一、Multiple Suppressive Effects of a Protein from Caesalpinia minax on Murine Melanoma Cells（论文文献综述）
张胜男[1]（2021）在《紫杉叶素抑制黑色素瘤B16细胞增殖及迁移的分子机制研究》文中研究表明背景:近十年来,恶性黑色素瘤的发病率一直在增加,并一度成为世界上发病率增速最快的恶性肿瘤。尽管在我国恶性黑色素瘤的发病率较低,但每年新发患者仍高达8,000～10,000例,并且以每年3%～5%的增速增长。目前恶性黑色素瘤的主要治疗方法为最大限度地手术切除,但晚期黑色素瘤多无法切除或已经转移,约10%的黑色素瘤患者被诊断为晚期只能求助靶向治疗和免疫疗法延长生存期。而在晚期黑色素瘤中,大约有30%的黑色素瘤患者在诊断时有内脏和脑部受累,对治疗产生响应的可能性非常低,其原因一方面可能由于靶向治疗和免疫疗法可能引起肿瘤细胞中某些通路的激活导致耐药性,另一方面药物毒性也使得恶性黑色素瘤患者的生存形势十分严峻。对于这一部分患者,亟需开发出多靶点且低毒的新型药物,改善生存质量延长生存期。紫杉叶素（TAX）作为一种天然黄酮类化合物,属维生素P族,是一种效果显着的抗氧化剂,具有多种生物活性。研究发现,紫杉叶素可引起癌细胞凋亡,诱发癌细胞周期阻滞,促进癌细胞分化,但紫杉叶素在黑色素瘤中的疗效及其起效机制尚不清楚。恶性黑色素瘤存在MAPK通路异常激活的现象,有研究表明紫杉叶素可通过抑制MAPK通路发挥抗炎活性,猜测紫杉叶素可能通过抑制MAPK通路发挥抗肿瘤作用。目的:在本研究中,以恶性程度最高的小鼠B16F10黑色素瘤细胞为模型,通过体内外实验观察紫杉叶素对黑色素瘤的治疗效果,探讨紫杉叶素抑制黑色素瘤B16细胞增殖及迁移的分子机制。方法:实验分为对照组和TAX组（低剂量200μM/高剂量400μM）。（1）用CCK8分别测定小鼠黑色素瘤高转移细胞B16F10和大鼠心肌细胞H9C2的细胞活力。细胞计数法测定细胞生长速率,克隆形成实验、Ed U染色检测细胞增殖情况。细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot检测迁移相关蛋白的表达。（2）采用RNA-seq筛查差异基因,利用R软件和KEGG数据库富集差异基因至肿瘤相关通路,并选取其中最显着通路进行后续实验。（3）Western blot检测MAPK通路关键蛋白ERKs、JNKs、P38、Rac1、c-Myc表达水平,以判断TAX对该通路的影响。进一步分析Rac1/JNK轴下游β-Catenin入核情况及MITF的表达,并进一步与JNK抑制剂SP600125和JNK激活剂茴香霉素对β-Catenin核定位的现象进行比较。（4）利用ERK激活剂表皮生长因子,β-Catenin激活剂氯化锂,JNK激活剂茴香霉素分别与紫杉叶素合用的方式,通过细胞免疫荧光实验进一步分析紫杉叶素影响β-Catenin核定位的起效机制。接着通过CCK8法分析紫杉叶素抑制B16F10细胞增殖的起效机制。（5）进一步分析RNA-seq差异基因集,筛选出差异最显着且差异倍数最大的基因,利用Western blot进一步验证RNA-seq结果,根据该基因的功能推测其对MAPK通路的影响,利用Co-IP实验检测JNK的泛素化水平。构建USP18过表达质粒,回复性验证紫杉叶素对Rac1和JNK的表达情况。（6）紫杉叶素对荷瘤小鼠的治疗作用:C57/BL6小鼠皮下注射3×106个B16F10细胞,构建皮下荷瘤小鼠模型。按照30mg/kg或60mg/kg的剂量对小鼠进行腹腔注射,每日一次,一共进行11天;对小鼠肿瘤组织的质量进行统计分析;对小鼠肿瘤组织及其各脏器组织切片进行HE染色,对小鼠肿瘤组织进行免疫组织化学染色检测肿瘤组织细胞形态及增殖标志物的表达,通过Western blot检测MAPK/β-Catenin通路蛋白表达情况,采用免疫荧光染色法观察β-Catenin的核定位情况。结果:紫杉叶素可显着抑制黑色素瘤细胞B16F10的活力和增殖能力,与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.01）,在相同剂量下,紫杉叶素对大鼠心肌细胞H9C2的活力无明显影响,差异不具有统计学意义（P>0.05）。通过RNA-seq对差异基因进行富集,发现差异最显着的通路为MAPK通路,对该通路关键分子ERKs、JNKs、P38、Rac1的表达进行检测,发现TAX具有抑制MAPK通路的作用。结果显示增殖相关MITF、c-Myc均下调。分离细胞核后Western Blot检测到β-Catenin入核受到抑制,其现象与SP600125导致的入核减少相似。JNK促进剂茴香霉素可逆转TAX诱导的JNK蛋白下调现象。免疫荧光实验结果显示,ERK激活剂表皮生长因子并不能够逆转紫杉叶素抑制β-Catenin入核的现象,但β-Catenin激活剂氯化锂、JNK促进剂剂茴香霉素均能逆转该现象。CCK8实验显示表皮生长因子、氯化锂、茴香霉素均能翻转TAX抑制B16F10细胞活力的表型,确定TAX分别抑制ERK/c-Myc途径和JNK/β-catenin途径抑制增殖和迁移。通过进一步分析RNA-seq差异基因获取差异显着基因USP18,通过Western Blot对其表达进行验证。结合其功能对JNK的泛素化水平进行了验证,发现紫杉叶素使JNK的泛素化水平增加,促进其降解。构建USP18过表达质粒瞬时转染后加药处理,发现与单加药组JNK和Rac1的下调明显受到明显抑制,蛋白稳定性明显提高,提示TAX通过抑制USP18抑制Rac1及JNK的表达。体内实验发现紫杉叶素对荷瘤小鼠的黑色素瘤的体积和质量及骨转移有显着抑制作用,但对小鼠体重及脏器无明显影响,并抑制PCNA、Ki67的表达,此现象通过抑制MAPK/β-Catenin介导。结论:（1）紫杉叶素通过MAPK/β-Catenin通路抑制B16F10细胞增殖和迁移。（2）紫杉叶素通过抑制USP18调控Rac1/JNK/β-catenin轴。（3）紫杉叶素通过MAPK/β-Catenin通路抑制小鼠体内黑色素移植瘤生长和转移。
杨沐霖[2]（2021）在《杜鹃素衍生物HDF小鼠模型抗肿瘤活性和机制研究》文中进行了进一步梳理杜鹃素衍生物6,8-二甲基-7,4’-二甲氧基-5-羟基甲烷（HDF）是我组具有自主知识产权的专利化合物。前期研究发现HDF在细胞水平具有微管靶向的体外抗肿瘤活性。本研究在此基础上,以小鼠为模型动物,构建体内肿瘤模型,研究了HDF在小鼠体内的抗肿瘤活性。通过建立黑色素瘤B16细胞小鼠皮下移植瘤模型,采用腹腔注射药物的方式评价了HDF对模型小鼠肿瘤的抑制作用。并继续以He La细胞为模型在体外进一步探究了HDF可能的抗肿瘤机制。材料方法:1.以昆明种小鼠为模型,皮下移植小鼠黑色素瘤B16细胞;通过测定肿瘤体积和肿瘤重量来评价HDF对小鼠肿瘤的抑制作用;通过测定小鼠体重和各器官重量来评价HDF对小鼠基本体征影响;免疫组化实验评价HDF对小鼠肿瘤组织内Ki67、CD31、Bcl-2和Bax的表达的影响;TUNEL实验检测小鼠肿瘤组织细胞凋亡情况;通过对小鼠主要器官切片进行HE染色来探究HDF对小鼠正常组织器官的毒性。2.以HeLa细胞为对象,通过蛋白质组学和生物信息学分析研究HDF对细胞中各种蛋白表达的影响;免疫印迹实验验证了HDF对细胞NF-κB/Bcl-2凋亡通路中的蛋白表达影响;并通过q-PCR实验研究了HDF对Bax和Bcl-2转录水平的影响。结果:1.HDF对小鼠肿瘤有显着抑制作用,Ki67和CD31免疫组化结果表明HDF可以在小鼠体内抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤组织内血管生成。TUNEL实验结果表明HDF可以在体内促进肿瘤细胞凋亡。Bcl-2和Bax免疫组化结果表明HDF可以在体内通过下调Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白的表达促进细胞凋亡。HDF对小鼠体重和脏器系数无显着影响;小鼠主要器官HE染色结果表明,HDF对小鼠肝脏和肾脏具有一定毒性,而对其他器官未见显着毒性。2.在体外以HeLa细胞为实验对象,通过蛋白组学技术和生物信息学分析印证了HDF可以影响NF-κB信号通路和Bcl-2家族的蛋白表达;Western-blotting实验证明HDF可以通过调节NF-κB信号通路和Bcl-2/Bax蛋白的水平来促进细胞凋亡;q-PCR实验结果表明HDF在转录水平促进Bax基因的表达,抑制Bcl-2基因的表达。结论:HDF在体内表现出良好的抗肿瘤效果,可显着抑制小鼠肿瘤增长;其作用机制包括抑制肿瘤细胞增殖、转移、血管生成和通过调控NF-κB/Bcl-2凋亡通路促进肿瘤细胞凋亡。
涂丽裙[3]（2020）在《转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用》文中研究表明转化生长因子-β2（TGF-β2）对免疫应答有全方位的负调节作用,可调节几乎每一种适应性免疫应答和固有免疫应答的细胞,包括树突状细胞、T细胞、B细胞、粒细胞和固有免疫淋巴样细胞。使用免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的成功案例提示我们:抑制免疫抑制性细胞因子TGF-β2可能是一种新的策略去研制新型疫苗佐剂。为了研制出以核酸为基础的TGF-β2的抑制剂,我们设计了三个靶向人鼠的TGF-β2 m RNA3’UTR保守区域的反义寡核苷酸,并将其命名为TIO1,TIO2,TIO3。在小鼠巨噬细胞,人单核细胞及人浆细胞样树突状细胞,TIO1,TIO2及TIO3均明显下调TGF-β2的表达。在小鼠中,TIO3和TIO1,均可显着增强微生物疫苗所诱导的抗体反应。其中TIO3为佐剂的流感疫苗可抵抗流感病毒的攻击并减轻流感病毒引起的急性肺损伤。在小鼠中,TIO3可明显下调淋巴结及脾脏细胞CD4+T细胞及CD19+B细胞上s TGF-β2的表达,上调CD19+B细胞及CD11c+DC表面CD40,CD80,CD86,CD69及MHC II分子的表达,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,促进CD4+T细胞产生IL-4,抑制调节性T细胞（Tregs）的产生,促进CD4+T细胞和CD19+B细胞的增殖与活化,促进流感病毒感染的小鼠的肺脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面CD69的表达。总的来说,通过干扰TGF-β2的表达,TIO3或TIO1,可作为新型微生物疫苗佐剂增强疫苗诱导的抗体反应;此外,TIO3为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗可显着延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。TIO3可通过抑制人和小鼠的胶质瘤细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表达TGF-β2,诱生胶质瘤特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞,激活NK细胞,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,上调胶质瘤细胞表面MHCI分子的表达进而增强胶质瘤疫苗的抗肿瘤功效。单独应用TIO3可通过抑制胶质瘤细胞表达TGF-β2、促进胶质瘤细胞表达MHC I,IL-17A及IFN-α、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞表达s TGF-β2、抑制Tregs的产生、促进CD4+T细胞及CD8+T细胞的增殖而明显延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。单独应用TIO3可通过抑制胃癌细胞表达TGF-β2,促进MHC I,IL-13,IL-15,IL-17及IFN-γ的表达而显着减少肿瘤体积、延长胃癌背部移植瘤小鼠的生存期。TGF-β2的反义寡核苷酸有潜能作为微生物疫苗和肿瘤疫苗的新型佐剂,或单独治疗胶质瘤和胃癌的候选药物。
乔玉本[4]（2020）在《三株真菌和云实活性天然产物研究及Terrein生物合成研究》文中进行了进一步梳理本论文一共分为四章。前两章介绍了从发霉红木果内生真菌褶皱曲霉（Aspergillus rugulosus）、贯叶连翘（Hypericum perforatum L.）内生真菌Aspergillus sp.TJ23和海洋来源土曲霉（Aspergillus terreus）三株真菌以及传统药用植物云实（Caesalpinia decapetala）根部及叶片中分离得到的天然产物化学成分及其生物活性研究。第三章主要介绍了丝状真菌土曲霉代谢产物土曲霉酮（Terrein）的生物合成研究。第四章主要综述terrein的分离、生物活性、生物合成以及化学合成的研究进展。通过正相SiO2柱、Sephadex LH-20凝胶柱、ODS-C18反向中压柱、MCI柱,薄层色谱TLC,半制备HPLC等分离技术,结合400 MHz,600 MHz NMR核磁解析、HRESIMS分析、IR与UV光谱、量子化学ECD计算、以及X-ray单晶衍射等现代天然产物研究手段,本研究从上述三株真菌及云实代谢产物中共分离鉴定了93个化合物,其中包括29个新化合物。化合物的结构类型主要为聚酮、二萜、杂萜、甾体、木脂素及醌类等。第一章中,体外生物活性评价结果显示新骨架化合物1对使用抗CD3/CD28单克隆抗体刺激的小鼠脾细胞和人外周血T淋巴细胞具有极强免疫抑制活性,其作用浓度为n M级;化合物5具有较强的BACE1抑制活性,其IC50值为11.42μM;化合物6可能为PBP2a的潜在抑制剂,并且能够协同增强β-lactam类抗生素oxacillin和piperacillin的抗MRSA作用,MIC值为1μg/m L,协同增效值∑FIC小于0.5;反向对接虚拟筛选,结合MST实验提示化合物6潜在靶点为PBP2a;透射电镜TEM观测结果表明化合物6直接影响MRSA细胞形态;化合物8体外显示出较好的降糖活性,其降糖作用强于阳性药二甲双胍;通过对差异基因KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析、GO（Gene Ontology）功能富集、蛋白互作网络分析以及q T-PCR验证,发现化合物8通过激活胰岛素通路发挥降糖作用,其靶基因可能为FGF21,并且化合物8能剂量依赖性地激活该基因的表达;第二章中,化合物9和10为一对不可分离的差向异构体,其转变机制可能为分子内半缩醛反应;生物学活性研究实验表明化合物1、4、5、7和14在体外显示具有较强抑制肿瘤细胞SW1990增殖的活性,他们的IC50值在2.9–8.9μM之间;化合物11则表现出较强的抗菌活性,其抗菌MIC50值为5.990μg/m L。第三章生物合成研究,通过在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae BJ5464）和构巢曲霉（Aspergillus nidulans LO8030）中异源表达土曲霉terrein生物合成簇中相关基因的g DNA和c DNA得到异源表达产物;综合应用LC-MS、NMR等手段确定产物结构;结合真菌遗传敲除,突变株喂养以及在大肠杆菌（Escherichia coli Top10,BL21,Rosetta）中表达纯化相关蛋白、化学衍生底物以及体外生化等实验证明terrein生物合成中涉及一个或者多个不稳定中间体;确定了FAD依赖蛋白Ter C为下一步关键基因,并根据实验结果推测了下游合成路径。
雷莉[5]（2020）在《短肽自组装纳米材料的构建及其生物分析应用》文中认为短肽因其结构简单、可调、功能多样、成本较低等优点,在生物纳米技术领域备受关注。基于短肽自组装构建的纳米材料具有简单的制备工序、良好的生物相容性、较大的比表面积、易于修饰改造、较深的组织渗透性以及较高的生物活性等优势,已经成为生物催化、药物/基因控制释放、功能材料以及临床治疗等领域的热点研究对象。通过合理设计短肽分子结构以及给予特定的环境刺激,短肽可以通过多重非共价键相互作用自发的组织或聚集为具有特异形态和功能的纳米结构。短肽优越的生物化学性能为各种疾病的研究、诊断和治疗提供了重要的分子工具,十分有利于智能、仿生、多价、功能纳米材料的构建。作为生物同源的创新生物材料,短肽自组装纳米材料与荧光分析相结合有益于多功能荧光纳米探针的构建。这些短肽荧光纳米探针在生物分析应用中具有特异靶向性、高选择性、高稳定性、高灵敏度、准确快速、比率型响应、高生物安全性以及生物降解性等特点,在复杂的生物体系中表现着巨大的应用前景。阿尔兹海默病（AD）与恶性肿瘤等疾病具有难以预防、治愈、甚至减缓等特点,是人类生命健康的杀手,它们病理机制的研究已经成为当前生命分析领域的研究热点。研究表明这些疾病的病理机制与多种活性物质密切相关。生物分子唾液酸作为肿瘤标志物,在肿瘤的恶性转化与转移中常出现过表达的现象。此外,AD患者脑中唾液酸可促进β-淀粉样蛋白（Aβ）在神经元细胞膜表面发生构象转变并聚集为毒性寡聚体,形成老年斑。而Aβ蛋白沉积斑作为AD的重要病理特征,斑块中存在着高浓度的过渡金属离子,它们通过催化氧化损伤诱发AD。同时,Aβ与金属离子之间的氧化还原反应产生的大量活性氧活性氮自由基,可引起氧化应激进而导致AD的发生。因此,疾病病理机制中各类活性物质的分析研究极为重要。然而,已有分析方法中仍然存在许多挑战:1、生物环境复杂且成分多,存在大量干扰物质,并且活性物质的浓度较低,检测十分困难;2、AD的病理同时涉及多种分子,且各组分之间存在交叉反应;3、活体组织微环境的动态变化易干扰检测信号,导致检测结果不准确;4、普通纳米材料的毒性高、靶向性差、摄取效率低、组织渗透性浅且易影响活细胞与活体组织的生物活性,难以实现疾病高效精准的治疗。针对这些问题,从根本上需要解决的是:提高检测方法的灵敏度、靶向性及选择性,发展多个活性分子的联合检测,制备特异性响应的比率型探针,改善探针的稳定性与生物相容性,建立准确快速、检测限低的分析方法。因此,本论文设计合成了多重响应的短肽分子,通过将荧光分子引入短肽的自组装,构建了多功能短肽荧光纳米探针。利用短肽自组装纳米材料的结构可控、易修饰以及生物兼容性等独特的性质,我们将其与荧光分析法结合,实现了:1、肿瘤相关活性分子的靶向成像分析与精准联合诊疗;2、生物体中活性分子之间相互作用的准确快速分析及活性物质的灵敏选择性检测;3、活细胞与活体中两种生物离子的同时比率型检测与成像;4、复杂体系中两种活性物质对AD病理毒性的同时分析研究。具体说来,本论文主要有六个方面的内容:第一章绪论本章首先介绍了短肽、自组装、构建策略及短肽自组装的应用发展。接着概述了AD与恶性肿瘤的简介及相关活性物质的研究,并阐述了AD与恶性肿瘤的诊疗研究进展。最后简述了本论文的研究目的、设计构思、研究内容与创新点。第二章唾液酸靶向的仿生多价肽纳米管用于转移性黑色素瘤的成像及联合治疗本章设计并制备了唾液酸（SA）靶向的仿生多价肽纳米管（I/S-PPNT）用于肿瘤的精准靶向与联合诊疗。首先调控化疗药物（SN38）与短肽KLVFFAL的组装合成了纳米管,然后进一步修饰苯硼酸（PBA）与吲哚菁绿（ICG）获得智能纳米管I/S-PPNT。利用茜素红荧光变化分析了肽纳米管与SA的结合常数为794 M-1,该新型多价纳米管对SA具有较强的亲和力,为I/S-PPNT精确地靶向肿瘤细胞实现成像引导的联合治疗奠定了基础。之后,将I/S-PPNT用于细胞与活体中,I/S-PPNT特异性靶向B16-F10黑色素瘤细胞表面过表达的唾液酸,表现出较高的细胞识别与摄取能力;在C57BL/6小鼠模型中,I/S-PPNT特异性积累并深入渗透到皮下和肺转移性B16-F10黑色素瘤中,利用其化学-光动力联合治疗作用实现了肿瘤转移的抑制与根除。第三章糖肽纳米纤维用于Aβ-唾液酸相互作用分析及Aβ高灵敏度检测本章受到细胞表面团簇的唾液酸（SA）的启发,设计合成了SA功能化短肽分子并自组装为糖肽纳米纤维（SANF）,实现了Aβ-SA相互作用机制的分析与Aβ1–40的灵敏检测及其聚集过程的监测与其抑制剂的筛选。通过荧光滴定法分析了SANF与Aβ不同片段的亲和力,结果显示为:Aβ1–16>Aβ24–40>Aβ16–23,表明SA与Aβ肽序列中不同氨基酸位点结合。之后将全长的Aβ1–40加入该体系,由于SA与Aβ1–40的多位点结合,使得体系荧光被激活,从而构建了荧光“Turn-on”的生物传感平台,实现对Aβ1–40单体的选择性、高灵敏度检测。此外,该方法成功地用于胎牛血清样品中Aβ1–40单体的分析,并得到与标准ELISA方法相当的回收率。该方法进一步成功地用于Aβ1–40聚集的监测及抑制剂筛选。本章的方法为糖肽纳米材料的设计及其在其他生物分子的分析检测提供了新的思路。第四章自组装多功能肽对生物金属离子的比率型成像本章利用组装技术设计并制备了具有Zn2+与Cu2+特异性响应的多功能肽纳米带荧光探针,实现了活细胞与活体中Zn2+与Cu2+的比率型分析与成像。首先将功能单元喹啉衍生物（AQZ）引入短肽KLVFFAL分子的侧链,与之共组装制备了纳米带,进一步修饰近红外量子点（QDs）与内参比分子Alexa 633,合成了多种金属离子比率型响应的肽纳米带（Al@AQZ@QDs@NR）。该多功能纳米探针在单一激发波长下,表现出三个独立的荧光发射,成功实现了对Zn2+、Cu2+或Zn2+与Cu2+的比率型检测。基于优异的生物相容性,该纳米探针成功地应用于活细胞与斑马鱼内Zn2+和Cu2+的多色荧光成像与检测,并进一步用于一氧化氮刺激下细胞内Zn2+和Cu2+的成像。这对我们了解Zn2+和Cu2+在细胞与体内的分布,以及理解高浓度Zn2+和Cu2+的神经毒性具有重要的意义,有利于AD的临床诊断与治疗。第五章多功能肽组装胶束用于Aβ沉积与活性氧的同时清除研究本工作利用双谷胱甘肽（tk-GSH）与功能短肽分子（LD与TK）设计合成了肽-聚合物,通过自组装制备了可调控细胞自噬的多功能纳米胶束（MPGLT）,实现了β-淀粉样蛋白(Aβ1–42)沉积与活性氧（ROS）的同时清除研究。首先将tk-GSH与短肽LD、TK同时偶联于聚唾液酸中,然后自组装形成MPGLT。因其表面的LD（LPFFD）肽衍生于Aβ短肽的核心序列,能够识别与结合Aβ1–42,将Aβ1–42聚集体解离;tk-GSH中的酮缩硫醇（tk）键在ROS存在下被还原,释放出两倍的GSH,具有更强的还原性。因此该纳米胶束利用TK自噬肽诱导细胞自噬上调,结合Aβ1–42后快速进入细胞,还原细胞内ROS,实现两者的同时清除。并表现出良好的生物相容性,可有效降低Aβ1–42与ROS的神经毒性。第六章总结与展望本章首先对此论文的主要研究工作进行逐一总结,接着将论文的创新点与研究意义作了概括。最后阐述了与本研究方向相关的展望与设想。
梁敬[6]（2020）在《基于S1P/S1PR1/STAT3信号通路的白藜芦醇抗小鼠黑色素瘤细胞B16F10侵袭转移的作用》文中指出目的:探讨白藜芦醇对肿瘤微环境下小鼠黑色素瘤细胞B16F10侵袭转移的抑制作用及其机制。方法:1)将小鼠黑色素瘤细胞B16F10用不同浓度的白藜芦醇（25μM、50μM、100μM、200μM、400μM）处理24小时后,运用CCK8实验检测白藜芦醇对小鼠黑色素瘤细胞B16F10增殖抑制;运用CCK8实验检测白藜芦醇对肿瘤微环境下小鼠黑色素瘤细胞B16F10的增殖抑制;收集小鼠单核巨噬细胞Raw264.7的上清作为条件培养基培养B16F10细胞,模拟肿瘤微环境,伤口愈合实验与Transwell侵袭实验检测B16F10细胞迁移和侵袭能力;Western blot检测B16F10细胞中肿瘤相关蛋白E-cadherin与Vimentin的表达及通路蛋白p-STAT3的表达。2)B16F10细胞分别转染S1PR1质粒与S1PR1 siRNA,过表达和敲低细胞中S1PR1的表达;伤口愈合实验与Transwell侵袭实验检测B16F10迁移和侵袭能力;Western blot实验检测B16F10细胞中通路蛋白S1PR1与p-STAT3的表达。3)Raw264.7细胞转染过表达S1PR1蛋白的病毒载体,收集培养上清,制备条件培养基。条件培养B16F10细胞24小时,收集细胞尾静脉注射B16F10细胞,建立小鼠肺转移模型。造模第一天开始,灌胃给予白藜芦醇100mg/kg,每天2次,共21天;末次给药后,脊椎脱臼处死,取肺组织,统计肺转移灶,拍照。Western blot实验检测小鼠肺组织中肿瘤相关蛋白E-cadherin、Vimentin、Twist与Snail的表达。结果:1)CCK8结果显示,白藜芦醇对B16F10细胞的增殖具有抑制作用,并具有剂量依赖的特点;浓度低于100μM,白藜芦醇对条件培养B16F10细胞的增殖抑制不显着,故本实验选取25μM、50μM、100μM三个浓度的白藜芦醇进行研究。伤口愈合实验及Transwell侵袭实验实验表明,与空白对照组比较,条件培养组B16F10细胞的迁移与侵袭能力增强,经白藜芦醇处理后,细胞的迁移与侵袭能力下降。Western blot结果显示,与空白对照组相比,条件培养组细胞中E-cadherin表达下降,Vimentin表达升高,但经白藜芦醇处理后,E-cadherin表达升高,Vimentin表达降低。2)伤口愈合实验及Transwell侵袭实验实验表明,S1PR1的敲低降低了B16F10细胞迁移与侵袭能力,经白藜芦醇处理后,B16F10细胞迁移进一步的下降;S1PR1的高表达增加了B16F10细胞迁移与侵袭能力,而白藜芦醇抑制了这种现象。Western blot结果显示,白藜芦醇抑制了条件培养组细胞p-STAT3的表达的升高;而在机制研究中发现,与空白对照组比较,S1PR1敲低组细胞中p-STAT3的表达下降;S1PR1过表达组p-STAT3的表达升高,经白藜芦醇处理后,p-STAT3的表达降低;3)解剖小鼠发现,与空白对照相比,条件培养组小鼠肺转移结节增多,给予白藜芦醇治疗后,小鼠肺转移结节数量减少。Western blot结果显示,与空白对照组比较,条件培养组小鼠肺组织中的Vimentin、Twist与Snail表达升高,E-cadherin的表达下降;给予白藜芦醇治疗后,Vimentin、Twist与Snail表达降低,E-cadherin蛋白的表达上升。结论:通过构建体内外侵袭转移模型,白藜芦醇对肿瘤微环境中B16F10细胞的侵袭转移具有抑制作用,并且其可能是通过S1P/S1PR1/STAT3信号发挥作用。
周加宁[7]（2020）在《mTOR和PRAK抑制剂的抗肿瘤转移作用》文中进行了进一步梳理目的远端转移是肿瘤致死最重要原因,迄今仍无有效的干预手段。m TOR抑制剂作为新型抗肿瘤靶向药物近年来受到越来越多关注,但它在肿瘤转移预防中的应用尚缺乏充分研究。PRAK是本实验室前期鉴定的一种新的、可能用作转移干预的靶点。本研究旨在评价m TOR抑制剂雷帕霉素和PRAK抑制剂XZP-0353对肿瘤转移的影响,为其临床应用奠定基础。方法首先,分别通过脾内注射建立肿瘤肝转移模型和尾静脉注射建立肺转移模型,测试不同化合物以及不同给药途径对黑色素瘤转移的影响,并通过HE染色作病理验证。其次,在体外培养体系中,通过MTT实验、划痕实验、Transwell实验检测药物对黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响,并应用Western blot分析抑制剂对下游关键分子活化情况和表达水平的影响。结果在肝转移模型中,m TOR抑制剂雷帕霉素能够显着减少肝内肿瘤转移灶的形成。与此相一致,体外实验表明雷帕霉素对肿瘤细胞迁移和侵袭均有明显抑制作用,且抑制效应具有剂量依赖性。在肺转移模型中,腹腔给予PRAK抑制剂XZP-0353导致肺内转移灶形成减少,较好地重现了PRAK基因敲除所致的转移能力丧失。肌肉注射获得了类似的结果。但令人惊讶的是,灌胃和静脉给药几乎完全没有效果。检测血浆中药物浓度,我们发现不同给药方式下血药浓度相差无几,提示药效差异与吸收无关。进一步,我们测试了不同途径给药检后血清中PRAK抑制相关活性,也未见明显差异。结论雷帕霉素能够抑制黑色素瘤的肝转移,该效应可能与肿瘤细胞迁移和侵袭能力降低有关。对于PRAK抑制剂XZP-0353,不同的给药方式显着影响它的抗肿瘤转移作用,原因尚不清楚,但显然与药物吸收无关。上述结果对这两类抑制剂的进一步研发有一定的指导意义。
李昕[8]（2019）在《表达RGD和MEL基因重组减毒沙门氏菌的构建及其对黑色素瘤的靶向治疗作用》文中研究表明黑色素瘤（melanoma）是死亡率极高的皮肤恶性肿瘤,在兽医临床上常见于老龄动物,在全球范围内发病率呈逐年上升趋势。其特点是恶性程度高、进展快、易远处转移,是一种对常规治疗药物具有较强的抗性,在临床治疗过程中颇为棘手的恶性肿瘤,对食品卫生和公共安全构成极大的危害。随着分子生物学、免疫学及相关学科的发展,基因治疗逐渐显示出巨大的优势,现已成为肿瘤治疗研究的热点。黑色素瘤作为一种浅表性肿瘤,非常适用于基因治疗的观察和研究。实体瘤中因存在局部免疫抑制、缺氧、血液供应不足、坏死区等,使肿瘤微环境中形成免疫逃逸现象,导致化疗药物无法顺利到达并发挥治疗作用,但却为一系列厌氧菌及兼性厌氧菌提供了有利的生长环境。这一发现预示某些细菌可能成为新型的肿瘤基因治疗载体。目前,影响肿瘤基因治疗效果的两大关键因素是治疗载体系统和治疗基因的选择。因此,寻找合适的靶向性载体和治疗基因是肿瘤基因治疗的核心,同时也是本课题的研究目的及科学意义所在。肿瘤靶向肽（RGD）是细胞外基质与细胞整合素αvβ3之间结合的强效竞争性拮抗剂,常被用作肿瘤靶向标记物。蜂毒肽（MEL）是蜂毒中具有药理作用和生物学活性的主要组分,在抑制肿瘤细胞转移和侵袭方面具有显着功效。为探索融合表达肿瘤靶向肽（RGD）和蜂毒肽（MEL）双基因重组减毒沙门氏菌对小鼠黑色素瘤的抑瘤作用,本试验构建了重组沙门氏菌LH430/pEGFP-RGD-MEL,通过侵染体外培养的小鼠黑色素瘤B16细胞,使目的基因在B16细胞中高效表达。通过CCK-8法、Western Blotting、扫描电镜以及流式细胞术等方法,检测重组减毒沙门氏菌对B16的细胞凋亡和抑制作用。CCK-8检测结果显示,LH430/pEGFP-RGD-MEL对体外B16细胞的抑制率较高,且具有剂量和时间依赖性,其IC50值（6.02×105 CFU/μL）远低于HEK293细胞（5.39×107CFU/μL）;Western Blotting检测结果显示,重组减毒沙门氏菌诱导B16细胞表达凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bcl2和Bax的量显着增多（p<0.05）;扫描电镜下观察显示,B16细胞发生严重的形态学病变,出现较多突起,伪足消失;流式细胞术检测结果显示,重组减毒沙门氏菌可促进肿瘤细胞凋亡,B16细胞的存活率为24.7±5.81%。通过细胞划痕试验、Transwells法检测重组减毒沙门氏菌对B16细胞迁移、趋化和侵袭能力的影响。结果显示,LH430/pEGFP-RGD-MEL可以抑制B16细胞的迁移,并可显着抑制FBS介导的细胞趋化能力（p<0.05）,对B16细胞的侵袭能力也具有抑制作用,虽然与对照组之间没有表现出显着性差异（P=0.0507）。试验中成功建立了荷黑色素瘤小鼠动物模型,瘤内注射LH430/pEGFP-RGD-MEL（首次注射量1×105 CFU/只;二次注射量1×106 CFU/只）后,对荷瘤小鼠的体重和瘤体积进行阶段性测量,通过生物成像检测各器官报告基因的表达与分布状况,结果表明,肿瘤处荧光表达量高于其他组织。当肿瘤大小超过体重的5%时,处死小鼠,取肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑等组织,分别进行荧光蛋白表达检测、TUNEL染色、HE染色、免疫组化试验及Q-PCR检测。结果发现,LH430/pEGFP-RGD-MEL治疗组可以有效抑制小鼠肿瘤体积的增大,小鼠生存期显着延长,体重没有显着下降（p<0.05）。通过对各组小鼠肝脏、肾脏和肿瘤组织观察和重量测定结果显示,LH430/pEGFP-RGD-MEL的抑瘤率高达90.84±8.11%,极显着高于RGD-MEL肽和MEL肽组;与LH430/pEGFP-MEL、LH430/pEGFP和顺铂组抑瘤率之间虽然没有差异显着性,但对小鼠内部器官的损伤明显低于这三个治疗组（p<0.01）。同时,经生物成像检测和Q-PCR检测结果显示,LH430/pEGFP-RGD-MEL靶向性较好;经冰冻切片观察显示,LH430/pEGFP-RGD-MEL治疗组小鼠肿瘤组织中外源荧光蛋白得到表达;组织HE染色结果发现,LH430/pEGFP-RGD-MEL治疗组小鼠肝脏、肾脏和肺等组织器官无明显的病变和肿瘤转移现象,肿瘤组织出现膜样结构,易剥离;免疫组织化学检测结果显示,LH430/pEGFP-RGD-MEL治疗组肿瘤组织中Caspase-3、P53、GFP表达量显着增高;TUNEL染色结果显示,LH430/pEGFP-RGD-MEL治疗组小鼠肿瘤组织细胞凋亡率达48.31±1.26%,显着高于对照组（p<0.05）。为了探究重组减毒沙门氏菌治疗黑色素瘤的抑瘤机制,对瘤组织进行了RNA-seq研究。试验结果表明,LH430/pEGFP-RGD-MEL治疗组与PBS组相比,差异基因主要富集于机体免疫和肿瘤相关通路,通过破坏肿瘤组织中的免疫逃避,激活肿瘤组织内的T细胞免疫应答来发挥抑瘤作用。本试验成功构建了携带RGD-MEL双基因的减毒沙门氏菌LH430,可稳定传代,能够在体外有效传递和表达目的基因及蛋白。经体外试验验证,LH430/pEGFP-RGD-MEL可促进细胞凋亡,对B16细胞的增殖、迁移和趋化有较强的抑制作用。经荷瘤小鼠模型体内试验验证,LH430/pEGFP-RGD-MEL瘤内注射免疫荷瘤小鼠后,可在体内高效、稳定表达目的基因及蛋白,对肿瘤的靶向性较好,对机体其他组织器官伤害较小。试验证明了重组减毒沙门氏菌在肿瘤动物模型内的表达规律及其对黑色素瘤的靶向治疗作用,为比较医学和人类肿瘤基因治疗提供新的研究思路和方法。
陈永强[9]（2019）在《肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）诱导CD4+T细胞分化及其免疫调节功能的机制研究》文中研究说明肿瘤微环境中肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用促进肿瘤免疫逃逸或炎症反应。近年来我们课题组证实,在肿瘤微环境中存在一种新型的LC-3II阳性的细胞外囊泡（LC-3II+Extracellular Vesicles,LC-3II+EVs）,主要来源于肿瘤细胞释放的分泌型自噬小体,我们将其命名为肿瘤细胞释放自噬小体（tumor cell released autophagosome,TRAP）。后续研究发现TRAPs携带的损伤相关的分子模式（damage associated molecular patterns,DAMPs）可以诱导B细胞、单核/巨噬细胞和中性粒细胞成为具有免疫抑制功能的IL-10+Breg细胞、PD-L1highIL-10+M2型巨噬细胞和产生大量ROS的中性粒细胞。CD4+T细胞是机体重要的抗肿瘤免疫细胞之一,目前关于CD4+T细胞亚群在肿瘤微环境中的分化机制及其免疫调节功能尚不完全清楚。因此本论文主要探讨TRAPs是否参与CD4+T细胞的分化和免疫调节,值得深入研究。目的:探讨TRAPs诱导CD4+T细胞分化及其免疫调节功能的机制研究,旨在阐明肿瘤微环境中―TRAPs—CD4+T细胞—肿瘤免疫微环境‖之间的免疫调控网络,为后期肿瘤免疫治疗提供新的靶点或治疗思路。方法:1.肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）体内外诱导CD4+T细胞分化的研究分选出WT小鼠脾细胞来源的CD4+T细胞,体外在αCD3/CD28培养条件下加入不同浓度的TRAPs分别诱导培养24 h或72 h后,收获细胞和培养上清,采用qRT-PCR和流式细胞术检测CD4+T细胞各亚群标志分子表达变化;ELISA检测培养上清中细胞因子的变化。C57BL/6小鼠尾静脉注射TRAPs或皮下注射B16F10细胞构建荷瘤小鼠,流式细胞术检测各组小鼠脾脏和淋巴结中IL-6+CD4+T、IL-10+CD4+T和IL-21+CD4+T细胞的比例变化。2.TRAPs诱导CD4+T细胞分化的分子机制研究分选WT小鼠脾细胞来源的CD4+T细胞,体外在αCD3/CD28培养条件下加入不同浓度的CFSE标记的TRAPs共孵育24 h后,激光共聚焦荧光显微镜观察CFSE标记的TRAPs与PE标记的CD4+T细胞或PE标记的TLR2的相互作用;流式细胞术检测CFSE-TRAP+CD4+T细胞比例。分选出WT、TLR2-/-、TLR4-/-、MyD88-/-和IL-6-/-CD4+T细胞,加入TRAPs（3μg/ml）诱导培养72 h后,ELISA检测培养上清中IL-6、IL-10和IL-21的浓度;分选WT CD4+T细胞,加入TRAPs（3μg/ml）诱导不同的时间,或用信号分子抑制剂或IL-6中和抗体等预处理1 h,Western Blot检测MAPKs信号通路中（JNK、ERK和p38）、NF-κB通路中（IKKα/β、IκBα和p65）、Akt或STAT3及其磷酸化水平;qRT-PCR和ELISA法检测CD4+T细胞IL-6、IL-21和IL-10的表达变化。将WT和IL-6-/-小鼠分别尾静脉注射TRAPs,检测脾脏和淋巴结中IL-21+CD4+T细胞和IL-10+CD4+T细胞比例变化。分选小鼠脾细胞来源的或人PBMCs中来源的CD4+T细胞,体外在αCD3/CD28培养条件下加入小鼠或人肿瘤细胞来源的TRAPs或预处理的TRAPs（超声破碎、蛋白酶K消化、抗体封闭或CFSE染色）分别诱导相应的时间后,分别检测CD4+T细胞中信号分子活化情况、IL-6表达和分泌水平。3.TRAPs诱导的CD4+T细胞(TTRAP)免疫调节功能的研究3.1 TTRAP细胞调节T细胞应答及其对肿瘤生长和转移的研究分选WT小鼠脾细胞来源的T细胞,在αCD3/CD28培养条件下,分别加入30%体积的正常培养CD4+T细胞上清（SN/CD4+T）和TRAPs诱导的CD4+T细胞上清(SN/TTRAP)或用IL-6、IL-10和IL-21中和抗体预处理的SN/TTRAP,培养72 h后,FACS检测IFN-γ+CD4+T和IFN-γ+CD8+T细胞比例。皮下免疫DC/OVA疫苗建立OVA特异性T细胞应答的小鼠模型或在免疫前过继转移OT-I小鼠脾细胞,免疫间隙过继转移CD4+T或TRAP诱导的CD4+T细胞,在末次免疫后第7天,收获各组小鼠的脾脏细胞,流式细胞术检测OT-I T细胞的比例及数量;或用OVA蛋白再刺激24 h,测脾细胞中IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例。WT C57BL/6小鼠皮下或尾静脉注射B16F10细胞构建皮下和肺转移瘤模型,同时注射正常培养的WT CD4+T细胞和TRAPs诱导的WT CD4+T细胞或IL-6-/-CD4+T细胞,观察皮下肿瘤大小和肺组织上肿瘤结节数量及大小。3.2 TTRAP细胞调节B细胞分化及其对肿瘤生长和转移的研究WT C57BL/6小鼠尾静脉注射TRAPs诱导的CD4+T细胞,流式细胞术检测脾细胞中IL-10+B细胞的比例和数量。分选脾细胞来源的B细胞,单独或联合加入TRAPs、CD4+T细胞、SN/CD4+T、SN/TTRAP或分别用αIL-6、αIL-10和αIL-21预处理的SN/TTRAP培养72h后,检测各组IL-10+B细胞比例和IL-10的浓度。皮下免疫DC/OVA疫苗,建立OVA特异性T细胞应答小鼠模型或者在免疫前过继转移OT-I小鼠脾细胞,免疫间隙过继转移不同条件诱导的B细胞3次,在末次免疫后第7天,收获各组小鼠的脾脏细胞,采用流式细胞术检测OT-I T细胞的比例及数量;或用OVA蛋白再刺激24 h,流式细胞术检测脾细胞中IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例。WT C57BL/6小鼠皮下或尾静脉注射B16F10细胞构建皮下和肺转移瘤模型,同时注射不同条件诱导的B细胞,观察皮下肿瘤大小和肺组织上肿瘤结节数量及大小。3.3体内抑制TRAP或Il6对CD4+T细胞和B细胞分化及肿瘤生长的研究利用慢病毒敲低自噬相关基因Becn1,构建自噬缺陷B16F10小鼠黑色素瘤细胞株,收集相同Becn1 KD和Becn1 NC B16F10细胞数量来源的培养上清,采用Western blot检测上清中TRAPs的含量;ELISA检测两组上清体外诱导CD4+T细胞分泌IL-6、IL-10和IL-21的量。Becn1 KD和Becn1 NC B16F10细胞皮下构建荷瘤小鼠,观察两组细胞体内生长速度差异;流式细胞术检测两组荷瘤小鼠肿瘤组织和淋巴结中IL-10+CD4+T细胞、IL-21+CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞和IL-10+B比例变化;ELISA检测外周血中IL-6含量。将WT和IL-6-/-小鼠皮下接种B16F10细胞生长至第21 d后,测量肿瘤体积大小;流式细胞术检测各组小鼠淋巴结和肿瘤组织中IL-10+CD4+T细胞、IL-21+CD4+T细胞和IL-10+B比例变化。结果:1.肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）体内外诱导CD4+T细胞分化的研究体外检测结果显示,TRAPs可以显着诱导CD4+T细胞高表达Il6和Il21,同时Il10和Il17的表达也有一定比例的升高,其它基因Il1b、Il2、Il4、Il8、Il9、Il22.、Ifng、Tnf、Tgfb1和Foxp3 mRNA表达变化不明显;与mRNA表达水平一致,TRAPs处理组IL-6、IL-10和IL-21的分泌量及IL-6+CD4+T、IL-10+CD4+T和IL-21+CD4+T细胞比例显着高于对照组,同时IL-21+CD4+T细胞表达Tfh细胞表型CXCR5和特异性转录因子Bcl6。与之相反,TRAPs处理组中IFN-γ+CD4+T细胞的比例显着降低,另外还发现TRAPs体外可以抑制IL-12诱导的CD4+T细胞向Th1细胞方向极化。体内检测结果显示,与荷瘤小鼠体内结果一致,TRAPs体内也可以诱导小鼠脾脏和淋巴结中IL-6+CD4+T、IL-10+CD4+T和IL-21+CD4+T细胞的比例的增高。以上结果证实TRAPs在体内外可以诱导CD4+T细胞分泌IL-6、IL-10和IL-21。2.TRAPs诱导CD4+T细胞分化的分子机制研究首先,TRAPs不能被CD4+T细胞所摄取而是结合于细胞表面发挥功能;TRAPs诱导WT和TLR4–/–CD4+T细胞分泌IL-6、IL-10和IL-21的水平显着增加,而在TLR2–/–和MyD88–/–CD4+T细胞中IL-6、IL-10和IL-21的分泌量变化不明显;激光共聚焦显微镜检测结果显示TRAPs与CD4+T细胞表面的TLR2受体共定位,提示TRAPs通过TLR2-MyD88信号通路诱导CD4+T细胞分泌IL-6、IL-10和IL-21。随后,Western blot检测结果显示,TRAPs处理30-120min范围内CD4+T细胞中IKKα/β、I-kBα、p65、Akt、p38和STAT3的磷酸化水平显着增加,而ERK1/2和JNK1/2的磷酸化水平变化不明显,提示TRAPs可以活化CD4+T细胞中NF-κB、PI3K/Akt、p38和STAT3信号通路。当用相关抑制剂预处理后,NF-κB抑制剂Bay11-7082、PI3K抑制剂LY294002和p38抑制剂SB203580可以显着抑制IL-6,IL-10和IL-21的分泌,特别是Bay11-7082;而ERK抑制剂PD98059和JNK抑制剂SP600125对IL-6,IL-10和IL-21分泌均没有影响;STAT3抑制剂static可以显着抑制TRAPs诱导CD4+T细胞中STAT3的磷酸化水平及其IL-10和IL-21的分泌,而IL-6的分泌不受影响,说明TRAPs通过NF-κB、PI3K/Akt和p38信号通路诱导CD4+T细胞分泌IL-6,IL-10和IL-21,而IL-10和IL-21的分泌又受到STAT3进一步调控。最后体外检测发现,IL-6中和抗体可以显着抑制TRAPs诱导CD4+T细胞STAT3的磷酸化和IL-10和IL-21的分泌;同时,STAT3磷酸化、IL-10和IL-21表达和分泌在TRAPs诱导IL-6–/–CD4+T细胞中不发生明显变化;与体外结果一致,TRAPs体内诱导IL-6–/–C57BL/6小鼠淋巴结和脾脏细胞中IL-21+CD4+T细胞和IL-10+CD4+T细胞的比例显着低于WT C57BL/6小鼠组。以上结果说明,TRAPs体内外通过TLR2-MyD88-NF-κB信号通路诱导CD4+T细胞分泌IL-6,然后自分泌的IL-6再通过IL-6/STAT3通路进一步诱导IL-10和IL-21的分泌。B16F10、EL4、Hepa1-6和LLC细胞来源的TRAPs体外均可以诱导CD4+T细胞表达和分泌IL-6。用超声破碎或蛋白酶K消化后的TRAPs诱导CD4+T细胞表达和分泌IL-6的量显着降低,提示TRAPs主要是通过膜表面蛋白而非内容物发挥功能。当TRAPs分别用HSP60、HSP70、HSP90α和HMGB1封闭抗体封闭后,仅有HSP90α封闭抗体可以显着抑制TRAPs与CD4+T细胞的结合、胞内信号通路的活化以及IL-6的表达和分泌,提示TRAPs膜表面上HSP90α是诱导CD4+T细胞表达和分泌IL-6的功能分子。与小鼠肿瘤细胞来源的TRAPs结果相一致,临床肿瘤患者癌性胸/腹水或人肿瘤细胞（A375、MDA-MB-231和HepG2）来源的hTRAPs也可以显着诱导人外周血来源CD4+T细胞表达和分泌IL-6,当hTRAPs经HSP90α封闭抗体预处理后,CD4+T细胞表达和分泌IL-6的量也显着降低。以上结果说明,HSP90α是小鼠和人肿瘤细胞来源TRAPs诱导CD4+T细胞分泌IL-6的关键膜分子。3.TRAPs诱导的CD4+T细胞(TTRAP)免疫调节功能的研究3.1 TTRAP细胞调节T细胞应答及其对肿瘤生长和转移的研究T细胞功能实验结果显示:与对照组和正常培养的CD4+T细胞培养上清（SN/CD4+T）组相比,TRAPs诱导的CD4+T细胞培养上清(SN/TTRAP)可显着抑制体外αCD3/αCD28单抗刺激的CD4+T和CD8+T细胞IFN-γ的分泌;同时,TRAPs诱导的CD4+T细胞(TTRAP)体内也可以显着抑制DC/OVA诱导的OT-I T细胞的增殖以及IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例,提示我们CD4+T细胞经TRAPs诱导后可以抑制αCD3/αCD28非特异性和DC/OVA特异性诱导T细胞的免疫应答。另外,皮下瘤和肺转移瘤模型检测结果显示,TRAPs诱导的CD4+T细胞体内可以促进小鼠B16F10黑色素瘤细胞的生长与肺转移。抗体中和实验显示:与SN/TTRAP组相比,αIL-6预处理的SN/TTRAP组IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例显着提高,而αIL-10与处理组仅可以略微升高IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例,当αIL-6和αIL-10两种抗体联合预处理后,IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例可以完全恢复,说明TRAPs诱导的CD4+T细胞主要依赖分泌IL-6发挥T细胞功能抑制作用。与上述结果一致,TRAPs诱导的WT CD4+T细胞体内可以促进小鼠B16F10黑色素瘤的生长和肺肿瘤结节数目的增加,而TRAPs诱导的Il6-/-CD4+T细胞体内对小鼠B16F10黑色素瘤的生长和肺肿瘤结节数目不但没有促进作用,相反还具有一定的抑制肿瘤生长和肺肿瘤结节数。以上结果提示我们TRAPs诱导CD4+T细胞体内主要通过分泌IL-6发挥抑制T细胞功能作用,进而促进肿瘤的生长与肺转移。3.2 TTRAP细胞调节B细胞分化及其对肿瘤生长和转移的研究TTRAP细胞体内可以显着诱导小鼠脾脏细胞中IL-10+B细胞的比例和数量的增加。体外结果显示SN/TTRAP也可以诱导IL-10+B细胞比例和IL-10分泌的显着增加;同时还发现,在体外CD4+T细胞可以显着的提高TRAPs诱导IL-10+B细胞的比例,提示TTRAP细胞和SN/TTRAP可以促进IL-10+B细胞的分化,同时TRAPs和CD4+T细胞在诱导B细胞分化成为IL-10+B细胞过程中具有一定的协同作用。抗体中和实验结果显示,当SN/TTRAP分别用αIL-6、αIL-10或αIL-21预处理后,IL-10+B细胞的比例均显着下降,说明SN/TTRAP中IL-6、IL-10和IL-21是协同增强TRAPs诱导IL-10+B细胞分化的关键细胞因子。OVA特异性T细胞应答小鼠模型中结果显示,SN/TTRAP联合TRAPs诱导的高比例的IL-10+B细胞(BTRAP+SN/TTRAP)体内抑制DC/OVA诱导的OT-I T细胞的增殖和OVA特异性的T细胞的能力显着高于TRAPs单独诱导的IL-10+B细胞(BTRAP)。皮下瘤和肺转移瘤模型也显示,与BTRAP细胞组相比,BTRAP+SN/TTRAP细胞体内可以更显着的促进小鼠B16F10黑色素瘤细胞的生长与肺转移。以上结果进一步证实:TRAPs诱导的CD4+T细胞可以进一步增强TRAPs诱导Breg细胞的生成及其免疫抑制功能。3.3体内抑制TRAP或Il6对CD4+T细胞和B细胞分化及肿瘤生长的研究敲低自噬相关基因Becn1后,Becn1 KD B16F10细胞在饥饿条件下不仅细胞内的自噬水平低于Becn1 NC B16F10细胞,而且细胞外分泌型自噬小体TRAPs的分泌量也显着降低,同时Becn1 KD B16F10细胞体内的生长速度也显着低于Becn1 NC B16F10细胞。另外,Becn1 KD B16F10细胞荷瘤小鼠外周血中的IL-6浓度、淋巴结和肿瘤组织中IL-10+CD4+T细胞、IL-21+CD4+T细胞和IL-10+B细胞的比例显着低于Becn1 NC B16F10组,相反IFN-γ+CD4+T细胞的比例又显着高于Becn1 NC组。提示,靶向B16F10肿瘤细胞的自噬相关基因Becn1可以抑制体内肿瘤的生长,也可以逆转肿瘤微环境中CD4+T细胞和B细胞的分化。在WT和IL-6缺陷的C57BL/6小鼠构建B16F10黑色素瘤模型中,IL-6缺陷小鼠组中的肿瘤大小显着小于WT组,且IL-6缺陷小鼠淋巴结和肿瘤组织中IL-10+CD4+T细胞、IL-21+CD4+T细胞和IL-10+B细胞比例显着降低。推测荷瘤小鼠体内IL-6通过诱导IL-10+CD4+T细胞和IL-21+CD4+T细胞和IL-10+B细胞的分化发挥免疫抑制作用,进而发挥促进肿瘤生长的作用。提示,靶向肿瘤微环境中的IL-6可以逆转CD4+T细胞和B细胞的分化,进而机体的抗肿瘤免疫反应。结论:1.TRAPs体外可以诱导CD4+T细胞分泌IL-6、IL-10和IL-21,抑制CD4+T细胞向Th1细胞亚群分化,且TRAPs诱导获得的IL-21+CD4+T细胞表达Tfh细胞特异性转录因子Bcl-6和膜分子CXCR5。2.TRAPs膜结合型Hsp90α通过TLR2-MyD88-NF-κB信号通路诱导CD4+T细胞分泌IL-6,另外,p38和PI3K/Akt信号通路也参与了其中的调控。3.TRAPs诱导CD4+T细胞自分泌或旁分泌的IL-6又通过IL-6/STAT3通路诱导CD4+T细胞分泌IL-10和IL-21。4.TRAPs诱导的CD4+T细胞通过直接分泌IL-6和IL-10或间接诱导IL-10+Breg细胞发挥抑制T细胞免疫应答,最终促进肿瘤的生长与转移。5.敲低肿瘤细胞自噬相关基因Becn1或敲除小鼠体内Il6基因可以抑制肿瘤生长,也可以抑制IL-10+、IL-21+CD4+T细胞和IL-10+Breg细胞的分化。
郑舒丹[10]（2019）在《GNB2L1对恶性黑色素瘤细胞的增殖和迁移的影响》文中研究指明背景:恶性黑色素瘤（Malignant melanoma,MM）是由黑色素细胞的异常增殖产生的高度恶性肿瘤。近几年来,恶性黑色素瘤的高转移性质一直是其治疗的难点。目前已有很多研究报道GNB2L1作为一种多功能支架蛋白,介导细胞内多条信号通路传导,参与各种肿瘤的发生、增殖、侵袭和迁移等过程。然而,尚未报道GNB2L1对恶性黑色素瘤的多种生物学行为的影响,特别是对恶性黑色素瘤的增殖和迁移。本研究使用GNB2Ll特异序列RNA干扰慢病毒来沉默GNB2Ll蛋白的表达,进而观察GNB2Ll蛋白沉默对小鼠黑色素瘤B16F10细胞增殖和迁移的影响。目的:通过沉默GNB2Ll抑制GNB2Ll表达后,观察小鼠黑色素瘤B16F10细胞的增殖和迁移的变化。深入研究GNB2Ll表达水平对小鼠恶性黑色素瘤B16F10细胞生物学行为的影响,为GNB2L1作为恶性黑色素瘤的临床治疗提供理论依据和指导意义。方法:1.Western blot检测人黑色素瘤A375、A2058细胞和小鼠黑色素瘤B16F10细胞中GNB2L1的表达。2.以小鼠黑色素瘤B16F10细胞为研究对象,设计靶向GNB2L1基因位点的特异序列和无关序列制作GNB2L1干扰慢病毒液和空载体慢病毒液,将其稳定感染小鼠黑色素瘤B16F10细胞,分别获得针对GNB2L1基因位点的B16F10-GNB2L1-shRNA细胞（实验组）和无关序列B16F10-NC细胞（阴性对照组）。采用Western Blot法在蛋白质水平检测B16F10-GNB2L1-shRNA细胞和B16F10-NC细胞中GNB2L1蛋白表达水平,并以未感染的B16F10细胞作空白对照。3.采用Western Blot法检测B16F10-GNB2L1-shRNA细胞和B16F10-NC细胞中N-cadherin和E-cadherin等上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）标志蛋白的表达水平,并以未感染的B16F10细胞作空白对照。4.CCK-8法分别检测B16F10-GNB2L1-shRNA细胞和B16F10-NC细胞的增殖能力,并以未感染的B16F10细胞作空白对照。5.采用划痕实验检测B16F10-GNB2L1-shRNA细胞和B16F10-NC细胞的迁移能力,以未感染的B16F10细胞作空白对照。结果:1.Western Blot法结果显示:GNB2L1蛋白在人黑色素瘤A375、A2058细胞和小鼠黑色素瘤B16F10细胞中均高度表达。2.Western Blot法结果显示:与空白组B16F10和阴性对照组B16F10-NC相比,B16F10-GNB2L1-shRNA细胞中GNB2L1蛋白表达量明显下降（P<0.05）;B16F10-NC细胞GNB2L1蛋白表达量与B16F10细胞相比无明显差异（P>0.05）。3.Western Blot结果显示:与空白组B16F10和阴性对照组B16F10-NC相比,B16F10-GNB2L1-shRNA细胞中E-cadherin蛋白表达量明显增加（P<0.05）,B16F10-NC细胞内E-cadherin蛋白表达量与B16F10细胞相比无明显差异（P>0.05）;与空白组B16F10和阴性对照组B16F10-NC相比,B16F10-GNB2L1-shRNA细胞中N-cadherin蛋白表达量明显下降（P<0.05）,B16F10-NC细胞内N-cadherin蛋白表达量与B16F10细胞相比无明显差异（P>0.05）。4.CCK-8结果显示:与空白组B16F10和阴性对照组B16F10-NC相比,B16F10-GNB2L1-shRNA细胞的增殖活性均降低（P<0.05）;B16F10-NC细胞与B16F10细胞相比增殖活性无明显差异（P>0.05）。5.划痕实验结果显示:与空白组B16F10和阴性对照组B16F10-NC相比,B16F10-GNB2L1-shRNA细胞的迁移能力均降低（P<0.05）;B16F10-NC细胞与B16F10细胞相比迁移能力无明显差异（P>0.05）。结论:1.慢病毒载体介导短发夹RNA（Short hairpin RNA,shRNA）能有效沉默小鼠黑色素细胞瘤B16F10细胞中GNB2Ll蛋白的表达。2.构建B16F10稳定转染B16F10-GNB2L1-shRNA细胞能有效增加E-cadherin蛋白表达量,同时下降N-cadherin蛋白的表达量。3.下调GNB2L1蛋白表达可有效减缓小鼠黑色素细胞瘤B16F10细胞的增殖,降低细胞的迁移能力,证实GNB2L1在调控恶性黑色素细胞瘤的增殖、迁移与上皮间质转化起着重要的作用,GNB2L1有望成为治疗恶性黑色素瘤的有效靶点。
二、Multiple Suppressive Effects of a Protein from Caesalpinia minax on Murine Melanoma Cells（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Multiple Suppressive Effects of a Protein from Caesalpinia minax on Murine Melanoma Cells（论文提纲范文）
（1）紫杉叶素抑制黑色素瘤B16细胞增殖及迁移的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 恶性黑色素瘤 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 晚期黑色素瘤的治疗方法 |
| 1.1.3 恶性黑色素瘤的发生 |
| 1.1.4 MAPK通路在黑色素瘤中异常激活 |
| 1.1.5 Wnt/β-Catenin通路激活在黑色素瘤中与转移和免疫逃逸有关 |
| 1.2 紫杉叶素 |
| 1.2.1 紫杉叶素的毒性 |
| 1.2.2 紫杉叶素抗氧化作用 |
| 1.2.3 紫杉叶素的抗炎作用 |
| 1.2.4 紫杉叶素的抗纤维化反应 |
| 1.2.5 紫杉叶素的抗糖化作用 |
| 1.3 紫杉叶素与肿瘤 |
| 1.3.1 紫杉叶素诱导肿瘤细胞凋亡 |
| 1.3.2 紫杉叶素引起肿瘤细胞周期阻滞 |
| 1.3.3 紫杉叶素诱导细胞分化 |
| 1.3.4 紫杉叶素减轻多药耐药性 |
| 1.4 紫杉叶素治疗肿瘤过程中可能的起效机制 |
| 1.4.1 Nrf2 抗氧化应激通路 |
| 1.4.2 MAPK通路 |
| 1.4.3 Wnt/β-Catenin通路 |
| 1.4.4 TGF-β/Smad通路 |
| 1.4.5 NF-κB通路 |
| 1.4.6 TNF-α和IL-6 |
| 1.4.7 JAK2/Stat3和Notch通路 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞株 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 紫杉叶素工作液配制 |
| 2.2.3 CCK8 细胞活力检测 |
| 2.2.4 细胞生长计数 |
| 2.2.5 EdU细胞增殖检测 |
| 2.2.6 细胞克隆形成实验 |
| 2.2.7 细胞划痕实验 |
| 2.2.8 RNA-seq转录组测序 |
| 2.2.9 KEGG分析 |
| 2.2.10 Western blot检测 |
| 2.2.11 细胞爬片免疫荧光染色 |
| 2.2.12 细胞瞬时转染 |
| 2.2.13 小鼠皮下移植瘤模型的建立 |
| 2.2.14 组织HE染色 |
| 2.2.15 免疫组织化学染色 |
| 2.2.16 组织免疫荧光实验 |
| 2.2.17 统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 紫杉叶素对B16增殖和迁移的影响 |
| 3.1.1 紫杉叶素对B16F10和H9C2细胞活力的影响 |
| 3.1.2 紫杉叶素抑制了B16F10细胞的增殖 |
| 3.1.3 紫杉叶素抑制B16F10细胞迁移 |
| 3.2 紫杉叶素通过MAPK/β-Catenin通路抑制B16F10细胞增殖和迁移 |
| 3.2.1 RNA-seq测序筛查紫杉叶素调控的信号通路 |
| 3.2.2 转录组测序技术KEGG富集分析 |
| 3.2.3 紫杉叶素对MAPK信号通路关键分子ERK表达的影响 |
| 3.2.4 紫杉叶素对MAPK信号通路关键分子p38表达的影响 |
| 3.2.5 紫杉叶素对MAPK信号通路关键分子JNK、Rac1表达的影响 |
| 3.2.6 紫杉叶素抑制Rac1/JNK轴影响β-catenin核定位 |
| 3.2.7 紫杉叶素通过抑制JNK而非ERK抑制β-Catenin入核 |
| 3.2.8 紫杉叶素通过MAPK/β-Catenin通路影响细胞活力 |
| 3.3 紫杉叶素通过抑制USP18调控Rac1/JNK/β-catenin轴 |
| 3.3.1 紫杉叶素在MAPK通路中可能的上游关键靶点 |
| 3.3.2 紫杉叶素对USP18表达的影响以及JNK泛素化的影响 |
| 3.3.3 紫杉叶素通过抑制USP18的表达调控Rac1/JNK/β-catenin轴 |
| 3.4 紫杉叶素对小鼠B16F10移植瘤的影响 |
| 3.4.1 紫杉叶素对小鼠体重以及肿瘤体积的影响 |
| 3.4.2 HE染色观察紫杉叶素对小鼠脏器的影响 |
| 3.4.3 紫杉叶素对荷瘤小鼠黑色素瘤组织ERK及其下游蛋白表达的影响 |
| 3.4.4 紫杉叶素对荷瘤小鼠黑色素瘤组织Rac1/JNK/β-Catenin相关蛋白表达的影响 |
| 3.4.5 免疫荧光染色观察紫杉叶素对β-Catenin入核的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 项目资助 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）杜鹃素衍生物HDF小鼠模型抗肿瘤活性和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表(Abbreviations) |
| 第一章 前言 |
| 1.1 肿瘤发病概况与治疗现状 |
| 1.1.1 肿瘤发病概况 |
| 1.1.2 肿瘤治疗现状 |
| 1.1.3 肿瘤的化疗 |
| 1.1.4 化疗的副作用 |
| 1.1.5 肿瘤的多重耐药性(Multidrug resistance,MDR) |
| 1.2 黄酮类化合物及其抗肿瘤作用 |
| 1.2.1 黄酮类化合物 |
| 1.2.2 黄酮类化合物的抗肿瘤活性 |
| 1.3 杜鹃素及其活性 |
| 1.3.1 杜鹃素的来源 |
| 1.3.2 杜鹃素的生物活性 |
| 1.4 HDF及现有研究基础 |
| 1.4.1 HDF的来源和结构 |
| 1.4.2 HDF现有研究 |
| 1.5 理论依据和研究意义 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要实验试剂 |
| 2.3 主要实验仪器 |
| 2.4 实验方法和步骤 |
| 2.4.1 细胞培养 |
| 2.4.2 动物模型建立 |
| 2.4.3 实验动物分组以及处理 |
| 2.4.4 小鼠体征观测以及组织获取 |
| 2.4.5 小鼠血清生化指标检测 |
| 2.4.6 石蜡切片制作 |
| 2.4.7 苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining) |
| 2.4.8 免疫组织化学(Immunohistochemistry) |
| 2.4.9 TUNEL检测 |
| 2.4.10 细胞蛋白提取 |
| 2.4.11 免疫印迹实验(Western-Blotting Assay) |
| 2.4.12 质谱样品制备 |
| 2.4.13 细胞总RNA提取 |
| 2.4.14 反转录和q-PCR |
| 2.4.15 数据分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 HDF小鼠模型抗肿瘤活性 |
| 3.1.1 HDF抑制小鼠黑色素瘤生长 |
| 3.1.2 HDF对小鼠体征的影响 |
| 3.2 HDF小鼠模型抗肿瘤相关机制 |
| 3.2.1 HDF在小鼠体内抑制肿瘤细胞增殖 |
| 3.2.2 HDF在小鼠体内诱导肿瘤细胞凋亡 |
| 3.2.3 HDF在小鼠体内调控Bax/Bcl-2 信号表达 |
| 3.2.4 HDF抑制小鼠黑色素瘤血管生成 |
| 3.2.5 HDF抑制小鼠体内黑色素瘤的腹腔转移 |
| 3.3 HDF在小鼠体内毒理作用研究 |
| 3.3.1 HDF对小鼠脏器系数未见显着影响 |
| 3.3.2 HDF对小鼠血清生化指标的影响 |
| 3.3.3 HDF对小鼠主要器官组织病理学影响 |
| 3.4 细胞模型验证HDF促凋亡机制 |
| 3.4.1 蛋白组学研究HDF对 HeLa细胞蛋白质表达影响 |
| 3.4.2 HDF可通过NF-κB/Bcl-2 信号通路促进HeLa细胞凋亡 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 HDF的抗肿瘤活性 |
| 4.2 HDF的毒性 |
| 4.3 HDF研究展望 |
| 4.4 HDF作为临床药物的研发潜力 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 文章缩略词表 |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 TGF-β的概述 |
| 1.1.1 TGF-β的来源 |
| 1.1.2 TGF-β的表达 |
| 1.1.3 TGF-β的结构 |
| 1.1.4 TGF-β的信号通路 |
| 1.2 TGF-β的生物学活性 |
| 1.2.1 TGF-β对胚胎发育的调节 |
| 1.2.2 TGF-β对免疫应答的负向调节 |
| 1.2.3 TGF-β2对肿瘤的生长,侵袭及迁移的促进作用 |
| 1.2.4 TGF-β对组织损伤修复、创面愈合、瘢痕增生的促进作用及炎症反应的抑制作用 |
| 1.2.5 TGF-β2对纤维化的调节作用 |
| 1.2.6 TGF-β对肿瘤的抑制作用 |
| 1.3 靶向TGF-β2的药物 |
| 1.3.1 TGF-β2的反义寡核苷酸 |
| 1.3.2 TGF-β2的micro RNA |
| 1.3.3 TGF-β2的sh RNA |
| 1.3.4 TGF-β2的抗体 |
| 1.3.5 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.6 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.7 TGF-β2的抑制剂 |
| 1.4 疫苗佐剂的概述及其研究进展 |
| 1.4.1 增强第一信号的佐剂 |
| 1.4.2 增强第二信号的佐剂 |
| 1.4.3 增强第三信号的佐剂 |
| 1.4.4 抑制T细胞抑制信号的佐剂 |
| 1.4.5 改善肿瘤免疫抑制微环境的佐剂 |
| 1.4.6 病毒载体佐剂 |
| 1.4.7 其他佐剂 |
| 1.4.8 多佐剂肿瘤疫苗 |
| 1.4.9 佐剂的接种途径 |
| 1.4.10 佐剂发挥作用的机制 |
| 1.5 RNA靶向性寡核苷酸的研究进展 |
| 1.5.1 反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide) |
| 1.5.2 siRNA |
| 1.5.3 micro RNA |
| 1.5.4 反义寡核苷酸的化学修饰方法 |
| 第2章 材料方法 |
| 2.1 ODN及引物 |
| 2.2 实验试剂,仪器与耗材 |
| 2.3 细胞与细胞系 |
| 2.4 实验动物 |
| 2.5 IAV的扩增 |
| 2.6 IAV TCID50 的测定 |
| 2.7 IAV血凝效价的测定 |
| 2.8 聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.9 小鼠PBMC、脾脏及淋巴结单细胞悬液的制备 |
| 2.10 TIO对 TGF-β2 m RNA表达的抑制实验 |
| 2.11 流式细胞术(Flow cytometry) |
| 2.12 蛋白免疫印迹实验(Western Blotting analysis) |
| 2.13 免疫荧光技术 |
| 2.14 TIO在小鼠器官和组织中的分布检测 |
| 2.15 小鼠的免疫 |
| 2.15.1 疫苗的制备 |
| 2.15.2 小鼠的免疫和血清的收集 |
| 2.16 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.17 流感病毒攻毒实验 |
| 2.18 小鼠肺组织的病理学观察 |
| 2.19 脑胶质瘤细胞裂解物(TCL)的制备 |
| 2.20 GL261脑胶质瘤原位模型的建立 |
| 2.21 脑胶质瘤预防模型的建立 |
| 2.22 脑胶质瘤治疗模型的建立 |
| 2.23 肿瘤周围浸润的炎性细胞的检测 |
| 2.24 肿瘤组织病理分析 |
| 2.25 胃癌背部移植瘤模型的建立 |
| 2.26 统计学分析 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 靶向TGF-β2的反义寡核苷酸的设计与筛选 |
| 3.2 TIOs对 RAW264.7 细胞,U-937 细胞及CAL-1 细胞表达TGF-β2的影响 |
| 3.2.1 TIOs对 IL-4 诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 m RNA表达的影响 |
| 3.2.2 TIOs对 IL-4诱导的RAW264.7细胞Arg1及TNF-αmRNA表达的影响 |
| 3.2.3 TIOs对 LPS诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 mRNA表达的影响 |
| 3.2.4 TIOs对 LPS诱导的U-937 细胞表达TGF-β2 mRNA的影响 |
| 3.2.5 TIOs对甲型流感病毒(IAV)诱导的CAL-1 细胞TGF-β2mRNA表达的影响 |
| 3.2.6 TIOs对 IL-4/LPS诱导的RAW264.7/U-937细胞表达TGF-β2蛋白的影响 |
| 3.3 TIO3在细胞和组织中的分布 |
| 3.4 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 3.4.1 TIOs对微生物疫苗诱导的抗体产生水平的影响 |
| 3.4.2 TIO3对流感病毒疫苗诱导的抗流感病毒效率的增强作用 |
| 3.4.3 TIO1和TIO3 的微生物疫苗佐剂效应的可能机制 |
| 3.4.4 TIOs的微生物疫苗佐剂的安全性评价 |
| 3.5 TIO的胶质瘤疫苗的佐剂作用 |
| 3.5.1 TIOs为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗对原位接种脑胶质瘤预防模型小鼠的影响 |
| 3.5.2 TIOs为佐剂的胶质瘤疫苗对原位接种胶质瘤治疗模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6 单独应用TIO3的抗胶质瘤及抗胃癌作用 |
| 3.6.1 单独应用TIO3对脑胶质瘤原位移植瘤模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6.2 单独应用TIO3对胃癌背部移植瘤模型小鼠体重、肿瘤大小及生存期的影响 |
| 3.6.3 单独应用TIO3对胃癌细胞腹腔种植模型小鼠生存期的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 4.1.1 TIO3对CD4~+T细胞表面s TGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.2 TIO3 对 CD19~+ B 细胞表面 sTGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.3 TIO3的药效动力学分析 |
| 4.1.4 TIO1,TIO2及TIO3 的不同功效的机理分析 |
| 4.1.5 TIO3用于微生物疫苗佐剂的副作用分析 |
| 4.1.6 TIO3用于微生物疫苗佐剂的可行性分析 |
| 4.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应 |
| 4.2.1 TIO3 对胶质瘤细胞MHC I分子表达的上调作用 |
| 4.2.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应的机理分析 |
| 4.3 单独应用TIO3的抗胶质瘤和抗胃癌作用 |
| 4.4 总结和展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 附录2 The College of Basic Medical Sciences of Jilin University Ethics Committee Approval Form |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）三株真菌和云实活性天然产物研究及Terrein生物合成研究（论文提纲范文）
| Abbreviation |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 附图 |
| 第一章 三株曲霉属真菌化学成分及生物活性研究 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 结果与讨论 |
| 1.2.1 新化合物结构鉴定 |
| 1.2.1.1 聚酮二聚体新骨架化合物结构鉴定 |
| 1.2.1.2 吡啶酮新结构化合物结构鉴定 |
| 1.2.1.3 杂萜新化合物结构鉴定 |
| 1.2.1.4 聚酮新化合物结构鉴定 |
| 1.2.1.5 环丁内酯新化合物结构鉴定 |
| 1.2.2 化合物生物学活性筛选结果 |
| 1.2.2.1 免疫抑制活性 |
| 1.2.2.2 BACE1抑制活性 |
| 1.2.2.3 抗MRSA活性 |
| 1.2.2.4 降糖活性 |
| 1.2.2.5 抗肿瘤活性 |
| 1.3 实验部分 |
| 1.3.1 实验仪器与材料 |
| 1.3.2 实验菌株信息 |
| 1.3.3 发酵培养及提取分离 |
| 1.3.4 免疫抑制活性筛选 |
| 1.3.5 抗MRSA活性筛选 |
| 1.3.6 降糖活性实验 |
| 1.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 云实化学成分及生物活性研究 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 新化合物结构鉴定 |
| 2.2.2 化合物的抗肿瘤和免疫抑制活性筛选结果 |
| 2.2.3 化合物抗菌活性筛选结果 |
| 2.3 实验部分 |
| 2.3.1 实验仪器与材料 |
| 2.3.2 植物药材来源 |
| 2.3.3 药材浸泡及提取分离 |
| 2.3.4 化合物抑制肿瘤细胞生长活性筛选实验 |
| 2.3.5 化合物抗菌活性筛选实验 |
| 2.3.6 化合物免疫抑制活性筛选实验 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 TERREIN生物合成研究 |
| 3.0 概述 |
| 3.1 结果与讨论 |
| 3.1.1 土曲霉鉴定、发酵培养及Terrein鉴定 |
| 3.1.2 Terrein生物合成基因簇鉴定 |
| 3.1.3 Terrein生物合成途径推导 |
| 3.1.4 异源表达及遗传敲除确定基因功能 |
| 3.1.4.1 构巢曲霉A.nidulans LO8030异源表达terAB产生2 |
| 3.1.4.2 构巢曲霉LO8030异源表达terABD产生3 |
| 3.1.4.3 核心PKS基因terA敲除确定基因功能 |
| 3.1.4.4 化学回补2修复Terrein产生 |
| 3.1.4.5 功能基因terC敲除 |
| 3.1.4.6 LO8030异源表达terABC |
| 3.1.4.7 LO8030异源表达terABCDEFHI |
| 3.1.4.8 BJ5464异源表达terABC |
| 3.1.5 体外生化验证基因功能 |
| 3.1.5.1 功能蛋白纯化 |
| 3.1.5.2 体外酶反应 |
| 3.2 小结 |
| 3.3 实验部分 |
| 3.3.1 实验仪器与材料 |
| 3.3.1.1 质粒 |
| 3.3.1.2 菌株 |
| 3.3.1.3 引物 |
| 3.3.1.4 培养基及相应营养素 |
| 3.3.1.5 缓冲盐及酶反应体系 |
| 3.3.1.6 本实验所用抗生素 |
| 3.3.1.7 实验试剂 |
| 3.3.1.8 实验仪器 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.3.2.1 土曲霉gDNA提取方法 |
| 3.3.2.2 PCR扩增目的基因片段 |
| 3.3.3 土曲霉鉴定 |
| 3.3.4 Terrein生物合成基因cDNA获取 |
| 3.3.5 质粒构建 |
| 3.3.5.1 酵母同源重组 |
| 3.3.5.1.1 S. cerevisiae感受态制备 |
| 3.3.5.1.2 S. cerevisiae感受态转化 |
| 3.3.6 异源表达 |
| 3.3.6.1 S. cerevisiae异源表达 |
| 3.3.6.2 A. nidulans异源表达 |
| 3.3.6.2.1 A. nidulans原生质体制备 |
| 3.3.6.2.2 A. nidulans原生质体转化 |
| 3.3.7 Escherichia coli感受态制备 |
| 3.3.8 A. terreus基因敲除 |
| 3.3.8.1 A. terreus原生质体制备 |
| 3.3.8.2 A. terreus原生质体转化及转化子筛选 |
| 3.3.8.3 A. terreus转化子验证 |
| 3.3.8.3.1 PCR验证 |
| 3.3.8.3.2 发酵验证 |
| 3.3.9 蛋白纯化 |
| 3.3.10 化合物2化学开环及化学衍生 |
| 参考文献 |
| 第四章 TERREIN研究进展 |
| 4.1 概述 |
| 4.2 TERREIN结构鉴定 |
| 4.3 TERREIN生物学活性 |
| 4.4 TERREIN生物合成 |
| 4.5 TERREIN化学合成 |
| 4.6 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 攻读博士期间发表论文及专利 |
| 攻读博士期间所获荣誉 |
| 致谢 |
| 附录 |
| FIGURE S1. HRESIMS SPECTRUM OF 1 |
| FIGURE S2. UV SPECTRUM OF 1 |
| FIGURE S3. IR SPECTRUM OF 1 |
| FIGURE S4. ~1H NMR SPECTRUM OF 1 RECORD IN 400 MHz(MEOH-D4) |
| FIGURE S5. ~(13)C NMR AND DEPT SPECTRA OF 1 RECORD IN 100 MHz(MEOH-D_4) |
| FIGURE S6. HSQC SPECTRUM OF 1 RECORD IN 400 MHz (MEOH-D4) |
| FIGURE S7. HMBC SPECTRUM OF 1 RECORD IN 400 MHZ(MEOH-D_4) |
| FIGURE S8. ~1H-~1H COSY SPECTRUM OF 1 RECORD IN 400 MHZ(MEOH-D4) |
| FIGURE S9. NOESY SPECTRUM OF 1 RECORD IN 400 MHZ(MEOH-D_4) |
| FIGURE S10. ~1H NMR SPECTRUM OF 1 RECORD IN 600 MHZ(DMSO-D_6) |
| FIGURE S11. ~(13)C NMR AND DEPT SPECTRA OF 1 RECORD IN 150 MHZ(DMS O-D_6) |
| FIGURE S12. HSQC SPECTRUM OF 1 RECORD IN 600 MHZ (DMSO-D_6) |
| FIGURE S13. HMBC SPECTRUM OF 1 RECORD IN 600 MHZ(DMSO-D_6) |
| FIGURE S14. ~1H-~1H COSY SPECTRUM OF 1 RECORD IN 600 MHZ(DMSO-D_6) |
| FIGURE S15. NOESY SPECTRUM OF 1 RECORD IN 600 MHZ(DMS O-D_6) |
| FIGURE S16. ~1H NMR SPECTRUM OF QYB-2 RECORD IN 500 MHz (D_2O) |
| FIGURE S 17. ~(13)C NMR SPECTRUM OF QYB-2 RECORD IN 500 MHz (D_2O) |
（5）短肽自组装纳米材料的构建及其生物分析应用（论文提纲范文）
| 论文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 短肽及其自组装的概述 |
| 1.1 短肽的简介 |
| 1.2 短肽的自组装 |
| 1.3 LVFF短肽的简介及应用 |
| 1.4 短肽自组装的构建及在生物分析中的发展趋势 |
| 2 AD与恶性肿瘤的简介 |
| 2.1 恶性肿瘤与唾液酸 |
| 2.2 AD及相关生物分子 |
| 2.3 AD与恶性肿瘤的诊疗研究进展 |
| 3 本论文的研究目的、研究内容与创新点 |
| 3.1 研究目的 |
| 3.2 研究内容 |
| 3.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 第二章 唾液酸靶向的仿生多价肽纳米管用于转移性黑色素瘤的成像及联合治疗 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 试剂与材料 |
| 2.2 仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 短肽的自组装及其与小分子的共组装 |
| 3.2 PPNT的制备与表征 |
| 3.3 PPNT与唾液酸之间的相互作用 |
| 3.4 I-PPNT的制备与表征 |
| 3.5 I-PPNT的细胞摄取 |
| 3.6 I-PPNT的活性氧及在细胞内的光动力活性 |
| 3.7 I-PPNT光照后的细胞毒性 |
| 3.8 I/S-PPNT中ICG与SN38的共定位 |
| 3.9 I/S-PPNT的药物释放率及细胞毒性 |
| 3.10 I-PPNT的原位肿瘤靶向性 |
| 3.11 I-PPNT在肿瘤的渗透 |
| 3.12 I/S-PPNT在肿瘤内的光动力活性 |
| 3.13 I/S-PPNT在体内的原位瘤抑制效果 |
| 3.14 I/S-PPNT在体内的肿瘤肺转移抑制效果 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 糖肽纳米纤维用于Aβ-唾液酸相互作用分析及Aβ高灵敏度检测 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 试剂与材料 |
| 2.2 仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 糖肽的设计合成与表征 |
| 3.2 糖肽的自组装与表征 |
| 3.3 唾液酸与不同Aβ片段的相互作用 |
| 3.4 荧光“Turn-on”法对Aβ_(1-40)单体的检测 |
| 3.5 选择性实验 |
| 3.6 Aβ_(1-40)与唾液酸相互作用机制研究 |
| 3.7 生物样品中Aβ_(1-40)的检测 |
| 3.8 Aβ聚集的监测与抑制剂筛选 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 自组装多功能肽对生物金属离子的比率型成像 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 试剂与材料 |
| 2.2 仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 SA-AQZ与AQZKL-7的合成与表征 |
| 3.2 AQZ的接枝率 |
| 3.3 AQZKL-7与KL-7的共组装及表征 |
| 3.4 QDs@AQZ@NR的制备与表征 |
| 3.5 Al@QDs@AQZ@NR的制备与表征 |
| 3.6 Al@QDs@AQZ@NR对 Zn~(2+)、Cu~(2+)的响应性能评估 |
| 3.7 Al@QDs@AQZ@NR的稳定性及对Zn~(2+)、Cu~(2+)的选择性 |
| 3.8 Al@QDs@AQZ@NR对细胞外源性Zn~(2+)、Cu~(2+)的比率型成像 |
| 3.9 Al@QDs@AQZ@NR对 NO刺激细胞释放Zn~(2+)、Cu~(2+)的成像 |
| 3.10 Al@QDs@AQZ@NR对细胞外源性Zn~(2+)、Cu~(2+)的检测限 |
| 3.11 Al@QDs@AQZ@NR对斑马鱼中Zn~(2+)、Cu~(2+)的成像 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 多功能肽组装胶束用于Aβ沉积与活性氧的同时清除研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 试剂与材料 |
| 2.2 仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 tk-GSH的合成与表征 |
| 3.2 PLT的合成与表征 |
| 3.3 PGLT的合成与表征 |
| 3.4 多功能肽组装胶束的制备与表征 |
| 3.5 MPLT、MPGLT抑制Aβ的聚集 |
| 3.6 MPGLT清除活性氧 |
| 3.7 MPLT、MPGLT的生物相容性 |
| 3.8 MPLT体外诱导自噬的研究 |
| 3.9 MPGLT-IR780 的制备及细胞摄取 |
| 3.10 MPLT、MPGLT降低Aβ_(1-42)与ROS诱导的细胞毒性 |
| 3.11 MPGLT降低Aβ+Cu~(2+)诱导的细胞毒性 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结与展望 |
| 附录:攻读博士学位期间科研成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）基于S1P/S1PR1/STAT3信号通路的白藜芦醇抗小鼠黑色素瘤细胞B16F10侵袭转移的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 肿瘤微环境 |
| 1.2 S1P/S1PR1/STAT3 |
| 1.3 白藜芦醇 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 白藜芦醇对肿瘤微环境下小鼠黑色素瘤细胞B16F10侵袭转移的抑制作用 |
| 3.2 通过体内模型研究白藜芦醇基于肿瘤微环境对小鼠黑色素瘤细胞B16F10侵袭转移的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 中英符号对照表 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（7）mTOR和PRAK抑制剂的抗肿瘤转移作用（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语 |
| 第一章 mTOR抑制剂雷帕霉素对小鼠黑色素瘤肝转移的影响 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 第二章 不同给药方式对PRAK抑制剂 ZP-0353抗肿瘤转移作用的影响 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| ·本研究创新性的自我评价· |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 一、文献综述 mTOR抑制剂雷帕霉素的抗肿瘤作用 |
| 参考文献 |
| 二、在学期间科研成绩 |
| 三、致谢 |
| 四、个人简介 |
（8）表达RGD和MEL基因重组减毒沙门氏菌的构建及其对黑色素瘤的靶向治疗作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 减毒沙门氏菌在肿瘤基因治疗中的研究进展 |
| 1.1.1 细菌治疗肿瘤的研究背景 |
| 1.1.2 沙门氏菌载体在肿瘤治疗中的研究现状和问题 |
| 1.1.2.1 沙门氏菌载体在肿瘤治疗中的研究现状 |
| 1.1.2.2 沙门氏菌载体在肿瘤治疗中的问题 |
| 1.2 肿瘤靶向肽在肿瘤治疗中的作用机制和研究进展 |
| 1.2.1 RGD靶向肿瘤的作用机制 |
| 1.2.2 RGD治疗肿瘤的研究进展 |
| 1.3 蜂毒肽的抑瘤机制及研究进展 |
| 1.3.1 蜂毒肽作为药物的研究背景 |
| 1.3.2 蜂毒肽的抑瘤活性及存在问题 |
| 1.4 研究方案 |
| 1.4.1 技术路线 |
| 1.4.2 研究内容和意义 |
| 第二章 表达RGD及MEL双基因减毒沙门氏菌的制备 |
| 第一节 表达RGD及MEL双基因真核表达质粒的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 菌株、细胞系和载体 |
| 2.1.1.2 试剂 |
| 2.1.1.3 主要仪器 |
| 2.1.1.4 溶液和培养基 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.1.2.2 引物设计 |
| 2.1.2.3 重组质粒p MD-RGD-MEL和pMD-MEL的提取 |
| 2.1.2.4 pEGFP-N1和p MD-RGD-MEL、pMD-MEL的双酶切 |
| 2.1.2.5 产物回收 |
| 2.1.2.6 质粒的制备与鉴定 |
| 2.1.2.7 重组质粒图谱 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RGD-MEL及MEL基因扩增 |
| 2.2.2 pEGFP-RGD-MEL重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2.3 pEGFP-MEL重组表达质粒的鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第二节 重组减毒沙门氏菌LH430/pEGFP-RGD-MEL的制备及稳定性检测 |
| 2.5 材料与方法 |
| 2.5.1 材料 |
| 2.5.1.1 菌株、细胞系和载体 |
| 2.5.1.2 主要试剂 |
| 2.5.1.3 主要仪器 |
| 2.5.2 方法 |
| 2.5.2.1 重组减毒沙门氏菌LH430感受态细胞的制备 |
| 2.5.2.2 重组减毒沙门氏菌的构建与鉴定 |
| 2.5.2.3 重组减毒沙门氏菌遗传稳定性鉴定 |
| 2.5.2.4 全自动生长曲线分析仪记录LH430/pEGFP-RGD-MEL生长曲线 |
| 2.5.2.5 B16细胞的培养 |
| 2.5.2.6 重组减毒沙门氏菌侵染B16细胞 |
| 2.5.2.7 重组减毒沙门氏菌侵染B16细胞总RNA的提取 |
| 2.5.2.8 RT-PCR检测目的基因RGD-MEL和MEL的表达 |
| 2.5.2.9 Western blotting检测 |
| 2.6 结果与分析 |
| 2.6.1 重组减毒沙门氏菌的制备与鉴定 |
| 2.6.2 重组减毒沙门氏菌的稳定性 |
| 2.6.3 重组减毒沙门氏菌生长曲线的测定 |
| 2.6.4 重组减毒沙门氏菌侵染B16细胞检测结果 |
| 2.6.5 RT-PCR检测目的基因表达 |
| 2.6.6 Western Blotting检测蛋白表达结果 |
| 2.7 讨论 |
| 2.8 小结 |
| 第三章 LH430/pEGFP-RGD-MEL的体外抑瘤作用的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 菌株、细胞系和载体 |
| 3.1.1.2 主要试剂 |
| 3.1.1.3 主要仪器 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 细胞培养 |
| 3.1.2.2 LH430/pEGFP-RGD-MEL侵染细胞 |
| 3.1.2.3 CCK-8 法检测LH430/pEGFP-RGD-MEL对细胞增殖作用的影响 |
| 3.1.2.4 Western blotting检测B16细胞中凋亡蛋白 |
| 3.1.2.5 扫描电镜观察 |
| 3.1.2.6 流式细胞术检测B16细胞凋亡情况 |
| 3.1.2.7 细胞划痕试验检测B16细胞迁移能力 |
| 3.1.2.8 细胞趋化试验检测FBS介导B16细胞的迁移能力 |
| 3.1.2.9 细胞侵袭试验检测B16细胞的侵袭能力 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 LH430/pEGFP-RGD-MEL抑制肿瘤细胞及正常细胞增殖作用的测定 |
| 3.2.2 LH430/pEGFP-RGD-MEL对肿瘤细胞及正常细胞的IC50值 |
| 3.2.3 LH430/pEGFP-RGD-MEL侵染B16细胞中凋亡蛋白的表达 |
| 3.2.4 扫描电镜观察LH430/pEGFP-RGD-MEL侵染B16细胞表面形态变化 |
| 3.2.5 LH430/pEGFP-RGD-MEL对B16细胞的凋亡作用 |
| 3.2.6 LH430/pEGFP-RGD-MEL抑制B16细胞迁移情况 |
| 3.2.7 LH430/pEGFP-RGD-MEL可抑制FBS介导的B16细胞迁移 |
| 3.2.8 LH430/pEGFP-RGD-MEL可抑制B16细胞的侵袭能力 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 小鼠黑色素瘤模型的构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 细胞系和试验动物 |
| 4.1.1.2 主要试剂 |
| 4.1.1.3 主要仪器 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 B16实体瘤模型的建立与荷瘤小鼠的治疗 |
| 4.1.2.2 荷瘤小鼠活体成像 |
| 4.1.2.3 Q-PCR检测RGD-MEL基因在各组织中的表达 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 荷瘤小鼠生存曲线及体重变化曲线 |
| 4.2.2 LH430/pEGFP-RGD-MEL对荷瘤小鼠内脏器官及肿瘤重量的影响 |
| 4.2.3 小鼠活体成像结果 |
| 4.2.4 Q-PCR检测各组织MEL基因表达量 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 小鼠黑色素瘤模型的病理学检测 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 试验组织 |
| 5.1.1.2 主要试剂 |
| 5.1.1.3 主要仪器 |
| 5.1.1.4 试验试剂 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 冰冻切片的制备 |
| 5.1.2.2 病理切片的制备及HE染色 |
| 5.1.2.3 免疫组织化学染色 |
| 5.1.2.4 TUNEL法染色 |
| 5.1.2.5 肿瘤组织细菌计数 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 肿瘤组织冰冻切片结果 |
| 5.2.2 各组织HE染色结果 |
| 5.2.3 各肿瘤组织免疫组织化学染色结果 |
| 5.2.4 TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡状况 |
| 5.2.5 肿瘤组织中细菌残留状况 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 RNA-seq研究LH430/pEGFP-RGD-MEL抑瘤机理 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.1.1 试验组织 |
| 6.1.1.2 主要试剂 |
| 6.1.1.3 主要仪器 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.1.2.1 肿瘤组织中RNA提取 |
| 6.1.2.2 RNA质量检测 |
| 6.1.2.3 RNA文库构建 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 测序组装结果统计 |
| 6.2.2 差异基因富集功能分析 |
| 6.2.3 差异基因的KEGG代谢通路结果分析 |
| 6.2.4 深入分析结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录一 序列信息 |
| 附录二 测序报告 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）诱导CD4+T细胞分化及其免疫调节功能的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词中英文对照表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述1 CD4~+T 细胞亚群分化机制及其在肿瘤中的研究进展 |
| 综述2 细胞外囊泡与肿瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第一章 肿瘤细胞释放自噬小体(TRAP)对CD4~+T细胞分化的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论(一) |
| 第二章 TRAP诱导CD4~+T细胞分泌IL-6/IL-10/IL-21 的机制探讨 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论(二) |
| 第三章 肿瘤细胞释放自噬小体(TRAP)诱导的CD4~+T细胞免疫调节功能及其抗肿瘤作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论(三) |
| 全文总结 |
| 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）GNB2L1对恶性黑色素瘤细胞的增殖和迁移的影响（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 RACK1与肿瘤细胞的侵袭和转移关系研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 附录 (攻读学位期间发表论文) |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、Multiple Suppressive Effects of a Protein from Caesalpinia minax on Murine Melanoma Cells（论文参考文献）
- [1]紫杉叶素抑制黑色素瘤B16细胞增殖及迁移的分子机制研究[D]. 张胜男. 吉林大学, 2021
- [2]杜鹃素衍生物HDF小鼠模型抗肿瘤活性和机制研究[D]. 杨沐霖. 兰州大学, 2021(09)
- [3]转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用[D]. 涂丽裙. 吉林大学, 2020(03)
- [4]三株真菌和云实活性天然产物研究及Terrein生物合成研究[D]. 乔玉本. 华中科技大学, 2020(02)
- [5]短肽自组装纳米材料的构建及其生物分析应用[D]. 雷莉. 华东师范大学, 2020(12)
- [6]基于S1P/S1PR1/STAT3信号通路的白藜芦醇抗小鼠黑色素瘤细胞B16F10侵袭转移的作用[D]. 梁敬. 曲阜师范大学, 2020(01)
- [7]mTOR和PRAK抑制剂的抗肿瘤转移作用[D]. 周加宁. 锦州医科大学, 2020(05)
- [8]表达RGD和MEL基因重组减毒沙门氏菌的构建及其对黑色素瘤的靶向治疗作用[D]. 李昕. 天津农学院, 2019(07)
- [9]肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）诱导CD4+T细胞分化及其免疫调节功能的机制研究[D]. 陈永强. 东南大学, 2019(05)
- [10]GNB2L1对恶性黑色素瘤细胞的增殖和迁移的影响[D]. 郑舒丹. 海南医学院, 2019(01)