剂 |
3 吩嗪类化合物与黄单胞菌属病原菌互作研究进展 |
3.1 吩嗪类化合物防治黄单胞菌属病原菌研究概述 |
3.2 微生物对吩嗪类化合物的耐受性机制研究 |
4 本文研究思路与意义 |
第二章 野油菜黄单胞菌突变体库的构建及申嗪霉素敏感突变体筛选 |
1 材料与方法 |
1.1 菌株、质粒、引物、试剂和所用培养基 |
1.2 黄单胞菌属病原菌感受态细胞制备 |
1.3 野油菜黄单胞菌Tn5插入突变体库构建 |
1.4 对申嗪霉素敏感的Tn5插入突变体筛选 |
1.5 Tn5插入突变体对申嗪霉素的敏感性测定 |
1.6 基因组DNA提取 |
1.7 对申嗪霉素敏感的Tn5插入突变体中转座子插入数量验证 |
1.8 TAIL PCR法鉴定转座子插入位点 |
1.9 质粒拯救法鉴定转座子插入位点 |
2 结果与分析 |
2.1 Tn5插入突变体及其对申嗪霉素的敏感性 |
2.2 插入突变体中转座子插入数与突变体对申嗪霉素的敏感性关系 |
2.3 转座子插入位点与突变体对申嗪霉素的敏感性关系 |
3 讨论 |
第三章 C型细胞色素蛋白调控野油菜黄单胞菌对申嗪霉素及其吩嗪同系物耐药性 |
1 材料与方法 |
1.1 菌株、质粒、杀菌剂和培养基制备 |
1.2 基因组DNA提取 |
1.3 缺失突变体与回复突变体构建 |
1.4 申嗪霉素敏感性测定 |
1.5 菌落形态测定 |
1.6 生长速率测定 |
1.7 游动性测定 |
1.8 申嗪霉素处理下胞内氧化物含量测定 |
1.9 过氧化氢敏感性测定 |
1.10 外源血红素影响野油菜黄单胞菌申嗪霉素敏感性的测定 |
1.11 黄单胞菌属细胞色素C合成系统基因簇保守性分析 |
2 结果与分析 |
2.1 野油菜黄单胞菌细胞色素C合成系统缺失突变体及其对申嗪霉素敏感性变化 |
2.2 野油菜黄单胞菌细胞色素C合成系统缺失突变体对其他杀细菌剂的敏感性 |
2.3 野油菜黄单胞菌细胞色素C合成系统缺失突变体的适合度 |
2.4 野油菜黄单胞菌细胞色素C合成系统缺失突变体胞内氧化物对申嗪霉素的响应积累 |
2.5 野油菜黄单胞菌细胞色素C合成系统缺失突变体对过氧化氢的敏感性 |
2.6 外源血红素对野油菜黄单胞菌申嗪霉素敏感性的影响 |
2.7 黄单胞菌属病原细菌细胞色素C合成系统的同源性 |
2.8 野油菜黄单胞菌Dsb途径缺失突变体对申嗪霉素的敏感性 |
2.9 野油菜黄单胞菌Dsb途径缺失突变体的适合度 |
3 讨论 |
第四章 双精氨酸蛋白转运途径影响野油菜黄单胞菌对申嗪霉素及其吩嗪同系物的耐药性 |
1 材料与方法 |
1.1 菌株、质粒、杀菌剂和培养基制备 |
1.2 基因组DNA提取 |
1.3 启动子预测 |
1.4 缺失突变体与回复突变体构建 |
1.5 申嗪霉素敏感性测定 |
1.6 实时荧光定量PCR |
1.7 对其他杀菌剂敏感性测定 |
1.8 菌落形态测定 |
1.9 生长速率测定 |
1.10 游动性测定 |
1.11 申嗪霉素处理下胞内氧化物含量测定 |
1.12 过氧化氢敏感性测定 |
1.13 呼吸速率测定 |
1.14 黄单胞菌属双精氨酸蛋白转运途径基因簇保守性分析 |
2 结果与分析 |
2.1 野油菜黄单胞菌双精氨酸蛋白转运途径基因簇启动子预测结果 |
2.2 双精氨酸蛋白转运途径基因缺失突变体对申嗪霉素的敏感性 |
2.3 双精氨酸蛋白转运途径基因缺失对基因表达的影响 |
2.4 双精氨酸蛋白转运途径基因缺失突变体对其他杀细菌剂的敏感性 |
2.5 双精氨酸蛋白转运途径基因缺失突变体的适合度 |
2.6 双精氨酸蛋白转运途径基因缺失突变体胞内氧化物对申嗪霉素的响应积累 |
2.7 双精氨酸蛋白转运途径基因缺失突变体对过氧化氢的敏感性 |
2.8 双精氨酸蛋白转运途径基因缺失突变体的呼吸速率 |
2.9 黄单胞菌属病原细菌双精氨酸蛋白转运途径基因簇的保守性 |
3 讨论 |
第五章 细胞色素bc1复合体通过影响胞内NADH/NAD~+水平调控黄单胞菌对申嗪霉素及其吩嗪同系物的耐药性 |
1 材料与方法 |
1.1 菌株、质粒、杀菌剂和培养基制备 |
1.2 基因组DNA提取 |
1.3 缺失突变体与回复突变体构建 |
1.4 申嗪霉素敏感性测定 |
1.5 其他杀菌剂敏感性测定 |
1.6 菌落形态测定 |
1.7 生长速率测定 |
1.8 游动性测定 |
1.9 过氧化氢敏感性测定 |
1.10 黄单胞菌属细胞色素bc1复合体基因簇保守性分析 |
1.11 互作蛋白的免疫共沉淀鉴定方法 |
1.12 琥珀酸脱氢酶活性测定 |
1.13 NADH还原酶活性测定 |
1.14 胞内NADH/NAD~+水平测定 |
1.15 液相色谱-质谱检测 |
2 结果与分析 |
2.1 野油菜黄单胞菌细胞色素bc1复合体在对申嗪霉素耐药性中的作用 |
2.1.1 野油菜黄单胞菌细胞色素bc1复合体缺失对申嗪霉素敏感性的影响 |
2.1.2 野油菜黄单胞菌细胞色素bc1复合体缺失对其他杀细菌剂敏感性的影响 |
2.1.3 野油菜黄单胞菌细胞色素bc1复合体缺失突变体的适合度 |
2.1.4 黄单胞菌属细胞色素bc1复合体同源性分析 |
2.1.5 细胞色素bc1复合体缺失对水稻白叶枯病菌的申嗪霉素敏感性影响 |
2.1.6 野油菜黄单胞菌细胞色素bc1复合体被水稻白叶枯病菌细胞色素bc1复合体基因簇取代后对申嗪霉素的敏感性 |
2.2 野油菜黄单胞菌不同亚型细胞色素c蛋白缺失突变体对申嗪霉素及过氧化氢的敏感性 |
2.2.1 野油菜黄单胞菌不同亚型细胞色素c蛋白缺失突变体对申嗪霉素及过氧化氢的敏感性 |
2.2.2 细胞色素C4互作蛋白对申嗪霉素敏感性的调控作用 |
2.3 硫酸吩嗪甲酯(PMS)对野油菜黄单胞菌细胞色素bc1缺失突变体生长及对申嗪霉素耐药性的调控作用 |
2.4 琥珀酸脱氢酶对野油菜黄单胞菌的申嗪霉素耐药性调控作用 |
2.4.1 野油菜黄单胞菌细胞色素bc1缺失突变体的琥珀酸脱氢酶活性 |
2.4.2 野油菜黄单胞菌琥珀酸脱氢酶缺失突变体的生长 |
2.4.3 野油菜黄单胞菌琥珀酸脱氢酶缺失突变体对申嗪霉素的敏感性 |
2.5 野油菜黄单胞菌细胞色素bc1缺失突变体NADH/NAD~+水平对申嗪霉素耐药性的调控作用 |
2.5.1 野油菜黄单胞菌细胞色素bc1缺失突变体NADH的降解速率 |
2.5.2 野油菜黄单胞菌细胞色素bc1缺失突变体的NADH/NAD~+水平 |
2.5.3 申嗪霉素在活体中被野油菜黄单胞菌还原 |
2.5.4 申嗪霉素对野油菜黄单胞菌及其细胞色素bc1缺失突变体胞内NADH/NAD~+水平的影响 |
2.5.5 硫酸吩嗪甲酯(PMS)对野油菜黄单胞菌及其细胞色素bc1缺失突变体NADH/NAD~+水平的影响 |
2.5.6 离体条件下NADH与PMS、PCA和DCPIP的反应速率比较 |
2.5.7 2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)对野油菜黄单胞菌细胞色素bc1缺失突变体的申嗪霉素敏感性调控 |
2.5.8 细胞色素bc1抑制剂对申嗪霉素在植物病原菌中的增效作用 |
3 讨论 |
3.1 细胞色素bc1对黄单胞菌属的申嗪霉素耐药性调控作用 |
3.2 细胞色素c蛋白对黄单胞菌的申嗪霉素耐药性调控作用 |
3.3 琥珀酸脱氢酶对黄单胞菌属菌的对申嗪霉素耐药性调控作用 |
3.4 胞内NADH/NAD~+水平对黄单胞菌的申嗪霉素耐药性调控作用 |
3.5 细胞色素bc1复合体抑制剂对申嗪霉素生物活性的影响 |
全文总结 |
一、本研究获得的主要结果 |
二、本研究创新点 |
三、本研究不足之处及值得深入研究的问题 |
参考文献 |
附录 |
研究生期间发表的学术论文 |
致谢 |
(7)玉米雄性不育系K932S的遗传分析(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
中英文缩写对照 |
第一章 文献综述 |
1.1 植物雄性不育研究概况 |
1.1.1 植物雄性不育的概念及分类 |
1.1.2 玉米雄性不育的分类 |
1.1.3 玉米细胞质类型的鉴定方法 |
1.2 植物花药发育的细胞学观察 |
1.2.1 主要作物雄性不育的细胞学研究 |
1.2.2 玉米正常花药发育细胞学观察 |
1.2.3 玉米细胞质雄性不育的细胞学研究 |
1.3 植物雄性不育的生理生化机制 |
1.3.1 抗氧化酶活性与雄性不育 |
1.3.2 淀粉和糖代谢与雄性不育 |
1.3.3 氨基酸代谢与雄性不育 |
1.3.4 蛋白质与雄性不育 |
1.4 植物雄性不育及育性恢复机理 |
1.4.1 植物细胞核雄性不育机理研究进展 |
1.4.2 主要作物细胞质不育机理研究进展 |
1.4.3 主要作物育性恢复机理研究进展 |
1.4.4 玉米细胞质雄性不育和育性恢复机理研究进展 |
1.5 转录组测序在植物雄性不育研究中的应用 |
1.5.1 转录组学研究的发展 |
1.5.2 转录组主要研究方法简介 |
1.5.3 雄性不育材料转录组测序时组织和时期的选择 |
1.5.4 雄性不育转录组差异表达基因的筛选 |
1.5.5 差异表达基因的功能富集通路 |
1.6 研究内容及目的意义 |
第二章 玉米雄性不育系K932S的遗传鉴定 |
2.1 前言 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 供试材料及来源 |
2.2.2 农艺性状测定方法 |
2.2.3 育性鉴定 |
2.2.4 不育性状的遗传鉴定 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 主要农艺性状比较 |
2.3.2 K932MS的雄穗表型特征 |
2.3.3 K932S的育性遗传方式 |
2.4 结论与讨论 |
2.4.1 K932S败育的表型特征 |
2.4.2 K932S育性遗传模式 |
2.4.3 K932S不育性状的发生 |
第三章 玉米雄性不育系K932S的细胞学观察 |
3.1 前言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 试验材料 |
3.2.2 试验方法 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 K932S细胞质类型鉴定 |
3.3.2 K932MS花药发育观察 |
3.4 结论与讨论 |
3.4.1 K932S的细胞质类型 |
3.4.2 K932S败育的细胞学特征 |
3.4.3 K932S的应用前景 |
第四章 K932S和K932F生理生化特性比较研究 |
4.1 前言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 供试材料 |
4.2.2 试验方法 |
4.3 结果与分析 |
4.3.1 方差分析 |
4.3.2 不育与可育花药可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量比较 |
4.3.3 不育与可育花药中CAT、SOD和POD酶活性比较 |
4.4 结论与讨论 |
4.4.1 K932S花药物质代谢与雄性不育 |
4.4.2 K932S花药抗氧化系统中关键酶活性变化与雄性不育 |
第五章 K932S与K932R差异表达基因分析 |
5.1 前言 |
5.2 材料与方法 |
5.2.1 供试材料及来源 |
5.2.2 田间种植及样品采集 |
5.2.3 RNA提取及建库测序 |
5.2.4 测序数据过滤及参考序列比对分析 |
5.2.5 基因表达水平分析 |
5.2.6 差异表达基因的统计比较 |
5.2.7 差异表达基因的GO富集分析 |
5.2.8 差异表达基因的KEGGpathway富集分析 |
5.2.9 qRT-PCR检测目标基因表达 |
5.2.10 花药中氨基酸含量测定 |
5.3 结果与分析 |
5.3.1 测序序列组装比对分析 |
5.3.2 新转录本、可变剪接和单核苷酸多态性分析 |
5.3.3 差异表达基因的筛选 |
5.3.4 差异表达基因的GO功能显着性分析 |
5.3.5 KEGG通路的富集分析 |
5.3.6 K932S败育相关差异表达基因分析 |
5.3.7 氨基酸合成相关基因的qRT-PCR表达 |
5.3.8 花药中氨基酸含量比较分析 |
5.4 结论与讨论 |
5.4.1 K932S和K932R转录组测序质量分析 |
5.4.2 差异表达基因变化规律及功能 |
5.4.3 关键代谢途径DEGs与K932S败育过程的关系 |
第六章 总结与展望 |
6.1 结论 |
6.2 创新点 |
6.3 后续工作展望 |
参考文献 |
致谢 |
附录 |
作者简历 |
(8)诱导恢复性智能雄性不育体系的构建及应用(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词 |
第一章 文献综述 |
1.1 植物雄性不育 |
1.2 Barnase及Barstar在植物基因工程中的应用 |
1.3 启动子 |
1.4 拟南芥花的发育进程 |
1.5 研究目的与意义 |
第二章 材料与方法 |
2.1 实验材料及实验设备 |
2.2 实验方法 |
第三章 AtDADI启动子在拟南芥中的功能分析 |
3.1 AtDAD1启动子的背景 |
3.2 DADB及其5’和3’端删除表达载体对农杆菌菌株GV3101的转化 |
3.3 转pRDADX拟南芥的获得及PCR检测 |
3.4 转pRDADX拟南芥的GUS染色结果 |
第四章 在拟南芥中构建诱导恢复性雄性不育体系初探 |
4.1 诱导恢复性雄性不育表达载体的构建及转化拟南芥 |
4.2 诱导恢复性雄性不育拟南芥T_1代的PCR检测 |
4.3 诱导恢复性雄性不育拟南芥T_1代表型观察 |
第五章 在拟南芥中构建诱导恢复性智能雄性不育体系 |
5.1 基于花丝特异性启动子的新型雄性不育的构建与转基因雄性不育拟南芥的获得 |
5.2 诱导恢复性智能雄性不育(IMS)的构建与转IMS拟南芥的获得 |
第六章 IMS系统在甘蓝型油菜中的验证 |
6.1 转诱导恢复性智能雄性不育(IMS)甘蓝型油菜植株的获得 |
6.2 转IMS油菜植株的表型观察与育性鉴定 |
第七章 分析和讨论 |
7.1 花丝特异性启动子DADB的生物信息学分析 |
7.2 DADB及其删除序列在烟草和拟南芥中的GUS表达对比分析 |
7.3 DADB驱动mBarnV基因表达导致雄性不育表型的原因讨论 |
7.4 诱导恢复性智能雄性不育甘蓝型油菜表型不明显原因讨论 |
7.5 诱导恢复性智能雄性不育体系的优势讨论 |
第八章 结论和展望 |
结论 |
展望 |
参考文献 |
附录 甜菜素合成的亚细胞腔室及过氧化氢-酚氧化酶的亚细胞定位 |
1.1 前言 |
1.2 材料与方法 |
1.3 甜菜素合成关键酶的亚细胞定位 |
1.4 红苋菜过氧化氢-酚氧化酶AcCATPO的亚细胞定位 |
1.5 讨论 |
1.6 结论 |
1.7 参考文献 |
致谢 |
个人简历 |
(9)H5N1禽流感病毒和H1N1/2009遗传兼容性与H5N1诱导氧化应激和线粒体动态紊乱的机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
缩略语表 |
第一章 文献综述 |
1 流感病毒 |
1.1 流感病毒分类 |
1.2 流感病毒形态结构和基因组 |
1.3 流感病毒编码蛋白及其主要功能 |
1.4 流感病毒的复制 |
1.5 流感大爆发及流行 |
1.6 流感病毒的致病因素 |
2 氧化应激 |
2.1 ROS |
2.2 ROS来源 |
2.3 ROS生理功能 |
2.4 ROS与病毒感染 |
2.5 抗氧化系统 |
3 线粒体动态 |
3.1 线粒体动态和线粒体自噬 |
3.2 线粒体动态与细胞凋亡 |
3.3 线粒体动态与天然免疫 |
3.4 氧化应激与线粒体功能紊乱 |
第二章 H5N1禽流感病毒与H1N1/2009基因组兼容性的研究 |
1 材料与方法 |
1.1 毒株 |
1.2 细胞 |
1.3 混合感染及子代病毒的分离与纯化 |
1.4 子代病毒的基因组成测定 |
1.5 子代病毒在A549上的增殖特性 |
1.6 子代病毒小鼠致病力 |
1.7 重组聚合酶活力测定 |
1.8 统计分析 |
2 结果与分析 |
2.1 HM/06与LN/09产生的子代病毒基因组构成及规律 |
2.2 重组病毒体外增殖能力研究 |
2.3 重组病毒对小鼠的致病力研究 |
2.4 16种重组聚合酶活性测定 |
3 讨论 |
4 小结 |
第三章 病毒诱导的氧化应激及其与病毒致病力的关系研究 |
1 材料与方法 |
1.1 毒株 |
1.2 细胞 |
1.3 主要仪器设备 |
1.4 主要试剂及其配制 |
1.5 PCR扩增、产物回收、连接与转化及鉴定 |
1.6 质粒提取 |
1.7 病毒感染 |
1.8 病毒滴定 |
1.9 RNA提取及反转录 |
1.10 相对荧光定量(qRT-PCR) |
1.11 转染实验 |
1.12 Western b1otting |
1.13 ROS检测 |
1.14 凋亡检测 |
1.15 统计分析 |
2 结果与分析 |
2.1 病毒感染诱导氧化应激的产生 |
2.2 影响ROS产生的通路 |
2.3 病毒蛋白对ROS的影响 |
2.4 病毒感染对参与氧化和抗氧化过程基因表达的影响 |
2.5 NOX4和SOD1参与病毒复制 |
2.6 沉默NOX4降低病毒诱导的ROS水平 |
2.7 NOX4过表达促进病毒增殖和增强病毒诱导的氧化应激 |
2.8 沉默NOX4抑制炎性反应 |
2.9 DPI抑制病毒诱导的ROS产生和病毒复制 |
2.10 DPI抑制炎性反应 |
2.11 DPI抑制病毒NP出核 |
2.12 SOD1抑制H5N1病毒的复制的研究 |
3 讨论 |
4 小结 |
第四章 H5N1致线粒体动态紊乱的机制研究 |
1 材料与方法 |
1.1 细胞 |
1.2 主要试剂 |
1.3 主要抗体 |
1.4 主要质粒的构建 |
1.5 间接免疫荧光 |
1.6 细胞全基因组(线粒体DNA)的提取及绝对定量 |
1.7 线粒体膜电势的检测 |
1.8 线粒体mitotracker染色及荧光强度检测 |
1.9 凋亡检测 |
1.10 双荧光报告系统 |
1.11 SiRNA合成和转染 |
1.12 主要的RT-PCR引物 |
1.13 电镜观察 |
1.14 统计分析 |
2 结果与分析 |
2.1 H5N1引起线粒体功能紊乱 |
2.2 H5N1感染促使线粒体融合 |
2.3 电镜观察病毒感染后线粒体形态 |
2.4 H5N1感染A549后Drp1的转位 |
2.5 H5N1病毒感染后Parkin的转位 |
2.6 H5N1感染后线粒体增多 |
2.7 H5N1感染A549促进自噬 |
2.8 M2过表达诱导自噬的产生 |
2.9 M2抑制自噬体的降解 |
2.10 M2过表达增加线粒体的数量 |
2.11 流感病毒感染抑制自噬体的降解 |
2.12 H5N1病毒感染A549对线粒体动态调节相关基因的影响 |
2.13 H5N1感染后降低Drp1和MFF的表达 |
2.14 沉默Drp1和MFF促使线粒体融合 |
2.15 沉默Drp1和MFF上调线粒体数量 |
2.16 Drp1和MFF对凋亡的影响 |
2.17 Drp1和MFF对病毒增殖的影响不同 |
2.18 Drp1负调控抗病毒反应 |
2.19 MFF正调控抗病毒反应 |
2.20 H5N1对Drp1和MFF转录后的影响 |
2.21 MG132和CQ对Drp1和MFF蛋白的影响 |
3 讨论 |
3.1 线粒体动态平衡与H5N1高致病性禽流感病毒感染 |
3.2 Drp1和MFF对线粒体动态的影响 |
3.3 H5N1与线粒体的自噬降解 |
3.4 线粒体融合与细胞凋亡 |
3.5 Drp1和MFF对细胞增殖的影响 |
3.6 H5N1对Drp1和MFF的不同调控 |
4 小结 |
第五章 结论与创新点 |
参考文献 |
致谢 |
附录 |
(10)玉米C型胞质不育的机理与穗发育相关miRNA的研究(论文提纲范文)
致谢 |
摘要 |
第一章 玉米C型胞质不育的机理研究 |
1 文献综述 |
1.1 植物细胞质雄性不育 |
1.2 雄性不育及育性恢复的重要性 |
1.2.1 利用杂种优势的重要遗传资源 |
1.2.2 细胞质雄性不育/恢复系统:研究线粒体-核共同进化和相互作用的模型 |
1.3 主要作物的细胞质雄性不育和恢复基因研究进展 |
1.3.1 CMS基因的测序特征 |
1.3.2 恢复基因的鉴定及序列特征 |
1.4 细胞质雄性不育的机理 |
1.4.1 细胞毒性模型 |
1.4.2 能量缺乏模型 |
1.4.3 异常的细胞程序性死亡模型 |
1.4.4 反向调控模型 |
1.5 细胞质雄性不育的育性恢复机制 |
1.5.1 细胞质雄性不育在基因组水平的育性恢复 |
1.5.2 细胞质雄性不育在转录后水平的育性恢复 |
1.5.3 在翻译或翻译后水平的胞质雄性不育的育性恢复 |
1.5.4 代谢水平的胞质雄性不育的育性恢复 |
1.6 玉米雄性不育 |
1.7 转录组 |
1.7.1 转录组和转录组学研究方法 |
1.7.2 RNA-Seq测序的特点及应用 |
1.8 本研究的目的及意义 |
2 引言 |
3 材料与方法 |
3.1 试验材料 |
3.1.1 植物材料 |
3.1.2 常规菌种 |
3.1.3 载体 |
3.1.4 试剂 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 线粒体DNA的提取 |
3.2.1.1 黄化苗线粒体的分离 |
3.2.1.2 线粒体DNA的提取 |
3.2.1.3 线粒体DNA的质量及纯度检测 |
3.2.2 差异片段的克隆和测序比较 |
3.2.2.1 玉米CMS-C序列差异ORF引物设计 |
3.2.2.2 PCR反应体系及反应程序 |
3.2.2.3 电泳检测 |
3.2.2.4 PCR产物纯化 |
3.2.2.5 连接载体pMD19-T |
3.2.2.6 测序结果 |
3.2.3 差异ORF原核表达载体构建及生长曲线的测定 |
3.2.3.1 设计引物 |
3.2.3.2 克隆ORF |
3.2.3.3 质粒提取 |
3.2.3.4 限制性内切酶双酶切 |
3.2.3.5 电泳检测及切胶回收 |
3.2.3.6 基因片段与载体相连 |
3.2.3.7 重组质粒转化大肠杆菌BL21 |
3.2.3.8 生长曲线的测定 |
3.2.4 植物表达载体构建及遗传转化 |
3.2.4.1 植物表达载体构建 |
3.2.4.2 转化农杆菌GV3101 |
3.2.4.3 拟南芥的种植 |
3.2.4.4 花序浸染法转化拟南芥 |
3.2.4.5 转基因株系的检测 |
3.2.5 PEG介导的原生质体瞬时表达 |
3.2.6 Western blot检测 |
3.2.6.1 抗体旳制备 |
3.2.6.2 蛋白样品的制备 |
3.2.6.3 Western杂交步骤 |
3.2.7 转录组测序 |
3.2.7.1 RNA的提取 |
3.2.7.2 转录组测序实验步骤 |
3.2.7.3 信息分析流程图 |
3.2.8 实时荧光定量PCR(real-time PCR) |
3.2.8.1 RT-PCR引物 |
3.2.8.2 实时荧光定量PCR(real-time PCR)分析 |
3.2.9 序列分析 |
4 结果与分析 |
4.1 不育系ORFs与保持系的同源序列的对比分析 |
4.2 ORFs的原核表达分析 |
4.2.1 原核表达载体的构建 |
4.2.2 IPTG诱导表达 |
4.3 拟南芥的遗传转化 |
4.4 ORF415的瞬时表达 |
4.5 不育胞质orf415编码蛋白产物的分析 |
4.6 orf415 编码蛋白产物的western杂交检测 |
4.7 转录组分析 |
4.7.1 RNA提取及质量检测 |
4.7.2 转录组文库质量评估 |
4.7.2.1 转录组数据与参考基因组的序列比对 |
4.7.2.2 基因覆盖度统计 |
4.7.3 转录组文库质量评估 |
4.7.3.1 mRNA片段化随机性检验 |
4.7.3.2 插入片段长度检验 |
4.7.3.3 转录组测序数据饱和度检验 |
4.7.4 基因结构分析 |
4.7.4.1 SNP分析 |
4.7.4.2 新可变剪接事件预测 |
4.7.5 新基因分析 |
4.7.6 差异表达分析 |
4.7.6.1 差异表达筛选 |
4.7.6.2 差异表达基因聚类分析 |
4.7.7 差异表达基因功能注释和富集分析 |
4.7.7.1 差异表达基因GO分类 |
4.7.7.2 差异表达基因COG分类 |
4.7.7.3 差异表达基因KEGG注释 |
4.7.7.4 差异表达基因KEGG通路富集分析 |
4.7.8 DEG表达量分析 |
5 讨论 |
5.1 细胞质雄性不育的育性相关ORF筛选 |
5.2 转录组差异分析 |
第二章 玉米穗发育miRNA和靶基因的确认 |
1 文献综述 |
1.1 microRNA的生物学特性与作用机制 |
1.2 植物microRNA的特征与功能 |
1.3 植物microRNA的获得途径 |
1.4 植物microRNA的检测 |
1.4.1 基于分子杂交的植物microRNA检测 |
1.4.2 基于PCR技术的植物microRNA检测 |
1.5 植物microRNA靶基因预测及功能验证 |
2 引言 |
3 材料和方法 |
3.1 植物材料 |
3.2 miRNA深度测序 |
3.3 miRNA数据分析 |
3.4 miRNA靶基因预测 |
3.5 全基因组的降解组测序 |
3.6 深度测序的验证 |
4 结果与分析 |
4.1 miRNA文库质控 |
4.2 玉米穗发育miRNA和靶基因的确认 |
4.3 新的miRNA的确定 |
4.4 全基因组降解组测序对miRNA靶基因的确认 |
4.5 玉米穗不同发育阶段miRNA和其靶基因的表达 |
5 讨论 |
参考文献 |
Abstract |
缩写词 Abbreviations |
四、过氧化氢导致线粒体DNA编码细胞色素C氧化酶基因突变与其编码蛋白结构与功能关系的研究(论文参考文献)
- [1]玉米籽粒发育调控基因ZmNPF7.9和ZmAPP1的克隆与功能分析[D]. 魏一鸣. 山东农业大学, 2021
- [2]二十碳五烯酸(EPA)的抗氧化及抗炎作用研究[D]. 肖宝平. 集美大学, 2021(01)
- [3]假禾谷镰孢三角状五肽重复蛋白FpPpr1与FpPpr5的功能研究[D]. 王利民. 河南农业大学, 2021
- [4]AMPK-PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在氧化应激仔猪肠屏障修复中的作用及姜黄素的调控机制[D]. 曹舒婷. 浙江大学, 2020(02)
- [5]陆地棉转GhbZIP1基因CMS种质创新及其不育机理研究[D]. 李敏. 广西大学, 2020
- [6]黄单胞菌属病原菌对申嗪霉素及其吩嗪同系物耐药性机制研究[D]. 武健. 南京农业大学, 2019(08)
- [7]玉米雄性不育系K932S的遗传分析[D]. 周国昌. 四川农业大学, 2018(02)
- [8]诱导恢复性智能雄性不育体系的构建及应用[D]. 陈宁. 中国农业大学, 2018(07)
- [9]H5N1禽流感病毒和H1N1/2009遗传兼容性与H5N1诱导氧化应激和线粒体动态紊乱的机制研究[D]. 林显. 华中农业大学, 2016(04)
- [10]玉米C型胞质不育的机理与穗发育相关miRNA的研究[D]. 王彬. 河南农业大学, 2015(01)