一、RNAi,a new therapeutic strategy against viral infection（论文文献综述）
曾锐敏[1]（2021）在《B2m基因RNAi慢病毒载体构建及其对肝癌细胞增殖的影响》文中进行了进一步梳理
吴贤建[2]（2021）在《缺氧微环境中HIF-1/RACGAP1调控人肝癌细胞发生发展的机制研究》文中研究指明目的:探究缺氧微环境下HIF-1α基因和RACGAP1基因对人肝癌细胞系Huh-7与Hep3B细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其之间的调控关系。方法:构建人肝癌Huh-7与Hep3B细胞缺氧模型。实验设立空白对照组（control）、无义质粒组（LV-OE-NC、LV-RNAi-NC）、HIF-1α敲减组（LV-HIF-1α-RNAi）、RACGAP1敲减组（LV-RACGAP1-RNAi）、HIF-1α敲减+RACGAP1敲减组（LV-HIF-1α-RNAi+LV-RACGAP1-RNAi）;HIF-1α过表达组（LV-OE-HIF-1α）、RACGAP1过表达组（LV-OE-RACGAP1）。实验采用免疫荧光检测慢病毒转染效率;采用Western blot、q PCR检测HIF-1α和RACGAP1表达;采用CCK-8、流式细胞术、划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力。结果:本研究构建的慢病毒转染细胞模型,转染成功率75%以上。与对照组及无义质粒组相比较,抑制HIF-1α的表达,RACGAP1基因的表达量降低（P<0.05）,细胞的增殖、迁移、侵袭能力降低（P均<0.05）,细胞凋亡增多（P<0.05）。相反,与对照组及无义质粒组相比较,过表达HIF-1α,RACGAP1基因的表达量升高（P<0.05）,细胞的增殖、迁移、侵袭能力增高（P均<0.05）,细胞凋亡减少（P<0.05）。与对照组及无义质粒组相比较,抑制RACGAP1的表达,HIF-1α的表达量降低（P<0.05）,过表达RACGAP1,HIF-1α基因的表达量升高（P<0.05）。抑制RACGAP1表达,细胞的增殖能力低于对照组（P<0.05）,细胞凋亡高于对照组（P<0.05）。抑制HIF-1α+RACGAP1表达,细胞的侵袭能力显着低于对照组及无义质粒组（P均<0.01）,细胞凋亡显着高于对照组及无义质粒组（P<0.01）。结论:（1）本研究成功构建了缺氧人肝癌Huh-7与Hep3B细胞系模型,并使用慢病毒成功转染人肝癌Huh-7与Hep3B细胞系。（2）缺氧微环境下,过表达HIF-1α促进肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力,抑制细胞凋亡;过表达RACGAP1促进肝癌细胞的增殖,抑制细胞凋亡。（3）HIF-1α表达与RACGAP1表达呈正相关,并影响肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力及细胞凋亡的能力;RACGAP1与HIF-1α对肝癌细胞增殖、迁移/侵袭以及凋亡的调控存在协同作用。
张范[3]（2020）在《胃部SIDT1介导外源性microRNA吸收的机制》文中研究说明2012年,张琳等人发现,哺乳动物的血清和组织中都存在外源性植物mi RNA,进一步,外源性植物mi R168a可以与人或小鼠的低密度脂蛋白受体衔接因子蛋白1（LDLRAP1）m RNA结合,抑制肝脏中LDLRAP1的表达,从而调节血中LDL胆固醇的含量。越来越多的研究表明,食物中完整的植物mi RNA可以通过哺乳动物的消化系统吸收并跨界调控哺乳动物的基因表达。但食物中的mi RNA如何完整地通过哺乳动物胃肠道（GI）被吸收从而进入循环系统以及全身其他组织的机制仍然不清楚。在秀丽隐杆线虫中,系统性RNA干扰缺陷蛋白1（Systemic RNA Interference Deficiency,SID-1）具有将细胞外双链RNA（ds RNA）转运到细胞内的功能。研究表明,SID-1可能具有11个跨膜结构域,并以多聚体形式发挥作用。SID-1可转运不同长度的ds RNA和具有部分双链RNA结构的分子（例如mi RNA前体和hairpin RNA）。SID-1跨膜家族成员1（SIDT1）,作为哺乳动物中线虫SID-1的同源蛋白,也定位于细胞膜并介导细胞间mi RNA的转运以及细胞外小干扰RNA（si RNA）的吸收。基于以上发现,我们提出假设:SIDT1介导了哺乳动物对外源性mi RNA的吸收。在本研究中,我们对SIDT1基因敲除小鼠进行了研究。在SIDT1敲除小鼠上,高通量测序和定量PCR实验结果显示其体内植物mi RNA本底水平显着降低,并且其对食物中的植物mi RNA动态吸收能力也显着低于野生型小鼠。表明小鼠对食物中的或口服外源性mi RNA的吸收是SIDT1依赖的,即SIDT1蛋白对于外源性mi R哺乳动物消化道的吸收是必要的。进一步,我们发现SIDT1蛋白主要表达在小鼠胃部,进一步实验结果显示SIDT1蛋白定位在胃黏膜顶细胞的细胞膜上。我们对小鼠进行了幽门结扎手术,发现该手术后,野生型小鼠对灌胃mi RNA的吸收和未结扎组吸收无显着差别,而SIDT1敲除小鼠无明显吸收。幽门结扎手术实验表明胃是小鼠对食物中mi RNA吸收的首要器官。在体外,我们培养了原代胃黏膜上皮细胞,并模拟了胃的酸性环境,发现酸性刺激显着增强胃黏膜上皮细胞对培养液中mi RNA分子的吸收,而SIDT1敲除小鼠来源的胃黏膜上皮细胞对培养液中mi RNA分子无明显吸收,酸性刺激也不能增加其对培养液中mi RNA分子的吸收。这提示了消化道中,胃部的高度酸性环境对于SIDT1依赖性的mi RNA吸收至关重要。我们进一步在细胞模型上,通过提取外泌体并分析其中的植物mi RNA含量,发现酸性条件下野生型小鼠来源的原代胃黏膜上皮细胞吸收的植物mi RNA可以通过外泌体包裹释放到培液中。体外构建的荧光素酶报告实验证明这些外泌体中的植物mi RNA还具有生物学功能。最后,通过生物信息学预测,我们发现mi R2911可能靶向人或小鼠的转化生长因子β1（TGF-β1）基因,在四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化小鼠模型上,TGF被认为是关键的分子。因此我们尝试了通过口服植物mi R2911下调TGF-β1基因来改善肝纤维化。经过4周的口服mi R2911治疗,在小鼠肝组织中植物mi R2911显着升高,肝组织中TGF-β1含量显着降低,病理学研究表明,肝纤维化的几个指标,包括羟脯氨酸,SMA Collegen-1以及天狼星红染色均显示肝纤维化显着改善。而在SIDT1敲除小鼠上,经过4周口服mi R2911后,在小鼠肝组织中植物mi R2911未见显着升高,且肝组织中TGF-β1含量未有明显降低,肝纤维化的几个病理学指标也无改善。通过静脉注射mi R2911绕开消化道吸收后,野生型小鼠和SIDT1敲除小鼠的肝组织中植物mi R2911显着升高,TGF-β1含量显着降低,病理学研究表明,肝纤维化的几个指标,包括羟脯氨酸,SMA Collegen-1以及天狼星红染色均显示肝纤维化显着改善。上述在体实验表明,SIDT1对于口服mi RNA的吸收是必要的。综上,我们的研究结果首次阐明了哺乳动物经消化道吸收外源性mi RNA的可能机制,即SIDT1蛋白介导了哺乳动物对外源性mi RNA的吸收;此外,我们发现了胃的新功能,胃直接吸收食物中的外源性mi RNA;低p H对SIDT1介导的外源micro RNA吸收具有促进作用,从生化角度解释了为什么哺乳动物能够完整的吸收利用外源的micro RNA;此外,口服micro RNA可经SIDT1介导吸收,为基于小RNA的药物开发提供了潜在方向。
张影[4]（2020）在《抗Cyclin D1胞内抗体对三阴性乳腺癌生长和转移的抑制作用及机制研究》文中指出乳腺癌是全球女性最常见的癌症类型,亦是我国女性发病率最高、引起癌症相关性死亡的主要病因。三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）是一种缺乏雌激素受体、孕激素受体和表皮生长因子受体2表达的特殊类型乳腺癌,具有高侵袭性、高转移性和显着耐药性等特点。TNBC发病率占乳腺癌总发病率的20%,死亡率占乳腺癌总死亡率的83%,与其他类型的乳腺癌相比,TNBC患者的愈后差、远期生存率低,目前TNBC尚无标准的治疗方案。因此开展三阴性乳腺癌的新型治疗策略及分子机制的研究具有重要的科学意义和临床应用价值。Cyclin D1是由CCND1基因编码的细胞周期蛋白,具有促进细胞增殖和基因转录等功能,可在多种癌症中呈高表达。现有研究表明,阻断Cyclin D1的治疗策略将有助于干扰多种癌症特异性信号通路达到癌症治疗的目的。但是Cyclin D1在三阴性乳腺癌中的表达及其与愈后的关系尚存在争议,且Cyclin D1在TNBC发生、发展中的作用机制尚未明确。因此,深入研究TNBC中Cyclin D1的表达以及靶向拮抗Cyclin D1的作用效能,对于进一步理解TNBC发生和发展的分子机制,改善TNBC的治疗效果具有重要意义。胞内抗体技术是在细胞内表达且作用于同一细胞内靶抗原的具有功能的抗体分子,通过阻断或调节靶蛋白的活性,在翻译后水平实现蛋白质的敲低,作为RNA干扰（RNAi）和小分子抑制剂等靶分子敲低技术的互补手段,在蛋白质功能的研究中发挥重要作用。越来越多的研究表明,可以通过对胞内抗体进行工程化修饰等手段,将抗体蛋白定位于细胞各区间内,从而在多种疾病（例如病毒感染、退行性疾病和肿瘤）中发挥诊断和治疗作用。本实验室前期工作中构建了内质网滞留型抗Cyclin D1胞内抗体（命名为ER-ADκ）,能够在ER阳性乳腺癌及肝癌细胞内结合并抑制Cyclin D1活性,有效抑制MCF-7、Hep G2等肿瘤细胞系增殖并诱导细胞凋亡的发生。但ER-ADκ能否在TNBC中发挥抑制肿瘤生长及转移的作用尚不清楚。因此,为了深入研究TNBC中Cyclin D1的致癌机制以及ER-ADκ能否作为改善TNBC患者愈后的有效治疗策略,本研究拟通过分析GEO数据库中TNBC患者m RNA转录组学数据,明确CCND1在TNBC组织中的转录水平及可能参与调控的信号通路,利用胞内抗体技术识别并结合TNBC细胞内Cyclin D1后,分别在细胞水平及裸鼠体内探究ER-ADκ的表达对三阴性乳腺癌生长、转移之间的关系及具体分子机制。主要研究结果如下:一、明确Cyclin D1在TNBC癌和癌旁组织中的表达特性。通过GEO数据库下载TNBC患者m RNA芯片数据并利用R语言进行生物学分析,研究结果表明,CCND1在TNBC组织中呈高表达,通过STRING网站行PPI网络构建、通过R语言行GO功能注释及KEGG富集通路分析发现,Cyclin D1在TNBC中参与调控细胞周期、细胞衰老、乳腺癌的发生以及在PI3K-AKT、Wnt等信号通路中发挥作用。乳腺癌组织芯片的免疫组织化学染色实验进一步证实:Cyclin D1在TNBC组织中的表达高于癌旁组织,预示Cyclin D1可能成为TNBC靶向治疗的分子靶点。二、证实抗Cyclin D1胞内抗体（ER-ADκ）能够有效抑制TNBC增殖和转移,促进TNBC凋亡。（1）在MDA-MB-231和BT-549两种TNBC细胞中转染ER-ADκ的质粒,进行Western blot、co-IP和间接免疫荧试验,结果表明,ER-ADκ在TNBC中成功表达并定位在细胞内质网;（2）流式细胞术分析结果表明:ER-ADκ能诱导MDA-MB-231细胞发生G1/S期细胞周期阻滞和细胞凋亡;（3）细胞划痕试验、Transwell小室等实验发现,ER-ADκ能抑制MDA-MB-231和BT-549细胞的迁移、侵袭和浸润能力。三、探究ER-ADκ抑制TNBC发生发展中的分子机制。结果表明:（1）TNBC细胞中,ER-ADκ抑制成视网膜细胞瘤抑癌蛋白（Retinoblastoma Protein,Rb）磷酸化水平,并上调抑制细胞周期相关因子p21（Cyclin inhibition protein 1）、p27（Kinase inhibition protein 1）的转录,进而抑制TNBC细胞周期进程;（2）ER-ADκ通过内质网应激途径,促进TNBC细胞发生凋亡;（3）ER-ADκ通过抑制β-catenin的核易位,下调TNBC细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）过程相关转录因子Slug、Snail的表达,抑制EMT相关蛋白N-钙黏着蛋白（N-cadherin）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）2、MMP9和MMP14的表达,并提高E-钙黏着蛋白（E-cadherin）的表达,从而抑制细胞上皮-间质转化,抑制TNBC的转移。四、ER-ADκ抑制TNBC生长及转移的体内效应及相关机制分析。结果表明:（1）通过裸鼠异种移植瘤实验发现,ER-ADκ可以在体内显着降低MBA-MB-231细胞的瘤重及瘤体积,有效抑制MDA-MB-231细胞的体内生长;ER-ADκ通过激活内质网应激的方式在体内诱导细胞凋亡的发生。（2）通过裸鼠异种移植瘤实验和尾静脉注射肺转移模型发现,ER-ADκ能够在体内有效抑制三阴性乳腺癌细胞肺转移的能力;ER-ADκ促进E-cadherin表达、抑制β-catenin表达降低癌细胞肺转移的能力。通过以上研究,我们发现Cyclin D1在TNBC组织中呈高表达,并对TNBC细胞增殖、凋亡、迁移及浸润等过程起着重要的作用。通过在MDA-MB-231和BT-549两种三阴性乳腺癌细胞系内表达抗Cyclin D1的胞内抗体ER-ADκ,能够在细胞内识别并结合Cyclin D1,抑制三阴性乳腺癌细胞在体内和体外的增殖及转移能力,其分子机制可能是通过ER-ADκ结合并抑制Cyclin D1活性,下调Rb磷酸化水平,诱导内质网应激介导细胞凋亡的发生,并减少β-catenin的核累积,进而使EMT过程受阻,从而抑制TNBC生长和转移。综上,本研究首次通过胞内抗体技术实现敲低TNBC中的Cyclin D1,发现抗Cyclin D1胞内抗体能够显着抑制TNBC细胞的生长和转移,并探讨了相应的机制,为Cyclin D1作为三阴性乳腺癌治疗靶点提供了实验依据,并为胞内抗体作为新型抗肿瘤药物的研发奠定基础。
杜金童[5]（2020）在《CDK1在胰腺癌中的生物学功能、临床意义及相关抑制剂研究》文中研究指明研究背景胰腺癌是恶性程度极高的消化道肿瘤之一,其总体5年生存率不足8%。近年来,随着研究的深入,越来越多的治疗方案被不断提出,但胰腺癌患者的预后并未得到明显的改善。目前,传统的化疗药物对胰腺癌患者疗效有限,胰腺癌的靶向治疗也一直举步维艰。2005年FDA批准了“吉西他滨+厄洛替尼”用于局部晚期不可切除或有远处转移的胰腺癌患者的治疗,然而仅约10天的生存期提高使得厄洛替尼在胰腺癌治疗中难以取得较大的临床获益。2019年12月,FDA批准了 PARP抑制剂奥拉帕利用于携带BRCA基因突变的转移性胰腺癌患者的维持治疗,然而携带有BRCA基因突变的转移性胰腺癌患者人群数量有限。因此,有必要继续探索新的抗胰腺癌靶点,为未来胰腺癌的临床治疗研究提供一定的基础。细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinases,CDKs）在细胞周期的调控中处于核心地位。目前,在人体中已发现的CDKs包含20个亚型,其中CDK1～6和CDK14～18直接参与细胞周期调控,其它CDKs则主要调控基因转录。已有研究证实,CDKs的异常激活可导致细胞周期进程的失调,从而导致肿瘤细胞异常增殖。近年来,已有多个CDK4/6的选择性小分子抑制剂被FDA批准上市,用于晚期或转移性乳腺癌患者。有研究发现了 CDKs在胰腺癌的发生和发展中具有重要作用。CDK5在胰腺腺癌中过度表达,可促进胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。KRAS突变可刺激CDK8的表达,通过Wnt/β-catenin信号通路促进胰腺癌细胞的侵袭和迁移。在众多的CDKs中,CDK1则具有不可替代的位置。在正常生理条件下,CDK1与Cyclin A或Cyclin B形成复合物,调控细胞周期G2/M,而CDK1异常激活则与肿瘤的发生发展密切相关。CDK1在结直肠癌、肝癌和肺癌等多种肿瘤中过表达,并且与患者的不良预后有关。CDK1选择性抑制剂RO3306对白血病、乳腺癌等多种肿瘤细胞具有良好的抗增殖活性。然而CDK1在胰腺癌中的研究仍然较少。有研究发现,磷酸酶CDC25B的抑制剂可抑制胰腺癌细胞生长,并观察到CDK1磷酸化水平增高以及细胞G2/M期阻滞。CDK1在胰腺癌患者组织中高表达,且与患者较差的预后有关。目前仍未有研究阐明抑制CDK1对胰腺癌生长的影响,CDK1在胰腺癌中的生物学功能与临床意义有待进一步探索。此外,尽管已有研究发现CDKs泛抑制剂具有良好的抗胰腺癌活性,然而靶向CDK1的选择性抑制剂RO3306在胰腺癌中的抗肿瘤活性及作用机制尚未见报道。因此,仍需进一步研究CDK1成为抗胰腺癌靶点的潜力,探索新的抗胰腺癌策略。另一方面,细胞凋亡的异常调控也是胰腺癌发生发展的重要原因。有研究表明,抗凋亡蛋白Mcl-1在胰腺癌中异常表达,抑制Mcl-1可抑制胰腺癌的生长。对Mcl-1蛋白及内源性细胞凋亡通路的调控是CDKs抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡的重要机制。因此,可通过研究CDK1抑制剂RO3306对Mcl-1蛋白的影响,进而分析其作用机制。另外,多项研究表明,Mcl-1小分子抑制剂具有较好的抗胰腺癌活性。因此,进一步筛选新型Mcl-1抑制剂有助于将来探索新的抗胰腺癌策略。研究目的本课题旨在研究CDK1作为新型抗胰腺癌靶点的潜力,探索新的抗胰腺癌策略,为将来胰腺癌的临床转化研究提供一定的基础。首先,研究CDK1在胰腺癌中的生物学功能;其次,研究CDK1在胰腺癌患者中的表达及临床意义;再次,进一步对已知的CDK1抑制剂RO3306进行抗胰腺癌活性研究,通过研究RO3306对Mcl-1等相关蛋白的影响以探索其作用机制;最后,筛选新型CDK1抑制剂和Mcl-1抑制剂,并对其进行靶点抑制活性及抗胰腺癌活性研究。研究方法和结果第一部分敲减CDK1对胰腺癌体内外生长的影响1、首先,通过生物信息学分析、基因敲减和细胞增殖实验,发现敲减CDK1能够在体外显着抑制胰腺癌细胞的增殖。（1）基于TCGA数据中170余例胰腺癌患者的mRNA表达谱数据,通过生物学信息学GEPIA平台分析了CDK1-CDK10在胰腺癌组织和正常组织中的表达情况,发现CDK1、CDK2和CDK6在胰腺癌患者组织中高表达（p<0.01）,且其高表达与患者差的生存期相关（p<0.05）。（2）通过Celigo细胞增殖实验,分别研究了敲减CDK1、CDK2和CDK6对Panc-1胰腺癌细胞增殖的影响,发现敲减CDK1对Panc-1细胞增殖的抑制效果最为明显（p<0.005）。2、进一步研究了敲减CDK1对胰腺癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及细胞迁移的作用。通过MTT细胞增殖实验,发现了敲减CDK1可抑制胰腺癌细胞（Panc-1和Aspc-1）的增殖（p<0.05）。使用流式细胞仪进行细胞周期和细胞凋亡实验,结果表明,敲减CDK1可将胰腺癌细胞（Panc-1和Aspc-1）阻滞在G2/M期（p<0.05）,但对细胞凋亡无明显影响（p>0.05）。通过Transwell实验表明,敲减CDK1能够抑制Panc-1细胞迁移（p<0.05）,而对Aspc-1细胞的迁移没有影响（p>0.05）。3、使用肿瘤异种移植模型研究了敲减CDK1对裸鼠胰腺癌体内生长的影响,结果表明,与对照组相比,敲减CDK1的瘤体生长速度及重量均低于对照组（p<0.05）。第二部分CDK1在胰腺癌患者中的表达与临床意义1、首先,通过免疫组化方法检测了 CDK1在90例胰腺癌术后患者的胰腺癌组织及对应的60例癌旁组织中的表达。结果显示,在44例有配对癌旁组织的患者中,CDK1在胰腺癌患者中高表达,其细胞浆表达高于细胞核表达（p<0.05）。2、进一步分析了 73例胰腺癌患者中CDK1的表达与临床病理特点的关系。结果示,CDK1在细胞浆中的表达与组织学分级、p53和Ki67表达有关（p<0.05）;CDK1在细胞核中的表达与p53表达有关（p<0.05）。3、最后,分析了 CDK1的表达与73例胰腺癌患者预后的关系。Kaplan-Meier曲线法及单因素分析表明,CDK1细胞浆高表达的患者具有更短的总生存期（p<0.05）。COX多因素分析表明组织学分级和N分期是总生存期的独立预后因子（p<0.05）,而CDK1不是总生存期的独立预后因子（p>0.05）。CDK1细胞核表达与胰腺癌患者的总生存期无关（p>0.05）。第三部分CDK1抑制剂RO3306的抗胰腺癌活性及作用机制研究1、首先,研究了 RO3306在胰腺癌细胞中的抗增殖活性。(1通过Western-blot实验,检测了 CDK1在五种胰腺癌细胞系中的表达,发现了 CDK1在SW1990细胞系中表达量最高。（2）通过SRB细胞增殖实验,发现了 RO3306能够抑制五种胰腺癌细胞的增殖,且其对SW1990细胞的抗增殖效果最佳（IC50=2.9 μM）,优于化疗药物5-Fu（IC50=4.9 μM）。2、进一步研究了 RO3306抗胰腺癌的作用机制。（1）使用流式细胞仪检测了 RO3306对SW1990细胞周期的影响,结果发现,RO3306能够将细胞周期阻滞在G2/M和S期（p<0.05）。通过Western-blot实验表明,RO3306可能是通过激活p53-p21信号通路实现对细胞周期S期的阻滞。（2）使用流式细胞仪检测了RO3306对SW1990细胞凋亡的影响,结果发现,RO3306能够诱导SW1990细胞凋亡（p<0.005）。通过Western-blot实验表明,RO3306可能通过影响Bcl-2-Bax信号通路以及调控Mcl-1蛋白的磷酸化水平,进而诱导胰腺癌细胞凋亡。3、最后,通过SRB抗增殖实验研究了 RO3306与四种化疗药物（5-Fu、吉西他滨、紫杉醇或奥沙利铂）的联合用药效果,结果表明RO3306能够增强5-Fu和紫杉醇对胰腺癌细胞SW1990的抗增殖活性。第四部分新型CDK1抑制剂及Mcl-1抑制剂的研究1、通过计算机虚拟筛选平台进行了 CDK1抑制剂以及Mcl-1抑制剂的筛选。综合运用三维药效团和分子对接技术,分别构建了针对CDK1小分子抑制剂和Mcl-1小分子抑制剂的虚拟筛选平台,对商业化合物库中21万个分子进行了虚拟筛选。通过对筛选到的命中化合物进行活性测试,发现了初步具有CDK1抑制活性的化合物,以及与阳性药Gossypol活性相当的Mcl-1抑制剂M02（Ki=5.4μM）和 M08（Ki=0.53μM）。2、进一步研究了新型Mcl-1抑制剂M02和M08的抗胰腺癌活性。Western-blot实验表明,Mcl-1蛋白在五种胰腺癌细胞中均有表达,在SW1990细胞中表达最高。SRB实验表明,M02和M08在胰腺腺癌细胞SW1990中具有一定的抗增殖活性（IC 50=44.4-48.4μM）。细胞周期和细胞凋亡实验表明,M02和M08不仅能够诱导SW1990细胞凋亡（p<0.005）,而且可将细胞周期阻滞在G2/M期（p<0.05）。进一步的联合用药实验表明,M08能够提高吉西他滨或5-Fu对胰腺癌细胞的抗增殖活性,而M02对吉西他滨或5-Fu的抗增殖活性影响较小。研究结论1、敲减CDK1对胰腺癌细胞具有抗增殖活性,可将胰腺癌细胞阻滞在G2/M期,并且在小鼠肿瘤异种移植模型中具有较好的肿瘤生长抑制效果,表明CDK1有望成为新型抗胰腺癌靶点。2、CDK1在胰腺癌患者中高表达,其细胞浆表达高于细胞核表达。细胞浆表达与肿瘤级别、p53表达和Ki67表达等临床病理特征有关,细胞核表达与p53的表达有关。细胞浆高表达CDK1的患者具有更短的总生存期。提示CDK1可作为胰腺癌潜在的生物学标志物。3、CDK1抑制剂RO3306在多种胰腺癌细胞系中均具有抗增殖活性。RO3306对胰腺癌细胞周期阻滞的作用与p53-p21信号通路有关。RO3306还可通过影响Bcl-2-Bax信号通路以及下调Mcl-1蛋白的磷酸化水平,进而诱导胰腺癌细胞凋亡。此外,RO3306能够增强5-Fu或紫杉醇对胰腺癌细胞的抗增殖活性。4、发现了新型具有CDK1抑制活性的化合物,以及与阳性药活性相当的Mcl-1新型抑制剂M02和M08。特别是,M02和M08具有抗胰腺癌活性,且M08可增强吉西他滨或5-Fu对胰腺癌细胞的抗增殖活性。
张聪[6]（2020）在《组学方法筛选抗高致病性禽流感病毒老药新用及新冠肺炎患者免疫反应与肺损伤研究》文中指出流感病毒是一种严重威胁人类健康的病毒,能够导致季节性流感以及爆发性的流感大流行。高致病性禽流感病毒（HPAI,highlypathogenic avian influenza）通常只在鸟类之间传播,但偶尔也感染人类并导致非常严重的呼吸系统疾病,如急性肺损伤（ALI,acute lung injury）。根据世界卫生组织的统计,截至2018年底,共确诊860名H5N1感染者,死亡率高达52.79%。面对HPAI的威胁,以及有限的药物及治疗方法,我们重点研究了 HPAI的致病机制及潜在治疗药物。老药新用是一种开发药物的经济的方法。为了研究改善HPAI H5N1诱导的ALI的有效药物,我们基于全基因组RNAi和高通量转录组测序探索了老药新用的筛选策略。首先,我们在A549肺上皮细胞中对19,424个基因进行了 RNAi筛选,检测了基因敲减对H5N1感染导致的细胞死亡的影响。我们共筛选出1,137个敲减后细胞活力显着变化大于20%的宿主基因,并将这些宿主基因与DrugBank数据库药物靶点进行比对。我们检测了其中104种市售药物（靶向65个药物靶基因）对H5N1感染后细胞活力的改善作用,发现28种药物可显着提高A549细胞感染H5N1后的细胞活力。在H5N1诱导的小鼠ALI模型中,我们测试了其中几种药物的药效。抗癌药夫拉平度显着降低了 H5N1感染小鼠肺组织中的白细胞浸润和肺损伤评分,改善了感染小鼠肺组织水肿,并提高了感染H5N1的小鼠的存活率。这些结果表明除了已证实的适应症外,夫拉平度也是应对潜在的H5N1流行病的新疗法。除此之外,我们还用基于高通量转录组测序的老药新用方法,确定了几种可用作治疗H5N1感染的潜在药物。通过使用高通量转录组测序,我们鉴定出H5N1病毒感染后在A549细胞中显着变化的1,233种功能差异表达基因。在这些候选基因中,有79个药物靶点（对应于59种已批准的药物）与DrugBank靶点数据库重叠。我们检测了 41种批准上市的小分子药物,22种药物显着降低了 H5N1感染介导的A549细胞死亡。在H5N1感染小鼠模型中,我们测试了 15种在感染前和感染后给药都能保护A549细胞死亡的药物。结果显示,阿米替林盐酸（抗抑郁药）,黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD;维生素B2缺乏症的眼科药）,阿扎胞苷（抗肿瘤药）和骨化三醇（维生素D的活性形式）可显着减轻ALI。所有四种药物在肺组织病理上,均显着降低了小鼠感染H5N1病毒后的浸润细胞数及肺损伤评分,改善了小鼠肺水肿,并显着提高了 H5N1病毒感染后的小鼠存活率。我们的研究不仅发现了针对H5N1流感病毒引起的肺损伤的新型潜在疗法,而且还提供了高效且经济的老药新用筛选方法以广泛用于预防和治疗其他疾病。最近爆发了一场新型冠状病毒（2019-nCoV,也称为SARS-CoV-2）引起的肺炎,它从中国武汉开始并迅速传播到全球200多个国家或地区。2020年3月11日,世界卫生组织宣布它为一种新的全球大流行病毒。本文中,我们介绍了深圳三院12位患者的血浆细胞因子表达谱及血管紧张素Ⅱ表达情况。与健康个体相比,在检测的48种细胞因子中,新冠肺炎重症患者血浆有38种显着升高。十七种细胞因子水平与SARS-CoV-2病毒载量相关。IL-1α、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-17、IP-10、HGF、IL-1ra、M-CSF、G-CSF、IFN-α2、IFN-γ和PDGF-BB十五种细胞因子水平与肺损伤Murray评分密切相关,并且接受者操作特征曲线的曲线下面积表明,可以根据这些因子预测新冠肺炎的疾病严重程度。此外,新冠肺炎患者血浆血管紧张素Ⅱ水平显着升高,并且与病毒滴度和肺损伤程度线性相关。我们的结果表明了 SARS-CoV-2感染可引发多种细胞因子及血管紧张素Ⅱ的广泛变化,其中一些可能是SARS-CoV-2感染疾病严重程度的潜在生物标志物。这些发现促进了我们对这种正在发生且仍在发展中的疾病的免疫病理机制的理解。同时,我们的结果提示,细胞因子的调节剂和血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂药物可能在抵抗疾病中发挥治疗作用。
程英[7]（2020）在《MicroRNA-222介导PI3K/Akt/MMP-9信号通路参与调控HMGA1对葡萄膜黑色素瘤生物学功能的影响》文中研究表明研究背景葡萄膜黑色素瘤（uvealmelanoma,UM）好发于眼球后极部,是成年人眼内最常见的原发性恶性肿瘤。UM极易发生血行转移,大约50%的UM患者在首次就诊时被检查发现远处转移病灶,近一半转移性UM患者的肝脏均有不同程度受累。UM一旦发生转移,患者死亡率极高,据临床研究数据统计发现,转移性UM患者的中位生存期仅为5-8个月。UM传统治疗方法为眼球摘除术,但是由于该方法创伤大,导致患者日常生活质量受到严重的影响。近年来,逐渐出现了多种保留眼球的新型治疗策略,包括局部肿瘤切除术、局部放射治疗和激光光凝等。尽管这些新兴的治疗手段保留了UM患者眼球、维持了患者部分视功能,但是流行病学统计发现,近年来UM患者总生存率并未能得到有效的改善。近年来,特异性分子靶点在多种人类恶性肿瘤中的潜在应用前景逐渐引起学者们的关注,主要包括肿瘤早期诊断、临床治疗及预后评估等方面,分子生物靶点可能作为一种新型且疗效显着的肿瘤临床治疗新模式。研究发现,高迁移率族蛋白家族分子是调控肿瘤恶性表型的重要蛋白家族,其中高迁移率族蛋白A1（high-mobility group A,HMGA1）能够启动多个肿瘤发生并促进肿瘤进展,HMGA1的作用机制涉及与非编码RNA、信号通路之间的关系。HMGA1在人类正常或高分化的肿瘤组织内呈低表达甚至缺如,而在低分化肿瘤中常为高表达。由此推测,干预HMGA1表达即有可抑制UM肿瘤细胞生长、转移、侵袭等细胞生物学功能,而且这种干预对宿主正常细胞的影响较小,从而有效提高抗肿瘤效应对人体的安全性。课题组前期研究发现,HMGA1在UM患者肿瘤组织中呈高表达,并且与UM肿瘤远处转移率升高和UM患者中位生存期缩短呈正向相关。故阻断HMGA1相应的信号通路,即有可能阻断HMGA1所控制的相应肿瘤活动。MicroRNA（miRNA）又称为微小RNA,是一类具有调控功能的非编码RNA。近年来,miRNAs的调控机制逐渐成为抗肿瘤及抗肿瘤远处转移的研究热点。已有多项研究报道了 miR-222在不同类型恶性肿瘤中的异常表达,例如肺癌、宫颈癌及肾透明细胞癌等,但是miR-222与HMGA1在UM肿瘤中的作用机制目前尚未有相关文献报道。故本课题拟从HMGA1对UM细胞的调控机制和miR-222与HMGA1在UM中的作用机制入手,探讨HMGA1与miR-222对UM细胞增殖和迁移等重要生物学功能的调控机制,为临床治疗提供数据及潜在的分子治疗靶点。已有研究证实,PI3K/Akt/MMP-9是HMGA1的下游信号通路。其中,基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）可通过降解肿瘤细胞外基质（extracellular matrix,ECM）,使肿瘤细胞摆脱ECM的束缚而产生浸润和转移。若能实现靶向下调PI3K/Akt/MMP-9通路或其上游的HMGA1,抑制肿瘤组织中MMP-9过表达所诱导的肿瘤细胞浸润效应,阻断其下游迁移和侵袭信号可能是最有希望取得良好抗肿瘤及抗肿瘤转移疗效的策略。目前尚未有文献报道过,在UM中HMGA1与miR-222对肿瘤细胞的调控机制。故我们拟从HMGA1与miR-222在UM中的相互作用关系,及其是否通过PI3K/Akt/MMP-9通路实现对UM细胞的生物功能调控等方面来验证,为临床早期诊断、临床治疗及患者预后评估提供真实有效的实验数据及潜在的生物靶点。第一部分HMGA1在葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达目的:HMGA1属于高迁移率族蛋白家族,是调控肿瘤恶性表型的重要蛋白,可以启动人类多种恶性肿瘤的发生并促进肿瘤进展。HMGA1的主要作用机制为参与下游基因及信号通路的调控,对肿瘤发生进展中的肿瘤血管新生、细胞增殖、凋亡异常、微环境改变、炎症反应及远处转移等一系列病理过程均有调节作用。设想若能人为阻断HMGA1对应的相关信号通路,即有希望阻断HMGA1所控制的相应肿瘤活动。课题组前期通过分析89例UM患者肿瘤组织中的HMGA1表达,发现HMGA1在UM组织中呈现过表达状态,且与UM远处转移的发生率及患者中位生存期缩短相关。课题的第一部分旨在检测UM细胞C918和MUM-2B中HMGA1的表达情况,为探究HMGA1在UM中的调控机制奠定基础。方法:收集UM细胞C918和MUM-2B,实时荧光定量PCR反应（quantitative realtime polymerase chain reaction,RT-PCR）检测细胞样本中 HMGA1 表达。结果:相比于正常对照组细胞,HMGA1表达在C918及MUM-2B细胞中显着升高（P<0.05）。结论:HMGA1表达在UM细胞C918和MUM-2B中升高明显,提示HMGA1可能在UM进展过程中发挥着重要作用。第二部分葡萄膜黑色素瘤中HMGA1对PI3K/Akt/MMP-9通路的调控作用目的:在第一部分研究结果中,我们发现了 UM细胞及组织中存在着HMGA1的过表达现象,且HMGA1的过表达状态与UM肿瘤细胞高转移率及患者中位生存期缩短相关。然而,HMGA1在UM中的调控机制如何?目前尚未解决。在本部分内容中,我们旨在研究分析HMGA1对UM细胞功能调控的具体作用机制;验证HMGA1作为上游分子信号,对下游通路PI3K/Akt/MMP-9的调控作用。方法:利用慢病毒包装的lentivirus（LV）-HMGA1-RNAi下调C918与MUM-2B两种人UM细胞的HMGA1基因表达。细胞转染后48h,荧光显微镜下观察增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）标记的UM细胞数量,评估转染效率,有荧光标记的细胞表示病毒已经转入细胞并成功表达。更换新鲜细胞培养液,加入嘌呤霉素进行两周左右的细胞筛选,从而得到慢病毒成功转染的UM细胞C918和MUM-2B。提取UM细胞总RNA及总蛋白质,采用RT-PCR及Western blot技术检测LV-HMGA1转染组及LV-NC组中HMGA1及PI3K/Akt/MMP-9通路信号的表达差异。结果:荧光显微镜检测结果显示,C918细胞的病毒转染率达90%以上,MUM-2B转染率为80%左右。慢病毒转染72h后,提取细胞总RNA及总蛋白,RT-PCR结果显示在C918与MUM-2B细胞中,与NC组相比,HMGA1及MMP-9表达水平在LV-HMGA1转染组中明显下调（P<0.05）;Western blot结果显示,在C918与MUM-2B细胞中,HMGA1、p-PI3K、p-Akt与MMP-9的表达在LV-HMGA1转染组中显着下降,与 RT-PCR结果一致（P<0.05）。结论:HMGA1过表达状态是UM肿瘤进展的高危因素。通过应用慢病毒下调HMGA1表达后,RT-PCR及Western blot结果均显示,HMGA1表达的抑制可有效下调PI3K/Akt/MMP-9通路信号,从而达到抑制UM肿瘤生长的目的。由此可见,HMGA1可能通过调控PI3K/Akt/MMP-9通路,参与了 UM细胞增殖、迁移及侵袭等恶性表型,揭示HMGA1表达调控机制可为有效抑制UM病程进展和远处转移提供新的临床诊疗思路。第三部分MicroRNA-222对葡萄膜黑色素瘤细胞生物学功能的影响目的:探讨MicroRNA-222（miR-222）表达水平改变对UM细胞活性、凋亡及迁移等细胞生物学功能的影响。方法:成功构建 miR-222-3pmimics,miR-222-3p inhibitor和其分别对应的 miRNA-222-3p negative control（miRNA-222-3p NC）,与 EndoFectinrM Max 转染试剂混合后分别转入C918与MUM-2B两种UM细胞中,改变细胞内miRNA-222-3p的表达水平,从而观察分析UM细胞增殖活性（CCK-8实验）、迁移能力（Transwell小室和细胞划痕实验）及凋亡状态（Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒）。通过以上实验,综合分析miR-222对UM细胞的调控作用。结果:将miR-222-3p mimics,miR-222-3p inhibitor和其对应的NC组分别利用转染试剂转入C918与MUM-2B细胞后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测UM细胞中miR-222-3p表达水平变化,以评估转染效果。RT-PCR结果显示,通过miR-222 mimics或miR-222 inhibitor转染UM细胞,miR-222表达水平在C918与MUM-2B细胞中出现显着的上调或下调,提示表达干扰效果较好（P<0.05）。通过分析CCK-8结果发现,miR-222 mimics能够显着提高UM细胞的增殖活力,相反,在miR-222 inhibitor转染组中,C918与MUM-2B细胞的增殖能力受到了明显抑制（P<0.05）。Annexin V-FITC凋亡检测结果显示,C918与MUM-2B细胞在miR-222-3pmimics转染组中,Annexin V阳性染色细胞较少;而在miR-222 inhibitor转染组中,Annexin V阳性染色细胞数量显着增多（P<0.05）。分析细胞划痕与Transwell实验结果后均提示,miR-222 mimics转染组中的UM细胞迁移能力较miR-222 inhibitor转染组中的细胞明显增强（P<0.05）。综上所述,miR-222在UM细胞中发挥着促进肿瘤细胞增殖和迁移的作用。结论:MiR-222对UM细胞C918与MUM-2B有着促进细胞增殖和迁移、抑制细胞凋亡的作用,可见在UM中miR-222发挥着癌基因的效应。第四部分葡萄膜黑色素瘤中HMGA1靶向miR-222对PI3K/Akt/MMP-9通路调控的机制研究目的:在第三部分研究内容中,我们发现了 miR-222对两种UM细胞C918与MUM-2B有着抑制细胞凋亡、促进细胞增殖及迁移的能力,可见miR-222发挥着促进UM肿瘤生长及进展的作用。在这一部分研究中,我们将深入分析UM肿瘤中miR-222与HMGA1的作用关系,及miR-222对下游PI3K/Akt/MMP-9通路的调控作用。方法:利用慢病毒LV-HMGA1-RNAi下调C918与MUM-2B细胞中HMGA1表达后,RT-PCR检测HMGA1表达下调组和LV-NC组中miR-222表达水平改变。构建miR-222-3p mimics,miR-222-3p inhibitor 和其对应的 miR-222-3p NC,在转染试剂的辅助下进入C918与MUM-2B细胞中,上调或下调UM细胞内miR-222-3p表达水平;转染48h后,Western blot检测不同转染组中PI3K/Akt/MMP-9通路信号表达情况;并利用生物学网站进行miR-222与HMGA1的作用靶点预测。结果:通过RT-PCR检测C918与MUM-2B细胞中miR-222水平,结果发现在HMGA1表达下调组中,C918与MUM-2B细胞中miR-222表达水平显着降低（P<0.05）。在miR-222-3p mimics 转染组中,Western blot 检测发现,C918 与 MUM-2B 细胞中的 p-PI3K,p-Akt与MMP-9蛋白表达均显着上调;相反,在miR-222-3p inhibitor转染组中,p-PI3K,p-Akt与MMP-9蛋白表达下降（P<0.05）,但PI3K与Akt总蛋白水平在miR-222-3p mimics和inhibitor组中并无明显差异。我们推测,出现此结果的原因可能为磷酸化的PI3K与Akt（即p-PI3K,p-Akt）分别是PI3K与Akt的活化形式,所以p-PI3K和p-Akt的表达水平在不同转染组中发生了明显变化,而总PI3K与总Akt蛋白表达则较为稳定。结论:在UM肿瘤中,HMGA1与miR-222之间可能存在着作用靶点;miR-222发挥着促进UM肿瘤细胞增殖、迁移等作用,且miR-222对UM细胞的调控作用可能是通过PI3K/Akt/MMP-9通路介导的。第五部分HMGA1对葡萄膜黑色素瘤细胞生物学行为影响的裸鼠体内研究目的:通过慢病毒LV-HMGA1-RNAi构建HMGA1表达稳定下调的C918细胞,并使C918细胞悬液通过皮下注射方式进入裸鼠体内成瘤,观察HMGA1对UM肿瘤生物学行为影响;通过分子蛋白水平检测分析动物瘤体组织中HMGA1表达对PI3K/Akt/MMP-9通路的调控作用。方法:将成功构建的HMGA1表达稳定下调的C918细胞皮下注射入裸鼠体内成瘤后,观察HMGA1表达下调组和NC组中裸鼠体内UM肿瘤形成过程。注射后一周后,每两天记录裸鼠体重和瘤体体积。28天时处死裸鼠,测量瘤体重量和体积;收集部分瘤体组织提取总蛋白质,行Western blot检测HMGA1表达及PI3K/Akt/MMP-9信号通路表达水平在不同实验动物组的差异;另保留部分瘤体组织行免疫组织化学法（immunohistochemistry,IHC）分析 HMGA1 表达。结果:裸鼠皮下成瘤实验证实,HMGA1表达下调组的裸鼠瘤体体积和重量显着小于NC组裸鼠,且其生长速度减缓（P<0.05）。保留部分瘤体组织,采用Western blot及IHC实验检测HMGA1和PI3K/Akt/MMP-9表达。结果显示,HMGA1表达水平在慢病毒LV-HMGA1-RNAi转染组中明显降低,证实了 HMGA1表达下调的C918裸鼠成瘤模型构建成功;与NC组相比,PI3K,p-PI3K,p-Akt及MMP-9表达水平在慢病毒转染组中均显着下降（P<0.05）。结论:裸鼠体内实验证实,HMGA1发挥着促进UM肿瘤生长的作用。当利用慢病毒下调C918细胞中HMGA1表达时,肿瘤生长受到明显抑制。通过分子生物学分析,我们证实了 HMGA1是通过PI3K/Akt/MMP-9通路发挥了在裸鼠体内调节UM细胞增殖的效应。全文结论HMGA1是UM发生及进展过程中的重要致癌基因,其在肿瘤组织中的过表达状态与UM细胞增殖、迁移、转移等生物学功能密切相关,揭示HMGA1表达及相关调控机制可为UM的临床治疗提供新的诊疗思路和分子靶点。本课题利用慢病毒LV-HMGA1-RNAi分别转染两种不同的UM细胞C918和MUM-2B,构建HMGA1表达稳定下调的UM细胞模型,我们发现HMGA1对UM肿瘤细胞增殖和转移的促进作用可能是通过激活P13K/Akt/MMP-9通路而完成的。MiR-222在人类多种恶性肿瘤中均存在着表达异常;已知miR-222可通过与多个靶基因结合,搭建出一张高效且复杂的调控网络,影响肿瘤发生和转移行为。我们利用miR-222-3pmimics及miR-222-3p inhibitor分别转染C918和MUM-2B细胞,结果发现,在miR-222-3p mimics转染组中,C918和MUM-2B的细胞活性明显升高,凋亡程度降低且迁移能力增强;相反,在miR-222-3p inhibitor转染组中C918和MUM-2B的凋亡程度加重,细胞活性和迁移能力均被削弱。我们通过查询生物学网站miRTarBase进行分子靶点预测,数据库检索结果提示,miR-222与HMGA1之间存在着相互作用靶点。通过RT-PCR证实,HMGA1表达水平与miR-222 mimics呈正向调控关系,与miR-222 inhibitor呈反向调控关系。分别提取miR-222-3p mimics及miR-222-3p inhibitor转染组中UM细胞的总RNA 及总蛋白质,行 RT-PCR 和 Western blot 检测,分析 miR-222 对 PI3K/Akt/MMP-9通路信号水平的影响。结果发现,miR-222受到HMGA1基因直接调控,HMGA1通过促进miR-222表达,从而激活PI3K/Akt/MMP-9通路,发挥着对UM肿瘤细胞增殖和转移的调控作用。最后,我们在裸鼠体内进行了再次验证,发现HMGA1同样在活体内发挥着促进瘤体生长的作用,且此功能是通过PI3K/Akt/MMP-9通路参与完成的。综上所述,本课题提出,通过抑制HMGA1表达,靶向性阻断MMP-9上游的PI3K/Akt通路,从而阻止由MMP-9介导的UM细胞侵袭和迁移;HMGA1与miR-222 之间可能存在有相互的作用靶点,miR-222 可通过对 PI3K/Akt/MMP-9 通路进行活化而参与UM的进展过程。本课题通过对HMGA1在UM肿瘤中作用机制的深入研究,为UM肿瘤生物标志物和临床治疗靶点研究提供了可靠的基础数据和理论支持。
李小丽[8]（2020）在《诱导内质网应激下调LAR型三阴性乳腺癌中雄激素受体表达的作用及分子机制研究》文中进行了进一步梳理背景:乳腺癌（breast cancer,BC）是女性发病率最高的恶性肿瘤,每13分钟就有1人死于乳腺癌。因此乳腺癌已成为严重危害全球女性健康的重要疾病。其中三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是指不表达雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体（HER2）的乳腺癌,具有高异质性、高发病率、高侵袭性、较高抗药性及易复发转移等特点。因此在个体化治疗和特定靶向治疗的时代深入研究TNBC发生发展机制,寻找有效的治疗靶点和策略一直是该领域的研究热点。TNBC根据分子表型可分为4种亚型:腔面雄激素受体型、免疫调节型、基质样免疫抑制型和间充质干细胞样型。其中腔面雄激素受体型三阴性乳腺癌（LAR TNBC）以雄激素受体（androgen receptor,AR）信号通路活化为特征,AR在促进其发生发展中起至关重要的作用。因此针对LAR TNBC,靶向AR的治疗已成为近年来新的研究热点。AR是配体依赖性转录因子,与雄激素结合后进入细胞核,与特异的DNA部位即雄激素应答元件结合调控靶基因的转录表达。拮抗AR信号通路目前主要有两种策略:（1）雄激素剥夺治疗降低循环中雄激素水平;（2）使用AR拮抗剂直接阻断AR信号通路。这两种策略在早期治疗效果较好,但随着治疗时间的延长会逐渐表现出敏感性降低或反弹性快速增长,究其原因仍然与AR密切相关,主要表现为AR信号通路的异常活化:AR水平增加或敏感性增强、AR氨基酸突变、产生多种剪接变异体或AR通过配体非依赖的方式进行活化等,导致抗雄激素及抗AR治疗的抵抗。因此有研究明确提出第3种策略,直接减少AR,即通过促进AR降解或抑制其转录,以从源头靶向拮抗AR信号通路已成为一种新的治疗策略,目前相关药物正在进行临床前研究。因此寻找能直接减少AR表达的药物或途径具有重要意义。内质网是蛋白折叠和修饰的主要场所,未折叠或错误折叠蛋白在内质网聚集将引发内质网应激（ER stress）,从而激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）。内质网应激可通过UPR启动PKR-样内质网激酶（PKR-like ER kinase,PERK）、肌醇需求型1（inositol requiring 1,IRE1）和激活转录因子-6（activating transcription factor 6,ATF6）通路抑制未折叠蛋白的生成或加速错误折叠蛋白降解,以缓解内质网压力,恢复细胞稳态。但若细胞内存在强烈的或持续的内质网应激反应,将促使UPR过度抑制未折叠蛋白生成和过度降解错误折叠蛋白,反而最终造成细胞死亡。我们课题组前期研究发现内质网应激诱导剂可显着降低前列腺癌LNCaP和C4-2细胞中AR mRNA和蛋白表达。由于乳腺癌与前列腺癌具有广泛的相似性生物学表型,那么诱导内质网应激反应是否也能降低LAR TNBC中AR表达呢?诱导内质网应激反应是否可以用于LAR TNBC治疗呢?方法:一、内质网应激诱导剂对LAR TNBC细胞中AR表达的影响1.采用western blotting检测内质网应激诱导剂毒胡萝卜素（TG）、布雷非德菌素A（BFA）和衣霉素（TM）对MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR蛋白水平的影响;2.采用real-time PCR检测TG和BFA对MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR mRNA表达的影响;3.采用western blotting检测蛋白合成抑制剂放线菌酮对TG下调MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR蛋白水平的影响;采用real-time PCR检测mRNA合成抑制剂放线菌素D对TG下调MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR mRNA表达的影响。二、内质网应激诱导剂抑制LAR TNBC中AR表达的分子机制研究1.采用western blotting研究PERK抑制剂GSK2656157、IRE1抑制剂4μ8c和ATF6 siRNA对TG下调MDA-MB-453细胞中AR表达的影响;2.采用western blotting研究PERK siRNA、ATF4 siRNA和CHOP siRNA对TG下调MDA-MB-453细胞中AR表达的影响;采用慢病毒过表达ATF4研究高表达的ATF4对MDA-MB-453和CAL-148细胞活力、增殖能力以及AR表达的影响;3.采用ChIP-PCR和DNA测序技术鉴定AR启动子区域是否含有ATF4结合位点;采用双荧光素酶报告实验研究TG和过表达ATF4对AR启动子活性的影响;4.在体内建立过表达ATF4的CAL-148细胞原位移植瘤模型,观察高表达ATF4对肿瘤生长和AR表达的影响;5.采用TCGA数据库分析AR和ATF4在乳腺癌组织中的相关性;采用免疫荧光双染检测TNBC组织芯片中AR和ATF4的表达并分析两者的相关性。三、选择性PERK/eIF2α激活剂对LAR TNBC的作用及机制研究在此部分我们以选择性PERK/eIF2α激活剂CCT020312为研究对象,观察其对LAR TNBC的作用及作用机制。1.采用CCK-8、实时无标记细胞增殖和细胞克隆实验观察CCT020312对MDA-MB-453和CAL-148细胞活力和增殖的影响;2.采用western blotting检测CCT020312对MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP、mTOR、p-mTOR、AKT和p-AKT水平的影响;3.采用流式细胞术观察CCT020312对MDA-MB-453和CAL-148细胞周期和凋亡的影响;采用western blotting检测CCT020312对凋亡相关蛋白cleaved PARP、Bax和Bcl-2以及周期相关蛋白CDK4、CDK6和Cyclin D1水平的影响;采用RNAi敲低CHOP,再次观察CCT020312对凋亡的影响;4.在体内建立MDA-MB-453细胞原位移植瘤模型,观察CCT020312对肿瘤生长、AR、CDK4、CDK6、PERK/eIF2α通路和AKT/mTOR中关键分子表达的影响。结果:一、内质网应激诱导剂下调LAR TNBC细胞中AR表达1.在蛋白层面,3种内质网应激诱导剂TG、BFA和TM均能显着升高MDA-MB-453细胞中内质网应激反应标志分子Bip、CHOP、ATF4和XBP1s水平,显着降低AR的蛋白水平;2.在mRNA层面,TG和BFA也呈时间和剂量依赖性的显着降低MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR mRNA表达（P<0.05或P<0.01）;3.与单独的放线菌酮组比较,放线菌酮联合TG处理组并没有明显降低MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR蛋白水平;与单独的放线菌素D组比较,放线菌素D联合TG处理组也没有明显降低细胞中ARmRNA表达。以上结果表明,TG并不促进LAR TNBC细胞中AR蛋白和mRNA降解,提示内质网应激诱导剂是从转录水平抑制AR表达。二、内质网应激诱导剂通过PERK/eIF2α/ATF4通路抑制AR转录1.内质网应激信号通路IRE1、ATF6和PERK对TG下调AR表达的影响。（1）与单独的IRE1抑制剂4μ8c组比较,4μ8c联合TG处理组可显着降低MDA-MB-453细胞中AR水平;（2）与ATF6siRNA+DMSO组比较,ATF6 siRNA+TG处理组可显着降低MDA-MB-453细胞中AR水平;（3）与单独的PERK抑制剂GSK2656157组比较,GSK2656157联合TG处理组不能显着降低MDA-MB-453细胞中AR水平。以上结果表明,诱导内质网应激可能通过PERK通路而不是IRE1和ATF6通路下调AR表达。2.干扰或过表达PERK、ATF4和CHOP对TG下调AR表达的影响。（1）PERK siRNA可显着逆转TG引起的MDA-MB-453细胞中AR下调;（2）ATF4 siRNA也可显着逆转TG引起的MDA-MB-453细胞中AR下调;（3）CHOP siRNA对TG引起的MDA-MB-453细胞中AR下调无明显影响;（4）过表达ATF4可显着升高MDA-MB-453和CAL-148细胞中ATF4和CHOP表达,显着下调AR表达;过表达ATF4也可显着降低CAL-148细胞活力和增殖能力（P<0.05或P<0.01）。以上结果表明,诱导内质网应激通过PERK/eIF2α/ATF4通路下调AR表达。3.AR基因调控序列上含有ATF4结合位点,结合位点分别位于AR启动子区域的-2813-2486、-2084-1742、-1453-1254;TG可促进ATF4与AR启动子结合并显着降低AR启动子活性,过表达ATF4也可显着降低AR启动子活性（P<0.05或P<0.01）。以上结果初步表明,诱导内质网应激反应可负调控AR的转录。4.体内实验也进一步证实过表达ATF4可显着抑制CAL-148细胞原位移植瘤的生长（P<0.05）和下调AR水平。5.来自TCGA数据库中的结果表明ATF4与AR在乳腺癌组织中呈负相关（P<0.01）;人TNBC组织芯片结果表明ATF4与AR在三阴性乳腺癌组织中呈负相关,但由于样本量太少而无统计学差异。三、选择性PERK/eIF2α激活剂抑制LAR TNBC的作用及分子机制研究1.体外研究（1）选择性PERK/eIF2α激活剂CCT020312可显着抑制MDA-MB-453和CAL-148细胞增殖（P<0.05或P<0.01）。（2）CCT020312可显着诱导MDA-MB-453和CAL-148细胞凋亡（P<0.05或P<0.01）;显着升高cleaved PARP和促凋亡蛋白Bax水平以及明显降低抗凋亡蛋白Bcl-2水平;RNAi敲低CHOP可显着逆转CCT020312诱导的cleaved PARP和Bax水平升高。以上结果表明CCT020312可诱导LAR TNBC细胞凋亡。（3）CCT020312可显着诱导MDA-MB-453和CAL-148细胞G1期阻滞;显着抑制G1期关键蛋白CDK4、CDK6和CyclinD1水平。以上结果表明CCT020312可诱导LAR TNBC细胞G1期阻滞。（4）CCT020312可显着升高PERK、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP水平,明显降低AR、p-AKT和p-mTOR水平。2.体内研究（1）CCT020312可显着抑制MDA-MB-453细胞原位移植瘤的生长（P<0.05）,但对裸鼠体重无明显影响。（2）CCT020312可显着升高p-eIF2α、ATF4和CHOP水平;CCT020312可显着降低AR、CDK4、CDK6、p-mTOR和p-AKT水平。结论:1.诱导内质网应激可从转录水平下调AR表达;2.诱导内质网应激通过激活PERK/eIF2α通路促进ATF4与AR启动子结合,从而抑制AR的转录活性;3.选择性PERK/eIF2α激活剂CCT020312在体内外均可显着抑制LAR TNBC,其机制与激活PERK/eIF2α通路抑制AR、诱导细胞凋亡和G1期阻滞以及抑制AKT/mTOR通路密切相关;以上研究结果表明,靶向激活内质网应激特定信号通路可为LAR TNBC的治疗提供新的策略和思路。通过本项目的研究也为其他基于内质网应激理论的药物研发提供理论参考。
张旭[9]（2020）在《HIV-1病毒Nef蛋白抑制剂的筛选及其作用机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的艾滋病是由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的一种慢性传染病,主要传播途径包括血液接触,母婴传播和性传播三种,因其具有致命性,且尚无彻底治愈药物的特点,成为威胁人类健康的主要疾病之一。艾滋病未能得以根治的主要原因是有病毒储藏库的存在。目前的联合抗逆转录病毒治疗方法（cART）主要靶向艾滋病毒编码蛋白中的三种酶活性蛋白。但15种HIV编码蛋白中还有许多潜在的病毒机制及可能的药物靶点仍未得到充分研究。为了清除HIV-1的病毒储藏库,已经开发出各种治疗策略,其中包括“HIV-1病毒储藏库的震和杀”（“shock and kill”）。“shock and kill”研究的关键问题之一是如何修复HIV-1感染受损的免疫系统,恢复宿主的免疫监控,以达到清除病毒的效果。长期以来HIV-1的Nef蛋白可以通过介导细胞表面MHC-I的下调,帮助HIV-1逃避免疫系统的监控。寻找一种新型的特异性拮抗Nef下调MHC-1的抗病毒药物具有重大的学术价值和应用价值。本研究试图从FDA批准已经在临床上使用的化合物库中希望筛选一个能够特异性拮抗Nef蛋白的抗病毒药物,从而恢复细胞表面的MHC-I的表达,增加免疫系统对HIV-1感染细胞的应答反应,为临床上增强对HIV-1的免疫监控提供一种新的治疗策略。研究内容和方法首先,本研究利用分子克隆技术构建HIV-1 Nef-GFP蛋白稳定表达的荧光载体系统,通过细胞转染,流式细胞术等方法,在HEK293T细胞中验证Nef-GFP表达载体能够有效抑制细胞表面MHC-I的表达。进一步再通过高通量药物筛选,筛选出Nef抑制MHC-I表达的拮抗剂洛伐他汀。其次,通过病毒的包装和体外扩增,过表达Nef和SERINC5,ELISA等实验方法,验证洛伐他汀是否能够抑制同样被Nef下调的CD4和SERINC5,并抑制由Nef引起的病毒复制能力。通过病毒体外感染,共培养等实验来检测洛伐他汀是否促进自体的细胞毒性T淋巴细胞通过免疫杀伤反应清除感染细胞,并进一步测试洛伐他汀抑制从HIV-1感染者中分离出的CD4+T淋巴细胞的病毒反弹,验证洛伐他汀的抗病毒效果。最后,通过分子对接实验、位点突变、和免疫共沉淀方法,探讨洛伐他汀特异性拮抗Nef蛋白恢复MHC-I表达的分子机制。研究成果本研究通过流式高通量药物筛选系统对FDA批准已在临床上广泛使用的的药物库进行药物筛选工作,我们发现一种他汀类药物洛伐他汀,不仅可以显着拮抗Nef蛋白下调MHC-I的表达,还可以拮抗Nef抑制的CD4和SERINC5的表达,并在野生型HIV-1病毒感染的CD4+T细胞中验证了洛伐他汀对MHC-1和CD4的下调有抑制作用,抑制作用呈现剂量依赖性。体外CD4+T细胞自体感染实验和自体CD8+T细胞共培养实验中,加入特定组合的HIV-1抗原肽模拟体内病毒感染情况,发现洛伐他汀处理后,感染细胞中病毒复制被有效并持续的抑制,说明洛伐他汀能有效抑制病毒颗粒的内源性感染性。通过细胞杀伤实验检测结果,发现洛伐他汀处理后,感染的CD4+T细胞的CTLs杀伤毒性显着增加,表明洛伐他汀还可以促进自体CTLs,并且有效抑制从HIV-1感染者中分离出的CD4+T淋巴细胞的病毒反弹。另外,我们通过分子对接实验,计算洛伐他汀可能与Nef-MHC-I复合物作用的位点,并通过分子突变实验加以证实。我们还发现洛伐他汀通过直接与Nef蛋白作用,干扰Nef-MHC-AP-1复合物的形成,从而抑制Nef蛋白对MHC-I的下调。结论本研究筛选出一种有前景的抗HIV-1病毒药物洛伐他汀。洛伐他汀可以拮抗Nef介导的MHC-I、CD4和SERINC5的下调,增强CD8+T细胞的CTLs反应,抑制病毒的复制,有助于临床上增强抗HIV-1的免疫监控呼吸道合胞体病毒（RSV）是最常见的呼吸道病毒,它与儿童肺炎、细支气管炎和婴幼儿死亡率显着相关。Micro RNAs（mi RNAs）是一种内源性非编码小RNAs,在基因调控中发挥作用,并与宿主免疫反应和疾病进展相关。在本研究中,为了识别儿童肺炎相关潜在的生物标志物,同时研究RSV相关儿童肺炎的分子机制,我们分析了患RSV轻症肺炎和重症肺炎儿童全血样本的全转录组和微小RNA组。我们发现RSV重症肺炎患儿全血mi RNAs和编码RNA（m RNA）表达谱发生改变,差异明显。在RSV重症肺炎患儿中,hsa-mi R-1271-5p、hsa-mi R-10a-3p、hsa-mi R-125b-5p和hsa-mi R-30b-3p这四种mi RNAs被显着上调。进一步,我们对RSV重症肺炎的特异性mi RNA的靶标基因进行了比较。利用基因功能富集分析法（GO分析）对这些靶基因进行分析,发现大多数靶基因参与炎症和免疫反应,包括NF-k B信号通路、MAPK信号通路和T细胞受体信号通路。我们的发现将有助于识别重症肺炎的生物标志物和新的药物设计策略,并用用以治疗的RSV重症肺炎儿童。
柳静[10]（2020）在《SRC-3在多发性骨髓瘤耐药性产生中的作用机制研究》文中提出目的:1、研究雌激素受体共激活因子3（steroid receptor coactivator-3,SRC-3）在多发性骨髓瘤产生硼替佐米耐药性过程中的作用。2、解析SRC-3在多发性骨髓瘤耐药性中蛋白质修饰和相分离的调控机制。3、验证SRC-3特异性抑制剂SI-2逆转多发性骨髓瘤耐药性的作用和机制方法和结果:1、在以硼替佐米为主治疗方案的多发性骨髓瘤患者中,SRC-3的表达量水平与临床治疗效果呈负相关。通过显微断层扫描、实时荧光定量PCR、随访分析等实验手段,发现在复发/难治性骨髓瘤患者中,有着较高的SRC-3表达,其预后恢复和骨病变恢复都更差,且SRC-3的表达量与患者的染色体t（4;14）异常呈正相关。2、骨髓瘤细胞中SRC-3的表达量水平与其对硼替佐米的敏感性呈负相关。通过免疫印迹和细胞毒实验检测10种骨髓瘤细胞,发现的SRC-3表达量越高的细胞对硼替佐米的敏感性越低。通过基因编辑技术在骨髓瘤细胞中改变SRC-3的表达水平也能得到同样的结论。利用同位素标记技术鉴定骨髓瘤耐药前后细胞的蛋白质组学变化,分析发现SRC-3在128种升高的蛋白质中。3、SRC-3与NSD2物理上存在相互作用。通过蛋白质谱检技术测骨髓瘤细胞中SRC-3蛋白复合物,发现复合物成分中有NSD2。免疫荧光和邻位连接技术实验发现二者存在共定位。构建SRC-3和NSD2不同的截短体后进行免疫共沉淀,发现SRC-3通过AD2结构域与NSD2的PWWP结构域结合。4、NSD2促进SRC-3蛋白质的稳定性。构建NSD2的突变体,发现NSD2能够通过SET结构域的甲基化酶活功能,促进SRC-3蛋白质的稳定性。5、NSD2促进SRC-3的液-液相分离能力。通过序列分析发现SRC-3具有内在无序区域（为369～1072aa和1085～1424aa区域）。相分离相关实验说明SRC-3具有液-液相分离的特性,其中1085～1424aa刚好包含与NSD2结合的区域AD2（1169～1417aaa）。通过基因编辑技术改变NSD2的表达水平会影响SRC-3的相分离,增加NSD2的表达后SRC-3的相分离能力增强,反之,减弱。6、硼替佐米耐药型骨髓瘤细胞中SRC-3的相分离更明显。通过免疫荧光实验,发现耐药后的细胞中,SRC-3有更明显的蛋白凝集现象,相分离形成数量更多。7、SI-2能干扰NSD2和SRC-3之间的相互作用,并影响SRC-3蛋白质的稳定性和相分离能力。通过免疫共沉淀、蛋白质稳定性和相分离相关实验,发现SI-2能够干扰SRC-3和NSD2之间的相互作用,导致SRC-3蛋白质的稳定性下降,相分离能力减弱。8、SI-2能抑制耐药后相关基因的转录。通过转录组测序及染色质免疫共沉淀测序,SI-2能使转录起始复合物Pol II受到抑制,并导致染色质的H3K36me2的水平下降,抑制耐药相关基因的表达,包括ABC基因家族、BCL2、CCL4等与耐药和抗凋亡相关的基因以及受SRC-3调控的下游基因CBS、TNC、EGR1和IGF1R等。9、SI-2能增加骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性,逆转骨髓瘤的耐药。通过免疫印迹实验发现,SI-2能明显抑制SRC-3,增加骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性,促进细胞凋亡。将SI-2与硼替佐米联合处理NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/Sz J（NSG）建立的异种移植瘤和骨髓腔内移植小鼠,通过肿瘤体积检测、免疫组化、免疫荧光和小动物显微断层扫描技术,发现SI-2能够促进硼替佐米抑制肿瘤的生长和增殖,增加肿瘤的细胞凋亡,加速骨破坏的恢复,起到联合治疗的效果,逆转骨髓瘤的耐药。结论:1、多发性骨髓瘤患者的SRC-3的表达量水平与临床治疗效果成负相关,与患者的染色体t（4;14）异常呈正相关。2、细胞水平上SRC-3表达水平与骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性成负相关。3、分子机制上,SRC-3可以与NSD2直接相互作用,后者促进SRC-3蛋白质的稳定性和相分离,使染色质H3K36me2的水平升高,引起与耐药和抗凋亡相关的基因转录激活,导致耐药。4、SRC-3抑制剂SI-2可以在体内和体外水平上与硼替佐米发挥协同作用,增加骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性,逆转骨髓瘤的耐药。
二、RNAi,a new therapeutic strategy against viral infection（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RNAi,a new therapeutic strategy against viral infection（论文提纲范文）
（2）缺氧微环境中HIF-1/RACGAP1调控人肝癌细胞发生发展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂和仪器 |
| 1.1.1 主要试剂及耗材 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 构建缺氧人肝癌细胞系培养模型 |
| 1.2.2 慢病毒转染Hep3B和Huh-7细胞 |
| 1.2.3 实时荧光定量PCR(qPCR)检测基因mRNA表达 |
| 1.2.4 Western Blot检测HIF-1α、RACGAP1在蛋白水平的表达量 |
| 1.2.5 免疫荧光检测HIF1α和RACGAP1蛋白表达水平 |
| 1.2.6 CCK-8检测细胞增殖能力 |
| 1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡情况 |
| 1.2.8 划痕实验检测细胞迁移能力 |
| 1.2.9 Transwell检测细胞侵袭能力 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 HIF1α和RACGAP1重组慢病毒分别成功转染Huh-7和Hep3B细胞 |
| 2.1.1 Western blot检测HIF-1α重组慢病毒成功转染Huh-7和Hep3B细胞 |
| 2.1.2 免疫荧光检测HIF-1α重组慢病毒成功转染Huh-7和Hep3B细胞 |
| 2.1.3 qPCR检测HIF-1α重组慢病毒成功转染Huh-7和Hep3B细胞 |
| 2.1.4 RACGAP1干扰慢病毒转染Huh-7和Hep3B细胞筛选 |
| 2.1.5 Western blot检测RACGAP1重组慢病毒成功转染Huh-7和Hep3B细胞 |
| 2.1.6 免疫荧光检测RACGAP1重组慢病毒成功转染Huh-7和Hep3B细胞 |
| 2.1.7 qPCR检测RACGAP1重组慢病毒成功转染Huh-7和Hep3B细胞 |
| 2.2 HIF-1α基因诱导人肝癌细胞系增殖 |
| 2.3 HIF-1α基因抑制人肝癌细胞系凋亡 |
| 2.4 HIF-1α基因增加人肝癌细胞系迁移能力 |
| 2.5 HIF-1α基因提高人肝癌细胞侵袭能力 |
| 2.6 RACGAP1基因提高人肝癌细胞增殖能力 |
| 2.7 RACGAP1基因抑制人肝癌细胞凋亡 |
| 2.8 HIF-1α和RACGAP1协同促进人肝癌细胞凋亡 |
| 2.9 HIF-1α和RACGAP1协同促进人肝癌细胞侵袭 |
| 3 讨论 |
| 3.1 低氧与肿瘤 |
| 3.2 HIF-1α基因与肿瘤发展 |
| 3.3 RACGAP1基因与肿瘤发展 |
| 4 不足和展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 缺氧诱导因子在原发性肝细胞癌中的作用机制综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文及获得的科研成果 |
（3）胃部SIDT1介导外源性microRNA吸收的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景综述 |
| 第一节 外源性mi RNA跨界调控哺乳动物基因表达 |
| 一、micro RNA及其功能 |
| 二、外源性mi RNA经消化道被哺乳动物吸收并具有跨界调控作用 |
| 三、食源性mi RNA进入哺乳动物体内的机制研究进展 |
| 第二节 SIDT1 |
| 一、线虫系统RNAi现象和SID蛋白的研究进展 |
| 二、SID蛋白的研究进展 |
| 1.SID-1 |
| 2.SID-2 |
| 三、SIDT1和SIDT2 的研究进展 |
| 1.SIDT1 |
| 2.SIDT2 |
| 第三节 基于小核酸的肝纤维化基因疗法药物研究 |
| 一、TGF-β是肝纤维化基因疗法最重要的靶标 |
| 二、基于小核酸的肝纤维化的基因治疗现状 |
| 1.基于反义ODN的治疗 |
| 2.基于si RNA的治疗 |
| 3.基于mi RNA的治疗 |
| 4.基于诱饵ODN的治疗 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验部分 |
| 第一节 SIDT1 介导小鼠对食物mi RNA的吸收 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.SIDT1 对外源mi RNA吸收具有必要性 |
| 全身性Sidt1 基因敲除小鼠的验证 |
| Sidt1~(-/-)小鼠对口服植物miRNA的动态吸收能力降低 |
| Sidt1~(-/-)小鼠对中药或食物中miRNA的动态吸收能力降低 |
| Sidt1~(-/-)小鼠肝脏中的外源miRNA本底水平降低 |
| 食物来源miR168a对于Sidt1~(-/-)小鼠肝组织中LDLRAP1 的跨界调控作用减弱 |
| 2.SIDT1 在胃介导mi RNA的吸收 |
| SIDT1 蛋白在胃肠道各器官组织匀浆的分布 |
| SIDT1 在消化道各器官组织切片的分布 |
| SIDT1 在胃粘膜组织细胞水平的分布 |
| SIDT1 在胃粘膜上皮细胞亚细胞水平的分布 |
| 外源mi RNA在胃肠道各器官组织匀浆的丰度分布 |
| 幽门结扎手术模型的建立与验证 |
| 幽门结扎实验定量研究胃部SIDT1 介导mi RNA吸收 |
| 荧光成像检验幽门结扎模型中胃部SIDT1 介导mi RNA吸收后的组织分布 |
| 3.胃酸对胃部SIDT1 介导的外源mi RNA吸收的影响 |
| 胃粘膜上皮细胞吸收外源性mi RNA体外模型的建立与验证 |
| 原代胃黏膜上皮细胞对酸性环境的耐受 |
| 体外实验发现酸性环境促进SIDT1 介导的mi RNA吸收 |
| 四、小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 食物中的MIR2911 能够通过抑制TGF-β1 治疗CCl4 造模引起的小鼠肝纤维化 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.mi R2911 在人和小鼠具有靶基因Tgf-β1 |
| 生物信息学预测mi R2911 靶向人和小鼠的内源性基因Tgf-β1 |
| 体外验证mi R2911 对人和小鼠Tgf-β1 的调控作用 |
| 2.口服外源miR2911 的方法可以SIDT1 依赖地治疗CCl_4模型小鼠的肝纤维化 |
| 四、小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 总结 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（4）抗Cyclin D1胞内抗体对三阴性乳腺癌生长和转移的抑制作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 乳腺癌研究现状 |
| 1.1.1 乳腺癌发病率 |
| 1.1.2 乳腺癌病理分型 |
| 1.1.3 三阴性乳腺癌病理分型 |
| 1.1.4 三阴性乳腺癌治疗 |
| 1.2 细胞周期调控 |
| 1.3 Cyclin D1 蛋白 |
| 1.3.1 Cyclin D1 转录和翻译后调控 |
| 1.3.2 Cyclin D1 生物学功能 |
| 1.3.3 Cyclin D1 发挥促癌作用信号通路 |
| 1.3.4 靶向Cyclin D1 癌症治疗策略 |
| 1.4 胞内抗体 |
| 1.4.1 抗体基本结构组成 |
| 1.4.2 胞内抗体制备 |
| 1.4.3 胞内抗体应用 |
| 1.5 本论文立题目的及研究内容 |
| 第2章 Cyclin D1 在三阴性乳腺癌中的异常表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞株及质粒 |
| 2.2.2 实验耗材 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 实验仪器 |
| 2.2.5 组织芯片 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 去内毒素质粒的提取 |
| 2.3.3 细胞转染 |
| 2.3.4 细胞稳定转染 |
| 2.3.5 细胞荧光共定位分析 |
| 2.3.6 细胞周期检测 |
| 2.3.7 细胞凋亡检测 |
| 2.3.8 划痕实验 |
| 2.3.9 细胞侵袭能力的测定 |
| 2.3.10 细胞迁移能力的测定 |
| 2.3.11 Western blot分析 |
| 2.3.12 免疫共沉淀(Co-IP)分析 |
| 2.3.13 组织芯片的免疫组化技术 |
| 2.3.14 免疫组化结果判定 |
| 2.4 数据库资源 |
| 2.4.1 GEO数据库资源 |
| 2.4.2 数据分析处理所用软件资源 |
| 2.4.3 统计学分析 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 TBNC组织中Cyclin D1 异常转录 |
| 2.5.2 PPI网络构建 |
| 2.5.3 KEGG 富集分析Cyclin D1在TNBC中参与的信号通路 |
| 2.5.4 Cyclin D1在TNBC组织中高表达 |
| 2.5.5 ER-ADκ在 MDA-MB-231和BT-549 细胞中的表达 |
| 2.5.6 ER-ADκ在 MDA-MB-231和BT-549 细胞中的定位 |
| 2.5.7 细胞中表达的ER-ADκ能与Cyclin D1 相互作用 |
| 2.5.8 ER-ADκ抑制三阴性乳腺癌细胞周期进程 |
| 2.5.9 ER-ADκ促进三阴性乳腺癌细胞凋亡 |
| 2.5.10 ER-ADκ促进三阴性乳腺癌细胞迁移 |
| 2.5.11 ER-ADκ抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭和浸润 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 本章小结 |
| 第3章 ER-ADκ抑制三阴性乳腺癌生长和转移的分子机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞株及转染试剂 |
| 3.2.2 实验所用主要仪器及试剂 |
| 3.2.3 实验所需抗体 |
| 3.2.4 Q-PCR 实验所需引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养及转染 |
| 3.3.2 逆转录(RT)反应 |
| 3.3.3 Real Time PCR(Q-PCR) |
| 3.3.4 细胞透射电镜观察 |
| 3.3.5 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 ER-ADκ 抑制三阴性乳腺癌细胞增殖相关通路的活化 |
| 3.4.2 ER-ADκ 促进三阴性乳腺癌细胞凋亡相关通路的活化 |
| 3.4.3 ER-ADκ 抑制三阴性乳腺癌转移相关通路的活化 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 靶向Cyclin D1 胞内抗体抑制三阴性乳腺癌生长和转移机制的体内研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验细胞株 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 本研究中用到的试剂 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 动物实验 |
| 4.3.3 组织H&E染色 |
| 4.3.4 免疫组化技术 |
| 4.3.5 TUNEL染色 |
| 4.3.6 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 ER-ADκ抑制体内MDA-MB-231 乳腺癌原位生长 |
| 4.4.2 ER-ADκ抑制三阴性乳腺癌细胞远端转移 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（5）CDK1在胰腺癌中的生物学功能、临床意义及相关抑制剂研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1. 胰腺癌的靶向治疗现状 |
| 2. 细胞周期蛋白依赖性激酶CDKs在肿瘤中的研究 |
| 3. 抗凋亡蛋白Mcl-1 |
| 4. 研究方案 |
| 5. 参考文献 |
| 第一部分 敲减CDK1对胰腺癌体内外生长的影响 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 3. 实验结果与讨论 |
| 4. 小结 |
| 5. 参考文献 |
| 第二部分 CDK1在胰腺癌患者中的表达及临床意义 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 第三部分 CDK1抑制剂抗胰腺癌活性与及作用机制研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 3. 实验结果与讨论 |
| 4. 小结 |
| 5. 参考文献 |
| 第四部分 新型CDK1抑制剂和相关抗凋亡蛋白Mcl-1抑制剂的研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 3. 实验结果与讨论 |
| 3.1 CDK1小分子抑制剂的虚拟筛选 |
| 3.2 Mcl-1小分子抑制剂的虚拟筛选 |
| 3.3 Mcl-1抑制剂M02和M08的抗胰腺癌活性 |
| 4. 小结 |
| 5. 参考文献 |
| 综述: CDKs在胰腺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English manuscript Ⅰ Structure-based virtual screening, biological evaluation and biophysical study of novel Mcl-1 inhibitors |
| English manuscript Ⅱ Recent progress in development of cyclin-dependent kinase 7 inhibitors for cancer therapy |
（6）组学方法筛选抗高致病性禽流感病毒老药新用及新冠肺炎患者免疫反应与肺损伤研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 流感病毒简介 |
| 1.2 流感病毒致病性的宿主倾向和病毒决定因素 |
| 1.2.1 流感病毒的宿主倾向 |
| 1.2.2 病毒致病性的病毒决定因素 |
| 1.3 流感病毒致病性的宿主决定因素 |
| 1.3.1 促炎性细胞因子 |
| 1.3.2 氧化应激 |
| 1.3.3 肾素-血管紧张素系统 |
| 1.4 流感病毒的治疗药物 |
| 1.4.1 批准的治疗药物 |
| 1.4.2 抗流感药物的研究进展 |
| 1.5 冠状病毒 |
| 1.6 高致病性人冠状病毒的致病机制 |
| 1.6.1 促炎性细胞因子 |
| 1.6.2 肾素-血管紧张素系统 |
| 1.7 本论文的研究方向及意义 |
| 第2章 全基因组RNAi筛选抗H5N1感染药物 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 流感病毒毒株 |
| 2.2.2 细胞株 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.2.4 siRNA文库 |
| 2.2.5 主要试剂和抗体 |
| 2.2.6 细胞培养和转染试剂 |
| 2.3 主要实验设备 |
| 2.4 主要溶液配置 |
| 2.4.1 常用缓冲液的配制 |
| 2.4.2 DEPC处理水的配制 |
| 2.5 实验方法: |
| 2.5.1 病毒接种、扩增及收取 |
| 2.5.2 基因组siRNA筛选 |
| 2.5.3 基因组siRNA筛选宿主基因生物信息学分析 |
| 2.5.4 挑选靶向siRNA筛选宿主基因的药物 |
| 2.5.5 细胞水平检测筛选药物对H5N1病毒感染的影响 |
| 2.5.6 小鼠肺组织病理检测及炎性浸润细胞计数 |
| 2.5.7 小鼠肺组织湿干重量比测定 |
| 2.5.8 小鼠生存曲线及体重变化 |
| 2.5.9 小鼠肺组织及血液RNA样品收取 |
| 2.5.10 小鼠肺组织及血液RNA提取 |
| 2.5.11 RNA测序及数据分析 |
| 2.5.12 差异基因pathway聚类分析及疾病相关分析 |
| 2.5.13 小鼠肺组织病毒复制检测 |
| 2.5.14 肺组织白细胞浸润 |
| 2.5.15 小鼠血浆细胞因子及趋化因子检测 |
| 2.6 实验结果 |
| 2.6.1 第一轮基因组RNAi筛选出6540个基因 |
| 2.6.2 两轮筛选共得到2957个重要宿主基因 |
| 2.6.3 宿主基因通路富集分析 |
| 2.6.4 基因本体注释聚类分析分子定位 |
| 2.6.5 剪接体和线粒体呼吸链复合物Ⅰ在流感中起重要作用 |
| 2.6.6 基因本体注释聚类分析生物学过程 |
| 2.6.7 筛选出104个靶向宿主基因的药物及初次筛选结果 |
| 2.6.8 在细胞水平多次筛选中均显着挽救的药物 |
| 2.6.9 腹腔注射15号,31号,67号,97号药物可显着降低小鼠肺炎症细胞浸润 |
| 2.6.10 腹腔注射39号药物不能缓解小鼠肺病理损伤 |
| 2.6.11 灌胃给药104号药物可显着降低小鼠肺炎症细胞浸润 |
| 2.6.12 灌胃给药11号药物不能缓解小鼠肺病理损伤 |
| 2.6.13 夫拉平度可以显着改善H5N1感染导致的小鼠肺水肿 |
| 2.6.14 夫拉平度显着提升H5N1感染小鼠的生存率 |
| 2.6.15 夫拉平度对H5N1感染后鼠肺病毒复制的影响 |
| 2.6.16 夫拉平度显着降低肺组织中性粒细胞及T细胞浸润 |
| 2.6.17 夫拉平度缓解H5N1感染后的细胞因子风暴 |
| 2.6.18 夫拉平度可降低肺组织Tlr2及Nod2表达量 |
| 2.6.19 夫拉平度缓解肺损伤的机制探究 |
| 2.6.20 格列苯脲降低H5N1感染诱导的细胞因子及受体表达量 |
| 2.6.21 布比卡因降低H5N1感染诱导的细胞因子及受体表达量 |
| 2.6.22 二氮嗪降低H5N1感染诱导的细胞因子及受体表达量 |
| 2.6.23 维罗非尼降低H5N1感染诱导的细胞因子及受体表达量 |
| 2.6.24 20种非糖皮质激素药物治疗肺部疾病的临床文献搜索 |
| 2.7 实验结论 |
| 2.7.1 基因组siRNA筛选出2957个在H5N1感染过程中起重要作用的基因 |
| 2.7.2 格列苯脲、布比卡因、夫拉平度、二氮嗪和维罗非尼可以显着缓解H5N1感染小鼠的肺组织炎症细胞浸润 |
| 2.7.3 夫拉平度是一种新型潜在抗H5N1感染药物 |
| 2.7.4 基于全基因组siRNA筛选是寻找老药新用的有效手段 |
| 2.8 讨论 |
| 第3章 转录组学方法筛选抗H5N1感染药物 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和仪器 |
| 3.2.1 流感病毒毒株,细胞,动物 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 A549细胞染毒13时间点转录组测序分析 |
| 3.3.2 转录组差异基因筛选药物 |
| 3.3.3 细胞水平抗H5N1药物筛选 |
| 3.3.4 小鼠模型筛选抗H5N1药物 |
| 3.3.5 小鼠肺组织病毒滴度检测 |
| 3.3.6 小鼠生存曲线及体重变化 |
| 3.3.7 小鼠肺组织转录组生物信息学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 A549感染H5N1时间点通路聚类及药物筛选 |
| 3.4.2 细胞水平抗H5N1药物筛选 |
| 3.4.3 灌胃给药17,23,29,30,33号可以缓解肺损伤 |
| 3.4.4 腹腔注射给药2,6,13,14,18,20号可以缓解肺损伤 |
| 3.4.5 腹腔注射给药2,13,14,18号可以缓解肺水肿 |
| 3.4.6 给药2, 13,14,18号可以提高H5N1感染小鼠生存率 |
| 3.4.7 14,18号显着降低了小鼠肺组织病毒载量 |
| 3.4.8 FAD作用机制探究 |
| 3.4.9 盐酸阿米替林作用机制探究 |
| 3.4.10 阿扎胞苷作用机制探究 |
| 3.4.11 骨化三醇作用机制探究 |
| 3.4.12 7种药物影响通路与肺部疾病相关 |
| 3.5 实验结论 |
| 3.5.1 盐酸阿米替林,FAD,阿扎胞苷,骨化三醇是新型潜在抗H5N1感染药物 |
| 3.5.2 基于转录组高通量测序筛选老药新用是一种高效寻找治疗方法的策略 |
| 3.6 讨论 |
| 第4章 新冠肺炎患者免疫反应与肺损伤 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与实验仪器 |
| 4.2.1 临床样本 |
| 4.2.2 主要检测试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 病毒核酸制备 |
| 4.3.2 新型冠状病毒核酸检测 |
| 4.3.3 血浆血管紧张素Ⅱ检测 |
| 4.3.4 血浆细胞因子及趋化因子检测 |
| 4.3.5 患者疾病严重程度分类 |
| 4.3.6 相关性分析 |
| 4.3.7 血浆细胞因子ROC曲线 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 COVID-19,H7N9,细菌感染肺炎患者及健康对照的人口学指标及临床信息 |
| 4.4.2 COVID-19,H7N9,细菌感染肺炎患者及健康对照的血浆细胞因子水平 |
| 4.4.3 细胞因子表达水平与COVID-19发病时间 |
| 4.4.4 细胞因子水平与COVID-19患者病毒载量相关性分析 |
| 4.4.5 细胞因子水平与COVID-19患者肺损伤Murray评分相关性分析 |
| 4.4.6 细胞因子水平预测COVID-19患者疾病严重程度 |
| 4.4.7 血浆血管紧张素Ⅱ在COVID-19患者中显着升高 |
| 4.5 结论 |
| 4.5.1 COVID-19重症患者38种细胞因子水平上升 |
| 4.5.2 17种细胞因子水平与病毒载量相关 |
| 4.5.3 15种细胞因子水平与肺损伤Murray评分相关并可以预测疾病严重程度 |
| 4.5.4 COVID-19患者血浆血管紧张素Ⅱ水平显着上升并与病毒载量和PaO_2/FiO_2相关 |
| 4.6 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（7）MicroRNA-222介导PI3K/Akt/MMP-9信号通路参与调控HMGA1对葡萄膜黑色素瘤生物学功能的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 绪论 |
| 第一部分 HMGA1在葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 葡萄膜黑色素瘤中HMGA1对PI3K/Akt/MMP-9通路的调控作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 MicroRNA-222对葡萄膜黑色素瘤细胞生物学功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 葡萄膜黑色素瘤中HMGA1靶向miR-222对PI3K/Akt/MMP-9通路调控的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第五部分 HMGA1对葡萄膜黑色素瘤细胞生物学行为影响的裸鼠体内研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文文章 |
（8）诱导内质网应激下调LAR型三阴性乳腺癌中雄激素受体表达的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 诱导内质网应激对LAR型三阴性乳腺癌中雄激素受体表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第二部分 诱导内质网应激下调LAR型三阴性乳腺癌中雄激素受体表达的分子机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第三部分 选择性PERK/eIF2α激活剂对LAR型三阴性乳腺癌的作用及机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 全文讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间的研究成果 |
（9）HIV-1病毒Nef蛋白抑制剂的筛选及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词和中英文对照表 |
| 第一部分 :HIV-1 病毒Nef蛋白抑制剂的筛选和及其作用机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 1.1 HIV的研究背景 |
| 1.2 Nef蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 Nef蛋白的基本特征 |
| 1.2.2 Nef介导的HIV病毒躲避免疫监控的机制 |
| 1.3 抗HIV-1药物的研究进展 |
| 1.3.1 抗HIV-1的治疗方法 |
| 1.3.2 抗病毒药物的种类 |
| 1.3.3 开发抗病毒药物的靶标 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.3 实验主要质粒和小分子 |
| 2.1.4 主要试剂耗材 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 受试者临床样本入排标准及医学伦理 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 外周血单个核细胞(PBMCs)的分离 |
| 2.2.4 人原代T淋巴细胞的分离培养 |
| 2.2.5 贴壁细胞系的传代 |
| 2.2.6 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.7 HEK293T细胞转染实验 |
| 2.2.8 流式细胞术 |
| 2.2.9 单轮感染试验 |
| 2.2.10 病毒体外扩增和感染实验 |
| 2.2.11 自体CD4~+和CD8~+T细胞共培养实验 |
| 2.2.12 细胞毒性杀伤实验 |
| 2.2.13 分子对接 |
| 2.2.14 Western Blot实验 |
| 2.2.14 免疫共沉淀 |
| 2.2.15 蛋白纯化实验 |
| 2.2.16 表面等离子体共振实验 |
| 2.3 技术路线 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 高通量筛选Nef抑制MHC-I表达的拮抗剂,恢复MHC-I的表达 |
| 3.2 洛伐他汀有效抑制Nef介导的MHC-I下调 |
| 3.3 洛伐他汀拮抗Nef介导的CD4和SERINC5 的下调以及抑制病毒颗粒的内源性感染性 |
| 3.4 在野生型HIV-1 感染期间,洛伐他汀可以抑制MHC-I和 CD4 分子的下调 |
| 3.5 洛伐他汀的预处理可增强HIV-1 感染者对重新激活的潜伏库的自体CTL应答 |
| 3.6 洛伐他汀直接作用于Nef,阻断Nef与 AP-1 的相互作用 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 展望 |
| 第6章 结论 |
| 第二部分 :通过整合微小RNA组(mi RNAome)和转录组分析鉴定呼吸道合胞体病毒(RSV)引起的小儿肺炎中mi RNA与 m RNA的互作关系 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 病人样本收集 |
| 2.2 RNA提取实验 |
| 2.3 高通量测序 |
| 2.4 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.5 数据分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 利用高通量测序分析RSV轻症肺炎和RSV重症肺炎患儿全血标本中mi RNA和mRNA差异表达 |
| 3.2 对选定的mi RNA进行验证,鉴定潜在的诊断性mi RNA生物标志物 |
| 3.3 差异表达miRNA靶基因的预测与鉴定 |
| 第4章 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 附录 细胞株来源 |
| 个人简介 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）SRC-3在多发性骨髓瘤耐药性产生中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、SRC-3在多发性骨髓瘤耐药中的作用研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料与试剂 |
| 1.1.2 细胞信息 |
| 1.1.3 细胞培养、耐药细胞系的建立、SLAC标记细胞 |
| 1.1.4 浆细胞样本制备 |
| 1.1.5 提取RNA |
| 1.1.6 逆转录PCR |
| 1.1.7 实时荧光定量PCR |
| 1.1.8 提取全蛋白、免疫印迹(Western blot) |
| 1.1.9 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 1.1.10 CCK-8测半数抑制浓度IC50 |
| 1.1.11 细胞质粒转染 |
| 1.1.12 病毒感染骨髓瘤细胞 |
| 1.1.13 免疫组化(Immunohistochemistry,IHC) |
| 1.1.14 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 SRC-3表达水平与多发性骨髓瘤患者的治疗效果呈负相关 |
| 1.2.2 SRC-3表达水平与骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性呈负相关 |
| 1.2.3 体外过表达或敲低SRC-3水平会影响骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、SRC-3 通过与NSD2 互作影响蛋白稳定性从而影响多发性骨髓瘤耐药的机制研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.2 细胞系及细胞培养 |
| 2.1.3 细胞质粒转染 |
| 2.1.4 病毒感染骨髓瘤细胞 |
| 2.1.5 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP) |
| 2.1.6 银染、切胶、质谱 |
| 2.1.7 提取全蛋白、免疫印迹(Western blot) |
| 2.1.8 提取RNA |
| 2.1.9 逆转录PCR |
| 2.1.10 实时荧光定量PCR |
| 2.1.11 邻近连接技术(Proximity Ligation Assay,PLA) |
| 2.1.12 质粒构建 |
| 2.1.13 免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| 2.1.14 蛋白质液-液相分离相关试验 |
| 2.1.15 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 NSD2为SRC-3 蛋白复合体的组分促进SRC-3 蛋白质的稳定性 |
| 2.2.2 NSD2 促进SRC-3 蛋白质液-液相分离功能 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、SRC-3抑制剂SI-2逆转骨髓瘤耐药的作用及机制研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.2 细胞系及细胞培养 |
| 3.1.3 动物皮下移植瘤模型 |
| 3.1.4 动物骨髓腔内移植(Intra-bone)模型和活体Micro CT |
| 3.1.5 细胞质粒转染 |
| 3.1.6 病毒感染骨髓瘤细胞 |
| 3.1.7 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP) |
| 3.1.8 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP) |
| 3.1.9 DNA建库、Ch IP-sequencing |
| 3.1.10 提取全蛋白、免疫印迹(Western blot) |
| 3.1.11 提取RNA |
| 3.1.12 RNA-sequencing |
| 3.1.13 逆转录PCR |
| 3.1.14 实时荧光定量PCR |
| 3.1.15 免疫组化(Immunohistochemistry,IHC) |
| 3.1.16 免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| 3.1.17 TUNEL染色 |
| 3.1.18 Masson染色 |
| 3.1.19 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 SI-2 干扰骨髓瘤细胞中NSD2对SRC-3 的影响 |
| 3.2.2 SI-2抑制骨髓瘤耐药型细胞中耐药相关基因的表达 |
| 3.2.3 SI-2增加骨髓瘤对硼替佐米的敏感性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 Hedgehog信号通路与多发性骨髓瘤耐药性的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、RNAi,a new therapeutic strategy against viral infection（论文参考文献）
- [1]B2m基因RNAi慢病毒载体构建及其对肝癌细胞增殖的影响[D]. 曾锐敏. 南华大学, 2021
- [2]缺氧微环境中HIF-1/RACGAP1调控人肝癌细胞发生发展的机制研究[D]. 吴贤建. 右江民族医学院, 2021(01)
- [3]胃部SIDT1介导外源性microRNA吸收的机制[D]. 张范. 南京大学, 2020(12)
- [4]抗Cyclin D1胞内抗体对三阴性乳腺癌生长和转移的抑制作用及机制研究[D]. 张影. 吉林大学, 2020(03)
- [5]CDK1在胰腺癌中的生物学功能、临床意义及相关抑制剂研究[D]. 杜金童. 山东大学, 2020(04)
- [6]组学方法筛选抗高致病性禽流感病毒老药新用及新冠肺炎患者免疫反应与肺损伤研究[D]. 张聪. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [7]MicroRNA-222介导PI3K/Akt/MMP-9信号通路参与调控HMGA1对葡萄膜黑色素瘤生物学功能的影响[D]. 程英. 山东大学, 2020(11)
- [8]诱导内质网应激下调LAR型三阴性乳腺癌中雄激素受体表达的作用及分子机制研究[D]. 李小丽. 重庆医科大学, 2020(01)
- [9]HIV-1病毒Nef蛋白抑制剂的筛选及其作用机制研究[D]. 张旭. 广州医科大学, 2020(01)
- [10]SRC-3在多发性骨髓瘤耐药性产生中的作用机制研究[D]. 柳静. 天津医科大学, 2020(06)